Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid baicalein, baicalin, chrysin trong vị thuốc hoàng bá nam (cortex oroxyli indici)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Thị Tuyết XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID: BAICALEIN, BAICALIN, CHRYSIN TRONG VỊ THUỐC HOÀNG BÁ NAM (CORTEX OROXYLI INDICI) LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Thị Tuyết XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID: BAICALEIN, BAICALIN, CHRYSIN TRONG VỊ THUỐC HOÀNG BÁ NAM (CORTEX OROXYLI INDICI) Chun ngành: Hóa phân tích LUẬN VĂN THẠC SĨ Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng PGS.TS Nguyễn Văn Ri Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phương Thiện Thương PGS.TS Nguyễn Văn Ri tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài luận văn Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Hà Ly giúp đỡ tơi suốt q trình thực Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dược liệu toàn thể đồng nghiệp khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2019 Học viên Hoàng Thị Tuyết MỤC LỤC MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY HOÀNG BÁ NAM 1.1.1 Đặc điểm thực vật .3 1.1.2 Phân bố sinh thái Hoàng bá nam 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Công dụng 1.1.6 Tác dụng sinh học 10 1.2 Tổng quan phương pháp phân tích thành phần hóa học dược liệu Hồng bá nam 12 1.2.1 Phân tích thành phần hóa học dược liệu Hoàng bá nam 13 1.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu 17 1.4 Kết luận phần tổng quan 17 CHƢƠNG II: THỰC NGHIỆM 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị 20 2.2.1 Chất chuẩn 20 2.2.2 Hóa chất 20 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ .20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn 23 2.3.2 Tối ưu hóa hệ thống phân tích sắc ký .23 2.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 25 2.4.1 Tính chọn lọc, độ đặc hiệu .25 2.4.2 Tính thích hợp hệ thống .26 2.4.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 26 2.4.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 27 2.4.5 Độ lặp lại ngày khác ngày 27 2.4.6 Độ (hiệu suất thu hồi) 28 2.4.7 Ước lượng độ không đảm bảo đo(ĐKĐBĐ) 28 2.5 Phân tích mẫu thực tế 29 CHƢƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời baicalein, baicalin, chrysin 30 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 30 3.1.2 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 34 3.1.3 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 36 43 3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích định lượng đồng thời baicalin, baicalein chrysin dược liệu hoàng bá nam 44 3.2.1 Độ đặc hiệu (tính chọn lọc) 44 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống .45 3.2.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .46 3.2.4 Độ lặp lại ngày khác ngày 46 3.2.5 Độ 48 3.2.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ) 49 3.3 Áp dụng phương pháp định lượng baicalein, baicalin chrysin mẫu Hoàng bá nam 50 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây dược liệu Hoàng bá nam Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo Stilbenoid có Hồng bá nam Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số có triterpenoid Hồng bá nam Hình 2.1 Một số mẫu dược liệu Hoàng bá nam (vỏ thân) dùng cho nghiên cứu 20 Hình 2.2 Cơng thức cấu tạo chất nghiên cứu 20 Hình 2.3 Sơ đồ hệ thống thiết bị hệ thống HPLC 22 Hình 3.1 Phổ UV-VIS ba hợp chất baicalin, baicalein chrysin 30 Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC chương trình gradient thử nghiệm 33 Hình 3.3 Đường chuẩn baicalin, baicalein, chrysin 36 Hình 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 37 Hình 3.5 Kết khảo sát phương pháp chiết mẫu 40 Hình 3.6 SKĐ HPLC-UV đánh giá tính đặc hiệu baicalin, baicalein, chrysin 44 Hình 3.7 Kết phân tích hàm lượng baicalin, baicalein, chrysin dược liệu Hoàng bá nam số tỉnh Việt Nam 51 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm flavonoid Hoàng bá nam Bảng 1.2 Công thức cấu tạo baicalin, baicalein, chrysin có Hồng bá nam Bảng 2.1 Thơng tin mẫu Hồng bá nam dùng cho nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Chương trình rửa giải gradient thử nghiệm 31 Bảng 3.2 Các thông số hệ gradient 34 Bảng 3.3 Kết khảo sát khoảng tuyến tính baicalin, baicalein, chrysin 34 Bảng 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 36 Bảng 3.5 ảnh hưởng nhiệt độ chiết siêu âm baicalein, baicalin, chrysin 38 Bảng 3.6 ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm baicalin, baicalein, chrysin 39 Bảng 3.7 ảnh hưởng thời gian chiết hồi lưu baicalein, baicalin, chrysin 40 Bảng 3.8 Kết khảo sát số lần chiết 42 Bảng 3.9 Tính thích hợp hệ thống baicalein, baicalin, chrysin 45 Bảng 3.10 Kết khảo sát LOD, LOQ phương pháp 46 Bảng 3.11 Kết phân tích độ lặp lại ngày khác ngày định lượng đồng thời baicalin, baicalein chrysin 47 Bảng 3.12 Kết phân tích độ lặp lại ngày khác ngày 48 Bảng 3.13 Kết phân tích độ phương pháp 49 Bảng 3.14 Kết ĐKĐBĐ baicalin, baicalein, chrysin 49 Bảng 3.15 Kết phân tích số mẫu dược liệu Hoàng bá nam 50 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh tên khoa học Tên tiếng việt ACN Acetonitrile Acetonitril EtOH ethanol ethanol MeOH methanol methanol Abs Absorbance Độ hấp thụ quang AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic EtOH Ethanol Ethanol GC Gas chromatography Sắc ký khí HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao High performance thin layer chromatography High performance liquid chromatography with mass spectromestry High performance liquid chromatography with diode array detection High performance liquid chromatography with ultraviolet detection Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Sắc ký lỏng hiệu cao kết nối detector quang phổ tử ngoại R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan RS Resolution Độ phân giải LOD Limit of Detection Giới hạn phát HPTLC HPLC-MS HPLC-DAD HPLC-UV Sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng ghép nối detector mảng diod LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng SKĐ Chromatogram Sắc ký đồ CTCT Structural formula Công thức cấu tạo UV-VIS Ultraviolet-visible Tử ngoại-khả kiến Tf Tailing factor Hệ số kéo đuôi tR Retention time Thời gian lưu MSW Standard deviations for winthin Phương sai mẫu MSB Standard deviations for between Phương sai mẫu Relative standard deviation Relative standard deviation for reproducibility Độ lệch chuẩn tương đối RSDr RSDR Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối MỞ ĐẦU Việt Nam quốc gia nằm khu vực có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển đa dạng phong phú dược liệu có nguồn gốc từ thực vật Tuy nhiên, nhiều thuốc sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa nghiên cứu cách tồn diện Chính vậy, việc nghiên cứu thuốc cần thiết, nhằm đảm bảo hiệu phòng điều trị bệnh Trong y học cổ truyền, Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli indici) loại dược liệu biết đến với nhiều lợi ích như: can giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng, nhuận phế, dị ứng mẩn ngứa, viêm họng, ho khản tiếng, đau dày, lỵ, viêm đường tiết niệu [3],[10]…Với nguồn nguyên liệu phong phú có tác dụng tốt sức khỏe người, nên Hoàng bá nam ngày sử dụng rộng rãi lĩnh vực như: sản xuất thuốc, thực phẩm chức Theo nghiên cứu thành phần hóa học dược liệu Hoàng bá nam cho thấy flavonoid thành phần có tác dụng Một số hoạt chất flavonoid quan trọng có dược liệu là: baicalein, baicalin, chrysin Các hoạt chất chứng minh có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư, ức chế virus HIV-1, cải thiện chức thận,…[22],[13],[33] Hoàng bá nam qui định DĐVN V (2017) Tuy nhiên, chuyên luận đưa số tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu là: mô tả, vi phẫu, soi bột, tạp chất mà chưa có tiêu định lượng hàm lượng hoạt chất phương pháp sắc ký đại [1] Do đó, việc áp dụng chuyên luận đánh giá chất lượng dược liệu Hoàng bá nam nhiều hạn chế Để góp phần nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hoàng bá nam, đề tài: ―Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời flavonoid (dự kiến gồm baicalein, baicalin chrysin) dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) phương pháp HPLC-UV‖ đề xuất thực với mục tiêu chính: - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời flavonoid dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) Oroxylum indicum in Rat Models: A Promising Natural Gift", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2019, pp 1-13 46 Pharmacopoeia of the people's republic of China (2015), Oroxyli Semen, China Medical Science and Technology Press publishing company, pp 318 - 319 47 Qian Wang et al ((2004), "Zinc coupling potentiates anti-HIV-1 activity of baicalin", Biochemical and Biophysical Research Communications, 324(2), pp 605-610 48 Qing-Fei Fan, Zu-Yan Hua, Zhi Na, Hua-Shu Tang, Guo-Ying Zuo, Qi-Shi Song (2015), "One new flavonoid from Oroxylum indicum", Natural Product Research, 29(19), pp 1828 - 1832 49 Ranjith Arimboor, K Salini, Chami Arumughan (2013), "HPTLC Estimation of Oroxylin A in Oroxylum indicum Herbal Formulations", Journal of Planar Chromatography, 26(3), pp 274-278 50 Sudipta Das, Manabendra Duttachoudhury (2010), "Antimicrobial Activity of Stem Bark Extracts from the Plant Oroxylum indicum Vent.", Biological and Environmental Sciences, 5(1), pp 95-99 51 T Hari Babu, K Manjulatha, G Suresh Kumar, A Hymavathi, Ashok K Tiwari, Muraleedhar Purohit, J Madhusudana Rao, K Suresh Babu (2010), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20 pp 117–120 52 Vimal Kumar et al (2011), "Antioxidant and antimicrobial activities of stem bark extracts of Oroxylum indicum Vent (Bignoniaceae) A medicinal plant of northeastern India", South Asian Journal of Experimental Biology, 1( 3) 53 Whasun Lim et al (2017), "Chrysin Attenuates Progression of Ovarian Cancer Cells by Regulating Signaling Cascades and Mitochondrial Dysfunction", Original Research, 233(4), pp 3129-3140 54 Xiao-Nan Wei, Bin-Bin Lin, Guo-Yong Xie, Jian-Wen Li, Min-Jian Qin (2013), "Chemical constitunents of seeds of Oroxylum indicum", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 38(2), pp 204-207 55 Xiaotong Wei et al (2018), "Chrysin promotes SMMC-7721 cell apoptosis by regulating MAPKs signaling pathway", Journal Article (lang:chi), 38(10), pp 1187-1194 56 Xue-Song Liu et al (2009), "Solubility of Baicalin in Methanol, Ethanol, and Ethyl Acetate from (298.2 to 328.2) K", J Chem Eng Data (54), pp 2330– 2331 57 Yan Qing Zhou, Qing Wen Zhang, Song Lin Li, Zhi Qi Yin, Xiao Qi Zhang, Wen Cai Ye (2012), "Quality Evaluation of Semen Oroxyli through Simultaneous Quantification of 13 Components by High Performance Liquid Chromatography", Current Pharmaceutical Analysis, 8(2), pp 206 - 213e 58 Yi Xu et al (2018), "Chrysin induces cell growth arrest, apoptosis, and ER stress and inhibits the activation of STAT3 through the generation of ROS in bladder cancer cells", Oncology Letters, (15), pp 9117-9125 59 Zhao Zhengxiao et al (2019), "Baicalein Inhibits Orthotopic Human Non-Small Cell Lung Cancer Xenografts via Src/Id1 Pathway", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2019, pp 1-7 60 Zhou Wang, Lingman Ma, Mengqi Su, Yiran Zhou, Ke Mao, Chengqin Li, Guangyong Peng, Changlin Zhou, Baiyong Shen, Jie Dou (2018), "Baicalin induces cellular senescence in human colon cancer cells via upregulation of DEPP and the activation of Ras/Raf/MEK/ERK signaling", Cell death and disease, 217 PHỤ LỤC SKĐ mẫu dược liệu Hoàng bá nam Sapa SKĐ mẫu dược liệu Hoàng bá nam Phú Thọ SKĐ mẫu dược liệu Hoàng bá nam Nghệ An SKĐ mẫu dược liệu Hoàng bá nam Lạng Sơn SKĐ mẫu dược liệu Hoàng bá nam Hòa Bình SKĐ hồn hợp chuẩn baicalin, baicalein, chrysin SKĐ hồn hợp chuẩn baicalin, baicalein, chrysin SKĐ hồn hợp chuẩn baicalin, baicalein, chrysin SKĐ hồn hợp chuẩn baicalin, baicalein, chrysin SKĐ hồn hợp chuẩn baicalin, baicalein, chrysin SKĐ hồn hợp chuẩn baicalin, baicalein, chrysin ... chính: - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời flavonoid dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) - Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng hàm lượng hoạt chất mẫu Hoàng bá nam số vùng... NHIÊN Hoàng Thị Tuyết XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID: BAICALEIN, BAICALIN, CHRYSIN TRONG VỊ THUỐC HOÀNG BÁ NAM (CORTEX OROXYLI INDICI) Chun ngành: Hóa... dựng phương pháp định lượng đồng thời flavonoid (dự kiến gồm baicalein, baicalin chrysin) dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) phương pháp HPLC-UV‖ đề xuất thực với mục tiêu chính: - Xây