0124 nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng chất đánh dấu trong lá cây sầu đâu ăn lá azadirachta indica

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ BÙI THANH NGÂN TẠO NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG LÁ CÂY SẦU ĐÂU ĂN LÁ AZADIRACHTA INDICA LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP I CẦN THƠ – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ BÙI THANH NGÂN TẠO NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG LÁ CÂY SẦU ĐÂU ĂN LÁ AZADIRACHTA INDICA Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 60.72.04.10.CK LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP I Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.DS Nguyễn Thị Ngọc Vân CẦN THƠ - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn đảm bảo tính trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Cần Thơ, ngày 26 tháng 10 năm 2018 Bùi Thanh Ngân Tạo LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS.DS Nguyễn Thị Ngọc Vân thời gian qua tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, động viên, khích lệ tinh thần hướng dẫn giải vấn đề gặp phải q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô anh chị Liên mơn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc chất, Liên Bộ môn Dược liệu Dược cổ truyền – Thực vật tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập thực luận văn mơn Để hồn thành tốt luận văn này, không kể đến anh chị em làm luận văn lớp CKI Cao học Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất, em sinh viên Dược K38, Dược K39 Cảm ơn anh chị em quan tâm, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn, thử thách hồn thành nghiên cứu MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng, hình vẽ, đồ thị, sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây sầu đâu 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm sầu đâu 1.1.3 Bộ phận dùng, nơi sống, thu hái chế biến 1.2 Lá sầu đâu 1.2.1 Thành phần hóa học 1.2.2 Tác dụng sinh học sầu đâu 12 1.3 Vai trò cuả chất đánh dấu kiểm soát chất lượng dược liệu 13 1.3.1 Định nghĩa chất đánh dấu 13 1.3.2 Vai trò chất đánh dấu 13 1.4 Các phương pháp chiết xuất thường sử dụng dược liệu 13 1.4.1 Định nghĩa hòa tan chiết xuất 13 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình hịa tan chiết xuất 14 1.4.3 Các phương pháp chiết xuất dược liệu [1],[2] 14 1.4.4 Một số phương pháp công bố chiết xuất hoạt chất sầu đâu 17 1.5 Tổng quan chất đánh dấu rutin sầu đâu 18 1.5.1 Tính chất vật lý 18 1.5.2 Các phương pháp định lượng rutin dược liệu 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 23 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ: 23 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu: 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm 23 2.2.2 Cỡ mẫu: 23 2.2.3 Phương pháp chọn mẫu: 24 2.2.4 Nội dung nghiên cứu: 24 CHƢƠNG K T QUẢ 35 3.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất chất đánh dấu rutin sầu đâu 35 3.1.1 Điều kiện sắc ký 35 3.1.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất rutin sầu đâu 37 3.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng chất đánh dấu rutin dịch chiết sầu đâu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 42 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 42 3.2.2 Tính đặc hiệu 43 3.2.3 Tính tuyến tính, miền giá trị 46 3.2.4 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 47 3.2.5 Độ xác 49 3.2.6 Độ 50 CHƢƠNG BÀN LUẬN 52 4.1 Điều kiện chiết xuất chất đánh dấu rutin sầu đâu 52 4.2.Thẩm định quy trình định lượng rutin phương pháp HPLC 59 K T LUẬN 66 KI N NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VI T TẮT STT Chữ tắt, ký hiệu AOAC Chữ nguyên Ý nghĩa Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế As Asymmetry Hệ số bất đối EtOAc Ethyl acetat HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao ICH International conference harmonisation Hiệp hội đồng thuận quốc tế International Union of Pure and Applied Chemistry Tên quốc tế IUPAC LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng PDA Photo Diode Array Đầu dò dãy diod quang 10 Rs Resolution Độ phân giải 11 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối 12 SKĐ Sắc ký đồ 13 tR 14 UV-vis Retention time Thời gian lưu pic Ultravilet-Visible Tử ngoại – Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 1.2 1.3 Tên bảng Một số phương pháp chiết xuất dùng nghiên cứu đối tượng sầu đâu Một số nghiên cứu định lượng rutin số dược liệu khác Một số nghiên cứu nước giới sầu đâu Trang 18 20 21 2.1 Chất chuẩn – Hóa chất – Thuốc thử 24 2.2 Trang thiết bị 25 2.3 T lệ pha động khảo sát 26 2.4 Khảo sát dung môi chiết 27 2.5 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 28 2.6 Khảo sát thời gian chiết 28 2.7 Khảo sát nhiệt độ chiết 29 2.8 Khảo sát số lần chiết 29 2.9 Khảo sát tính tuyến tính miền giá giá trị rutin 32 3.1 Các thông số sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử rutin với điều kiện pha động khảo sát bước sóng 254nm 37 3.2 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn rutin mẫu thử (n=6) 42 3.3 Độ tinh khiết mẫu chuẩn mẫu thử rutin 44 3.4 Kết phân tích tính tuyến tính 46 3.5 Kết khảo sát LOD, LOQ rutin 47 3.6 Kết khảo sát độ xác ngày (n = 6) 49 3.7 Kết độ xác liên ngày phương pháp 50 3.8 Kết thẩm định độ quy trình định lượng rutin dịch chiết sầu đâu (n=9) 50 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Tên đồ thị Đồ thị 3.1 3.2 3.3 Đồ thị biễu diễn diện tích pic theo bước sóng Đồ thị biễu diễn thời gian lưu theo tỉ lệ pha động mẫu chuẩn Đồ thị biễu diện tích pic theo dung môi chiết mẫu thử Trang 35 36 38 3.4 Đồ thị biễu diện tích pic theo thể tích dung mơi chiết 38 3.5 Đồ thị biễu diện tích pic theo thời gian chiết 39 3.6 Đồ thị biễu diện tích pic theo nhiệt độ chiết 40 3.7 Đồ thị biễu diện tích pic theo số lần chiết 40 3.8 Đồ thị biễu diễn đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ rutin 46 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Tên sơ đồ Sơ đồ quy trình chiết tối ưu cho mẫu thử Trang 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây Sầu đâu 1.2 Lá sầu đâu 1.3 Cấu trúc azadirachtin, salanin nimbin 1.4 Cấu trúc hóa học quercetin 1.5 Các hợp chất cô lập từ cao ethyl acetate sầu đâu 1.6 Cấu trúc AT1 = Nimbin 11 1.7 Cấu trúc – deacetylnimbin nimbandiol 11 1.8 Cấu trúc rutin 19 3.1 Chồng SKĐ mẫu thử rutin bước sóng 225, 254, 300, 358nm 3.2 - 10 35 Chồng sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn 42 3.3 Chồng sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu thử 43 3.4 Chồng sắc ký đồ dung môi pha mẫu (1), dung môi pha động (2), mẫu thử (3), mẫu chuẩn (4), mẫu thử thêm chuẩn (5) điều kiện sắc ký tối ưu 43 3.5 Phổ 3D mẫu thử 44 3.6 Tương đồng phổ UV chuẩn thử rutin 45 3.7 Sắc ký đồ rutin nồng độ LOD LOQ 48 3.8 Chồng sắc ký đồ mẫu thử ngày 49 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử nồng độ 80%(1), 100%(2),120%(3) 51 PL 3.61 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 10ppm lần PL 3.62 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 10ppm lần PL 3.63 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 100ppm lần PL 3.64 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 100ppm lần PL 3.65 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 125pm lần PL 3.66 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 125pm lần PL 3.67 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 250ppm lần PL 3.68 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 250ppm lần PL 3.69 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 500ppm lần PL 3.70 SKĐ tính tuyến tính mẫu chuẩn 500ppm lần PL 3.71 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.72 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.73 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.74 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.75 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.76 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.77 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.78 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.79 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.80 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.81 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.82 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.83 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.84 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.85 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.86 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.87 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.88 SKĐ độ xác ngày thử PL 3.89 SKĐ độ mẫu chuẩn 50ppm PL 3.90 SKĐ độ mẫu thử