Xây dựng quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và tenofovir trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

NGUYỄN HỒ NHẬT NGUYÊN - KHÓA 2019 – 2021 NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỒ NHẬT NGUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỒ NHẬT NGUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CHƯƠNG NGỌC NÃI GS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Nguyễn Hồ Nhật Nguyên Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2019 – 2021 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Nguyễn Hồ Nhật Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS Chương Ngọc Nãi, GS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: Tenofovir alafenamid, tenofovir, huyết tương người, LC-MS/MS Mở đầu: Tenofovir alafenamid (TAF), tiền chất tenofovir (TFV), chất ức chế enzym polymerase ADN virus viêm gan B, khuyến cáo thuốc lựa chọn điều trị bệnh viêm gan B mạn tính Hiện nay, thị trường Việt Nam lưu hành thuốc generic tenofovir alafenamid với giá thành thấp nhiều so với thuốc gốc Tuy nhiên, chế phẩm chưa đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc TAF diện huyết tương nồng độ thấp sau uống chuyển hóa thành chất có hoạt tính TFV Tại Việt Nam, chưa có cơng trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid chất chuyển hóa huyết tương người cơng bố Vì vậy, đề tài thực với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid chất chuyển hóa tenofovir huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS, góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa tenofovir alafenamid thị trường Việt Nam Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu huyết tương người giả lập chứa TAF TFV Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện khối phổ, chuẩn nội điều kiện sắc ký; Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương giả lập chứa chất phân tích chuẩn nội phương pháp tủa protein; Thẩm định quy trình định lượng TAF TFV huyết tương người theo hướng dẫn US-FDA EMA Kết quả: TAF, TFV chuẩn nội ion hóa chế độ ESI ghi phổ với kỹ thuật MRM để phát ion tựa phân tử ion phân mảnh TAF TFV dùng cho định lượng m/z 477,10 → 176,00; 288,10 → 176,00 409,20 → 148,10 Với dung mơi tủa protein acetonitril, chất phân tích chiết có hiệu suất ổn định 70% với CV < 15% Điều kiện sắc ký thích hợp bao gồm cột Agilent Poroshell-C6 Phenyl (150 × 4,6 mm; 4,0 µm); Nhiệt độ cột 40 oC; Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 10 oC; Tốc độ dịng 0,7 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu µL; Pha động bao gồm acetonitril - dung dịch đệm acid formic 0,5% với chương trình dung môi sau: 0’(5:95), 3’(5:95), 6’(95:5), 8’(5:95), 10’(5:95) Khoảng tuyến tính TAF TFV – 500 ng/ml 0,4 – 50 ng/ml Giới hạn định lượng phương pháp ng/ml với TAF 0,4 ng/ mL với TFV Các tiêu thẩm định tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác, ảnh hưởng mẫu, lượng mẫu tồn dư, độ pha loãng độ ổn định cho kết nằm giới hạn cho phép Kết luận: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời TAF chất chuyển hóa TFV huyết tương người kỹ thuật LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác độ cao Quy trình ứng dụng để theo dõi nồng độ thuốc huyết tương người nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học Master’s Thesis – Academic course: 2019- 2021 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DEVELOPMENT OF LIQUID CHROMATOGRAPHY - TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF TENOFOVIR ALAFENAMIDE AND TENOFOVIR IN HUMAN PLASMA Nguyen Ho Nhat Nguyen Supervisor: Dr Chuong Ngoc Nai, Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: Tenofovir alafenamide, tenofovir, human plasma, LC-MS/MS Introduction: Tenofovir alafenamide (TAF), a prodrug of tenofovir (TFV), is a potent nucleotide analogue inhibitor of HBV polymerase/reverse transcriptase, currently recommended as first line treatment for chronic hepatitis B The Vietnamese market is currently circulating a tenofovir alafenamide generic with a selling price which is cheaper than the one of brand-name product However, this formulation has not been assessed for in vivo bioequivalence to the reference product Tenofovir alafenamide is present in plasma at very low concentration after oral administration due to it is converted to an active metabolite, tenofovir To the best of our knowledge, no study has been published in Vietnam for simultaneous quantification of tenofovir alafenamide and its metabolite in human plasma so far Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous quantitative procedure for TAF and TFV in human plasma by liquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing tenofovir alafenamide Materials and methods Objective of study: Human plasma samples containing TAF and TFV Methods of study: Mass spectrometry, internal standard (IS), and chromatographic conditions were investigated to find out the suitable IS and conditions; Human plasma samples containing TAF, TFV and IS were investigated by using protein precipitation (PPT) And finally, the assay was validated in compliance with US-FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation Results: TAF, TFV, and IS were ionized using ion electrospray ionization (ESI) and detected by multi-reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular and fragment ions for quantification The transition of m/z is 477.00 → 176.00, 288.10 → 176.00, and 409.20 → 148.10 for TAF, TFV, and IS, respectively The human plasma samples were treated by PPT using acetonitrile which gave the stable recovery above 70% with CV below 15% for all analytes The suitable chromatographic conditions were performed on an Agilent Poroshell C6-Phenyl column (150 x 4.6 mm; 4.0 µm) at 40 ºC The mobile phase comprising of acetonitrile and 0.5% formic acid was delivered 0' (5:95), 3' (5:95), 6' (95:5), 8'(5:95), 10' (5:95) at a flow rate of 0.7 mL/min The autosampler was kept at 10 oC and an aliquot of µL was injected into the LC-MS/MS system The linearity range is 500 ng/mL, and 0.4 - 50 ng/mL for TAF, and TFV, respectively The lower limit of quantitation of TAF, and TFV is ng/mL and 0.4 ng/mL, respectively The validation results showed that the specificity, intra- and inter-day precision and accuracy, matrix effect, carry over, dilution and stability of all the analytes were in the acceptable range Conclusion: A highly sensitive, specific, precise, and accurate LC-MS/MS method for simultaneous quantification of TAF and TFV in human plasma was successfully developed and validated This method can be applied for quantification of these compounds in human plasma for in vivo bioavailability (BA) and bioequivalence (BE) studies LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập thực luận văn với nhiều cố gắng, thời điểm hồn thành luận văn lúc tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người Thầy dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ nhiều suốt thời gian qua Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy GS.TS Nguyễn Đức Tuấn Cô TS Chương Ngọc Nãi – hai người thầy tận tình giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu hồn thành luận văn Thạc sĩ Tơi xin trân trọng cảm ơn Thầy, Cơ Bộ mơn Phân tích – Kiểm nghiệm tận tình truyền đạt kiến thức tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Và cuối tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp – người động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập thực nghiên cứu MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN .63 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt chữ viết tắt ADN Acid deoxyribonucleic APCI Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học áp suất khí Ionization AUC Area under the cuvre Diện tích đường cong AUC0-∞ Area under the curve from time Diện tích đường cong nồng extrapolated to infinite time độ - thời gian từ thời điểm đến vô cực AUC0-t Area under the curve from time Diện tích đường cong nồng to the last measurable độ - thời gian từ thời điểm đến concentration thời điểm t CatA Cathepsin A enzyme CES1 Carboxylesterase enzyme Cmax The maximum concentration Nồng độ đỉnh huyết tương CV Coefficient of variation Hệ số phân tán EMA European Medicines Agency Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa tia điện FAB Fast atom bombardment Ion hóa bắn phá nhanh nguyên tử HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HIV Human Immunodeficiency Virus Virus suy giảm miễn dịch người HQC High Quality Control Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS Internal standard Chuẩn nội i Ký hiệu, Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt chữ viết tắt International Union of Pure and Hiệp hội Quốc tế Hóa học Applied Chemistry túy ứng dụng LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng LC-MS/MS Liquid chromatography - Tandem Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ IUPAC mass spectrometry LLE Liquid-Liquid Extraction Chiết lỏng – lỏng LLOQ Lower Limit of Quantification Giới hạn định lượng LQC Low Quality Control Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MQC Medium Quality Control Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình MS Mass Spectrometry Khối phổ PPT Protein Precipitation Tủa protein RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn Thời gian bán thải T1/2 TAF Tenofovir alafenamid TAM Tamsulosin TDF Tenofovir disoproxil fumarat TFV Tenofovir TFV-DP Tenofovir diphosphat Thời gian đạt nồng độ đỉnh Tmax ULOQ Upper Limit of Quantitation Giới hạn định lượng US-FDA Food and Drug Administration Cơ quan Quản lý thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL - 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 19 Độ ổn định hoạt chất huyết tương mức nồng độ LQC sau 40 ngày -70 oC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 20 Độ ổn định hoạt chất huyết tương mức nồng độ HQC sau 40 ngày -70 oC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 21 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc chuẩn nội sau 60 ngày nhiệt độ -20 oC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL - 22 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 23 Độ ổn định hoạt chất huyết tương mức nồng độ LQC sau 60 ngày -70 oC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 24 Độ ổn định hoạt chất huyết tương mức nồng độ HQC sau 60 ngày -70 oC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 25 Phụ lục 10: Sắc ký đồ liệu thẩm định ảnh hưởng mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL - 26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 27 Phụ lục 11: Sắc ký đồ liệu thẩm định ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL - 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 29 Phụ lục 12: Sắc ký đồ liệu thẩm định ảnh hưởng pha lỗng Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 13: Chứng nhận phân tích chất chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL - 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL - 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 32 Phụ lục 14: Giấy xác nhận đề tài triển khai ứng dụng thử nghiệm in vivo người tình nguyện Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn