Báo cáo đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành các axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Nhằm giúp các bạn hiểu hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo nội dung bài báo cáo đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) dưới đây.

BÁO CÁO Đ  ÁN T T NGHI P Ồ Ố Ệ

TÊN Đ  TÀI: Ề

“NGHIÊN C U XÁC Đ NH CÁC LO I AXIT AMIN TRONG M T S  LOÀI Ứ Ị Ạ Ộ Ố

N M  L N   KHU V C B C TRUNG B  B NG PHẤ Ớ Ở Ự Ắ Ộ Ằ ƯƠNG PHÁP S C KÍ Ắ

L NG HI U NĂNG CAO (HPLC)”Ỏ Ệ

GVHD:  Th.S Hoàng Văn Trung SVTH: Nguy n Duy Tr ng ễ ọ

Hoàng Th  Nga ị

  V i c u trúc đ a ch t đ c đáo, đ a lý th y văn đa d ng, khí h u  ớ ấ ị ấ ộ ị ủ ạ ậ nhi t đ i gió mùa đã góp ph n t o nên s  đa d ng c a h  n m  ệ ớ ầ ạ ự ạ ủ ệ ấ

Vi t Nam, đây là ngu n có giá tr  tài nguyên r t to l n ệ ồ ị ấ ớ

  Hi n nay không ch    Vi t Nam mà trên th  gi i đ u công nh n  ệ ỉ ở ệ ế ớ ề ậ giá tr  khoa h c các loài n m, n m đ ị ọ ấ ấ ượ c coi là m t th c ph m ch c  ộ ự ẩ ứ năng, có ý nghĩa r t quan tr ng trong đ i s ng con ng ấ ọ ờ ố ườ i, chúng là  ngu n th c ph m giàu ch t dinh d ồ ự ẩ ấ ưỡ ng, ngu n d ồ ượ c ph m quý.  ẩ

  Protein trong n m có giá tr  dinh d ấ ị ưỡ ng cao h n so v i h u h t các  ơ ớ ầ ế protein th c v t. Protein khi đi vào c  th  đ ự ậ ơ ể ượ c chuy n hóa thành  ể các  axit amin, trong đó có 9 axit amin thi t y u ế ế  Axit amin là thành ph n  ầ quan tr ng  th c hi n các ch c năng đa d ng c a c  th ọ ự ệ ứ ạ ủ ơ ể, là ti n thân  ề

c a  nhi u sinh ch t  quan  tr ng  trong  c   th   s ng ủ ề ấ ọ ơ ể ố   Vì  v y  vi c  xác  ậ ệ

đ nh axit amin trong n m là r t c n thi t ị ấ ấ ầ ế

M  Đ U Ở Ầ

1. Lí do ch n đ  tài ọ ề

 

2. M c đích nghiên c u ụ ứ

     Xây d ng phự ương pháp tách và đ nh lị ượng đ ng th i các axit amin ồ ờtrong  các  lo i  n m  khác  nhau,  cung  c p  s   li u  v   thành  ph n  dinh ạ ấ ấ ố ệ ề ầ

dưỡng (axit amin) trong m t s  lo i n m độ ố ạ ấ ược nghiên c u.ứ

3. Đ i t ố ượ ng nghiên c u ứ  

      Nghiên c u xác đ nh các axit amin trênứ ị  n m t  nhiên đấ ự ược thu 

th p t  ậ ừ r ng Qu c gia Pù Mát, Phong Nha K  Bàngừ ố ẻ  thu c ộ vùng B c ắ

Trung B ộ

   Trong  nh ng  năm  g n  đây,  HPLC  đữ ầ ượ ức  ng  d ng  r ng  rãi  trong ụ ộphân tích, đánh giá ch t lấ ượng th c ph m nh  axit amin, vitamin, kháng ự ẩ ưsinh, ph  gia th c ph m  Xu t phát t  th c t  đó, chúng tôi l a ch n ụ ự ẩ ấ ừ ự ế ự ọ

đ  tài : ề “Nghiên c u xác đ nh hàm lứ ị ượng các axit amin trong m t s  ộ ố

loài n m l n   vùng B c Trung B  b ng phấ ớ ở ắ ộ ằ ương pháp s c ký l ng ắ ỏ

hi u năng cao HPLC”.ệ

C N H

H

H

C O

H

R

C O

O

_

1.2. Axit amin

  L­Alanin  L­Arginin    Axit L­Aspartic   L­Cystin   

  L­Histidin 

  L­Methionin 

  Axit L­Glutamic 

  L­isoleucin 

  L­Leucin 

  L­Lysin 

  L­Phenylalanin 

  L­Prolin 

  L­Serin 

  L­Thrionin 

  L­Tyrosin 

  L­Valin 

   

L­Glycin   

B ng 1.1: C u trúc c a 17 axit amin tiêu chu n ả ấ ủ ẩ

Các m u ẫ  N m Th ấ ượ ng hoàng, n m PL1, n m PL2, n m PL3,  ấ ấ ấ

n m PL4 ấ  đ ượ c thu th p t  các r ng Qu c Gia Pù Mát và r ng Phong  ậ ừ ừ ố ừ Nha K  Bàng vào 8­2013 ẻ  Sau khi đ a v  phòng thí nghi m đ ư ề ệ ượ c làm  khô và b o qu n ả ả    nhi t đ  phòng ở ệ ộ

  Hình 2.1: M u n m PL1   ẫ ấ Hình 2.2: m u n m PL2 ẫ ấ Hình 2.3: m u n m PL3 ẫ ấ

2.1. Thu th p m u  ậ ẫ

n m ấ

 

  

Hình 2.4: M u n m PL4       Hình 2.5: M u n m Th ẫ ấ ẫ ấ ượ ng hoàng

   2.6: Mâ u nâ m Linh Chi ̃ ́

 2.2 Quy trình phân tích

TT Time (min) A % B % Flow 

2.3. Đi u ki n ch y máy ề ệ ạ

 Chương trình b m m u:ơ ẫ

3.1. Kh o sát các đi u ki n th y phân m uả ề ệ ủ ẫ

3.1.1. Kh o sát n ng đ  axit HClả ồ ộ

        Đ  ch n n ng đ  axit HCl phù h p cho s  th y phân m u chúng tôi kh o ể ọ ồ ộ ợ ự ủ ẫ ảsát m t dãy m u th c (m u n m Thộ ẫ ự ẫ ấ ượng hoàng) cùng v i chu n axit amin ớ ẩ25pmol được thêm vào và th y phân trong môi trủ ường HCl   các n ng đ  : ở ồ ộ3M; 4M; 5M; 6M; 6,5M ; 7M.   nhi t đ  th y phân 125Ở ệ ộ ủ 0C  trong th i gian 24h ờ

 

Ch ươ ng 3. K T QU  VÀ TH O LU N Ế Ả Ả Ậ

TT  Nồng độ 

HCl (M) 

Axit  amin 

       T  đ  th  cho th y khi n ng đ  axit ừ ồ ị ấ ồ ộ HCl 6M    các axit amin đ u cho ở ề

hi u su t thu h i ệ ấ ồ cao nh t. ấ T  n ng đ  6­6,5M thì hi u su t thu h i  n ừ ồ ộ ệ ấ ồ ổ

đ nị h và các hi u su t thu đệ ấ ượ ớc l n h n 90%. T  k t qu  này chúng tôi ơ ừ ế ả

ch n n ng đ  axit HCl 6M làm môi trọ ồ ộ ường th y phân m u cho các nghiên ủ ẫ

c u ti p theo.ứ ế

Hình 3.1: S  ph  thu c c a hi u su t thu h i axit amin vào n ng đ  HCl ự ụ ộ ủ ệ ấ ồ ồ ộ

3.3.2. Kh o sát th i gian th y phân m uả ờ ủ ẫ

       Đ  ch n th i gian phù h p cho s  th y phân các axit amin, chúng tôi chu n b   ể ọ ờ ợ ự ủ ẩ ị

m u  n m  ẫ ấ Th ượ ng  hoàng  và  m u  n m ẫ ấ  Th ượ ng  hoàng  thêm  chu n  ẩ 25pmol  ti n  ế hành  th y  phân  trong  môi  tr ủ ườ ng  HCl  6M,  nhi t  đ   125 ệ ộ 0 C  và  th y  phân  t i  các  ủ ạ

m c th i gian khác nhau :  ố ờ 20h, 22h, 24h, 26h.

TT  Thời gian 

(h) 

Axit  amin 

B ng 3.2   nh h ả Ả ưở ng c a th i gian th y phân đ n hi u su t thu h i ủ ờ ủ ế ệ ấ ồ

     K t qu    hình 3.ế ả ở 2 cho th y ấ khi th i gian th y phân l n h n 2ờ ủ ớ ơ 2h hi u ệ

su t thu h i b t đ u  n đ nh. Th i gian t  2ấ ồ ắ ầ ổ ị ờ ừ 4h­26h cho hi u su t thu h i ệ ấ ồ

t t nh t,   24h cho hi u su t r t l n (> 95%). V y nên chúng tôi ch n 24h ố ấ ở ệ ấ ấ ớ ậ ọ

là th i gian th y phân m u phân tích.ờ ủ ẫ

Hình 3.2: S  ph  thu c c a hi u su t thu h i axit amin vào th i gian th y phân ự ụ ộ ủ ệ ấ ồ ờ ủ

3.2. Xây d ng ph ự ươ ng trình đ ườ ng chu n ẩ

Đ  ti n hành xây d ng để ế ự ường chu n chúng tôi ẩ chu n b  m t dãy dung ẩ ị ộ

d ch chu n ị ẩ có n ng  đ : 10pmolồ ộ , 25pmol, 100pmol  đ  xác đ nh kho ng ể ị ảtuy n tính c a các axit amin. ế ủ K t qu  đo đế ả ược nh  sau:ư

B ng 3 ả 3:  S  ph  thu c c a di n tích pic s c ký vào n ng đ  (pmol/ ự ụ ộ ủ ệ ắ ồ ộ      )

Hình 3.4: S c đ  h n h p chu n  ắ ồ ỗ ợ ẩ các axit amin   n ng đ  25pmol ở ồ ộ

Hình 3.5: S c đ   ắ ồ ch y  ạ h n h p chu n  ỗ ợ ẩ các axit amin   n ng đ  10 ở ồ ộ 0pmol

Hình 3.3: S c đ  h n h p chu n các axit amin   n ng đ  10pmol ắ ồ ỗ ợ ẩ ở ồ ộ  

3.2. Xác đ nh gi i h n phát hi n ị ớ ạ ệ  (LOD), gi i h n đ nh l ớ ạ ị ượ ng  (LOQ)

a

SD LOD 3             

x

x SD

2 1

) (

1

)

(

   

B ng 3 ả 4: Giá tr  LOD và LOQ c a axit Aspartic ị ủ

Ti n hành đo l p l i 3 l n cho m i n ng đ  chu n ta có b ng giá tr  LOD và  ế ặ ạ ầ ỗ ồ ộ ẩ ả ị

LOQ c a Aspartic nh  sau: ủ ư

B ng 3.5: Gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ả ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ ng c a ph ủ ươ ng pháp

TT  Axit amin  LOD (pmol)  LOQ (pmol) 

3.5. Đ  thu h i c a phộ ồ ủ ương pháp

       D a vào vi c thêm chu n vào m u th c cùng v i làm m u th c ự ệ ẩ ẫ ự ớ ẫ ự

không thêm chu n song song chúng tôi ti n hành tính đ  thu h i nh  sau :ẩ ế ộ ồ ư

      Hi u su t thu h i ệ ấ ồ

100

%

so

m m

s

C

C

C H

      Ti n hành thí nghi m trên n m ế ệ ấ Thượng hoàng, n m ấ Thượng hoàng thêm chu n ẩ 25pmol, th c hi n phân tích 5 l n l p l i và l y k t qu  ự ệ ầ ặ ạ ấ ế ả

trung bình. Các k t qu  đế ả ược ch  ra   b ng 3.ỉ ở ả 6

B ng 3 ả 6: Hi u su t thu h i c a axit amin trong n m  ệ ấ ồ ủ ấ Th ượ ng Hoàng

Hình 3.11: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân n m Th ắ ồ ị ủ ấ ượ ng hoàng thêm  chu n ẩ

Hình 3.10: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân m u n m Th ắ ồ ị ủ ẫ ấ ượ ng hoàng  

 

B ng 3 ả 7: Hàm l ượ ng axit amin trong n m  ấ Th ượ ng hoàng

 

3.6. Xác đ nh hàm lị ượng các axit amin trong các m u n mẫ ấ

B ng 3 ả 8: Hàm l ượ ng (μg/g) axit amin trong các m u n m  ẫ ấ

Nấm 

PL2  0.7976 

Nấm 

PL4  0.9042 

Nấm 

PL3  0.9842 

Nấm 

Linh Chi  0.5479 

Linh  Chi Đen  0.5019 

B ng 3 ả 9: Hàm l ượ ng (μg/g) axit amin trong các m u n m  ẫ ấ

 

B ng 3 ả 10: Hàm l ượ ng (μg/g) axit amin trong các m u n m  ẫ ấ theo 

ph ươ ng pháp x  lí m u khác nhau ử ẫ

 

Thượng Hoa ng  ̀ HL­ T

Hình 3.12: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân m u n m PL1 ắ ồ ị ủ ẫ ấ

Hình 3.13: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân m u n m PL2 ắ ồ ị ủ ẫ ấ

 

 

Hình 3.14: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân m u n m PL3 ắ ồ ị ủ ẫ ấ

Hình 3.15: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân m u n m PL4 ắ ồ ị ủ ẫ ấ

 

 

Hình 3.16: S c đ  tách axit amin trong d ch th y phân m u n m Linh chi ắ ồ ị ủ ẫ ấ

 

1. Kh o sát t i  u hóa m t s  đi u ki n trong quy trình th y phân x  lý ả ố ư ộ ố ề ệ ủ ử

m u xác đ nh hàm lẫ ị ượng axit amin trong n m:ấ

      + Th i gian th y phân m u t i  u là 24hờ ủ ẫ ố ư

      + N ng đ  HCl th y phân t i  u là 6Mồ ộ ủ ố ư

2. Đã xây d ng đ c ph ng trình đ ng chu n  c a ự ượ ươ ườ ẩ ủ các axit amin và xác 

đ nh đị ược kho ng n ng đ  nghiên c u n m trong kho ng tuy n tính.ả ồ ộ ứ ằ ả ế

3. Xác đ nh đ c gi i h n phát hi n LOD và gi i h n đ nh l ng LOQ ị ượ ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ

c a phủ ương pháp là r t nh : LOD t  0,0ấ ỏ ừ 006 ­ 0,006 pmol, LOQ t  0,0ừ 02 ­ 0,0153pmol

4. Quy trình phân tích đ a ra đã đ c đánh giá b ng đ ng chu nư ượ ằ ườ ẩ , đ  thu ộ

h i. Đ  thu h i v i các lo i axit amin n m trong kho ng 85,6 – 1ồ ộ ồ ớ ạ ằ ả 33,8% trong vùng đường chu n tuy n tính.ẩ ế

K T LU N Ế Ậ 

5. Xác đ nh đ c hàm l ng axit amin th y phân trong 7 m u n m t  nhiên, c   ị ượ ượ ủ ẫ ấ ự ụ

th : ể

K T LU N Ế Ậ 

T  các k t qu  thu đừ ế ả ược chúng tôi th y phấ ương pháp phân tích hàm 

lượng axit amin trong các m u n m v i đ  tin c y cao và đ  ngh  đẫ ấ ớ ộ ậ ề ị ược áp d ng ụ

phương pháp phân tích axit amin này cho nhi u đ i tề ố ượng th c ph m khác nhau.ự ẩ