Đề tài Nghiên cứu định lượng đồng thời cortisol và testosteron trong huyết thanh chuột bằng phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ nghiên cứu nhằm xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ (LC-ESI-MS/MS) để định lượng đồng thời 2 hormon steroid là cortisol và testosteron trong huyết thanh chuột theo hướng dẫn của FDA.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐẶNG THẢO LINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CORTISOL VÀ TESTOSTERON TRONG HUYẾT THANH CHUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP NỐI ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CORTISOL VÀ TESTOSTERON TRONG HUYẾT THANH CHUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP NỐI ĐẦU DỊ KHỐI PHỔ KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QH.2017.Y Người hướng dẫn: NCS ThS Đặng Kim Thu ThS Nguyễn Văn Khanh Hà Nội – 2022 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh cố gắng nỗ lực không ngừng thân, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy cô thuộc Đại học Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội : Thầy Nguyễn Văn Khanh - giảng viên môn Bào chế Công nghệ dược phẩm trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo em tìm hướng nghiên cứu, tiếp cận thực tế, tìm kiếm tài liệu, xử lý phân tích số liệu, giải vấn đề để hồn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Cơ Đặng Kim Thu - giảng viên mơn Dược lâm sàng ln nhiệt tình hỗ trợ, quan tâm, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm suốt thời gian em học tập hồn thành khóa luận Em xin chúc quý thầy cô dồi sức khỏe ngày có nhiều thành cơng nghiệp sống Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, người ln bên cạnh động viên, khích lệ giúp đỡ em sống học tập để em thực hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phịng ban tồn thể thầy cô giáo Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tâm huyết kiến thức dạy em suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Tổng quan hormon: .2 1.2 Cortisol: 1.2.1 Giới thiệu: 1.2.2 Tác dụng sinh học testosteron: 1.2.3 Công thức, cấu tạo, danh pháp: 1.2.4 Một số bệnh lý liên quan tăng giảm cortisol: 1.3 Tổng quan testosterol: 1.3.1 Giới thiệu: 1.3.2 Công thức, cấu tạo, danh pháp: 1.3.3 Tác dụng sinh lý testosteron: .5 1.3.4 Bệnh lý tăng giảm testosteron: 1.4 Các phương pháp định lượng hormon steroid dịch sinh học: 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò khối phổ: .6 1.4.2 Kỹ thuật miễn dịch 1.4.3 Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ: 1.4.4 So sánh tính chất phương pháp xét nghiệm hormon steroid: CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 11 2.1.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm 11 2.1.3 Máy móc, dụng cụ 11 2.2 Phương pháp nghiên cứu .11 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu huyết chuột .11 2.2.2 Phương pháp định lượng đồng thời hormon steroid (cortisol testosteron) LC-ESI-MS/MS 12 CHƯƠNG - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 15 3.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ .15 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 15 3.2.1 Khoảng định lượng tính tuyến tính 15 3.2.2 Độ đặc hiệu, độ chọn lọc 16 3.2.3 Giới hạn định lượng (LLOQ) 18 3.2.4 Độ thu hồi độ lặp lại 20 3.2.5 Độ ổn định 21 3.3 Ứng dụng phân tích số mẫu huyết chuột 21 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 24 KẾT LUẬN 29 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt HPLC LC-MS/MS GC-MS Ias ELISA Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ hai lần Sắc ký khí ghép nối đầu dị khối phổ Xét nghiệm miễn dịch Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym FSH Hormon kích thích nang trứng LH Hormon kích thích hồng thể m Khối lượng z Điện tích LLOQ Giới hạn định lượng CV Hệ số biến thiên độ lặp lại S/N Giá trị tín hiệu/nhiễu đường LC-UV Sắc ký lỏng với phát tia cực tím DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học cortisol Hình 1.2 Cấu trúc hóa học testosteron Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC mẫu phân tích 16 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu phân tích 17 Hình 3.3 LLOQ cortisol (0,1 ng/mL) testosteron (0,025 ng/mL) 19 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 So sánh tính chất phương pháp xét nghiệm miễn dịch GC / MS LC - MS / MS để phân tích hormon steroid 10 Bảng 3.1 Một số thông số MS cho chất phân tích 15 Bảng 3.2 Khoảng định lượng tính tuyến tính cortisol testosteron 15 Bảng 3.3 Nồng độ cortisol testosteron mẫu huyết 17 Bảng 3.4 Mỗi tương quan tuyến tính thể tích huyết với hàm lượng cortisol testosteron 18 Bảng 3.5 Kết xác định giá trị LLOQ cortisol testosteron .19 Bảng 3.6: Độ thu hồi độ lặp lại phương pháp .20 Bảng 3.7: Độ ổn định cortisol testosteron điều kiện khác 21 Bảng 3.8: Nồng độ cortisol testosteron huyết chuột khỏe mạnh 22 Bảng 3.9: Nồng độ cortisol testosteron số dịch sinh học khác 22 MỞ ĐẦU Hormon steroid sản xuất vỏ thượng thận, tuyến sinh dục, hoàng thể đơn vị thai- thai, đóng vai trị quan trọng việc kiểm soát hành vi phát triển động vật Ví dụ, testosteron, hormon sinh dục nam thúc đẩy sản xuất tinh trùng, phát triển đặc điểm sinh dục cạnh tranh sinh sản nam Cortisol điều hòa phản ứng căng thẳng, điều chỉnh trao đổi chất, phản ứng viêm chức miễn dịch Sự thay đổi nồng độ hormon testosteron cortisol có liên quan tới số bệnh lý già hóa, stress, Addison, hội chứng Cushing… [39] Hiện có nhiều phương pháp để xác định nồng độ hormon steroid sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ hai lần (LC-MS/MS), Sắc ký khí ghép nối đầu dị khối phổ (GC-MS), miễn dịch Trong đó, LC-MS/MS phương pháp ưu việt Với ưu điểm có độ đặc hiệu cao, tính chọn lọc tốt; độ nhạy cao với giới hạn định lượng thấp; khoảng tuyến tính rộng; độ thu hồi; độ lặp lại độ ổn định đạt yêu cầu Phương pháp ngày sử dụng nhiều phịng thí nghiệm để thay cho phương pháp xét nghiệm miễn dịch GC-MS Vì chúng có nhược điểm độ nhạy độ đặc hiệu, thời gian chuẩn bị mẫu phức tạp Ví dụ GC-MS cần tạo dẫn xuất để dễ bay hơi, thời gian chuẩn bị mẫu dài [65] Xét nghiệm miễn dịch thiếu tính đặc hiệu, đặc biệt steroid có mặt nồng độ thấp [44, 60] Tuy đơn giản không yêu cầu bước tiền xử lý, cần khối lượng mẫu lớn Các nhà khoa học rằng, xét mặt hiệu suất, số kỹ thuật miễn dịch tối ưu, xét tổng thể, phương pháp LC-MS/MS khuyến cáo để thay cho kỹ thuật miễn dịch định lượng nồng độ hormon steroid [66], [64], [63] Vì lý trên, em thực đề tài “nghiên cứu định lượng đồng thời cortisol testosteron huyết chuột phương pháp sắc lý lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò khối phổ” với 01 mục tiêu là: Xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò khối phổ (LC-ESI-MS/MS) để định lượng đồng thời hormon steroid cortisol testosteron huyết chuột theo hướng dẫn FDA CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hormon: Hormon “thơng tín viên” hệ nội tiết, tiết từ tế bào tiết tuyến đặc biệt gọi tuyến nội tiết Chúng mang tín hiệu tới quan thực (cơ quan đích) tuyến khác, tế bào khơng phải nội tiết Có đặc tính: - Được tiết từ tế bào chuyên biệt (tế bào tiết/tuyến nội tiết) với lượng nhỏ - Đổ thẳng vào dòng máu vận chuyển tới nơi mà chúng phát huy tác dụng cách xa nơi chúng tiết - Tác động tế bào đặc hiệu (tế bào đích/ tuyến đích) để tạo hiệu đặc hiệu Một hormon tác động nhiều đích tạo nhiều hiệu khác - Phối hợp với hệ thần kinh để đóng vai trị người điều tiết sinh lý q trình chuyển hóa tích hợp thể; có đồng tác động nhiều hormon khác Dựa vào cấu trúc hóa học hormon người ta chia chúng thành ba nhóm: - Hormon có cấu trúc peptid glycoprotein - Hormon dẫn xuất tyrozin (acid amin) - Hormon có cấu trúc steroid cấu trúc tương tự Hormon steroid sản xuất vỏ thượng thận, tuyến sinh dục, hoàng thể đơn vị thai- thai Chúng khó tan nước Trong máu gắn vào protein đặc hiệu gọi protein vận chuyển đặc hiệu Vd: transcortin cho cortisol; globulin gắn với hormon sinh dục cho testosteron estrogene;… [1] 1.2 Cortisol: 1.2.1 Giới thiệu: Cortisol hormon căng thẳng thể, tổng hợp từ cholesterol tổng hợp lớp zona fasciculata vỏ thượng thận Cortisol có nhiều tác động đến chức toàn thể tham gia vào hoạt ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CORTISOL VÀ TESTOSTERON TRONG HUYẾT THANH CHUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP NỐI ĐẦU DỊ KHỐI PHỔ KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC... lý trên, em thực đề tài ? ?nghiên cứu định lượng đồng thời cortisol testosteron huyết chuột phương pháp sắc lý lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò khối phổ? ?? với 01 mục tiêu là: Xây dựng phương pháp sắc. .. HPLC LC-MS/MS GC-MS Ias ELISA Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng ghép nối đầu dị khối phổ hai lần Sắc ký khí ghép nối đầu dò khối phổ Xét nghiệm miễn dịch Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch