Xây dựng quy trình định lượng alanine trong mẫu thử và khảo sát ảnh hưởng của alanine đến quá trình kết tinh glutamic acid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ CƠNG MINH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALANINE TRONG MẪU THỬ VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ALANINE ĐẾN QUÁ TRÌNH KẾT TINH GLUTAMIC ACID Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 8520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 02 năm 2023 Cơng trình hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Huỳnh Khánh Duy Cán chấm nhận xét 1: TS Bùi Tấn Nghĩa Cán chấm nhận xét 2: PGS.TS Trương Vũ Thanh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG Tp HCM ngày 05 tháng 02 năm 2023 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Hoàng Thị Kim Dung Cán chấm nhận xét 1: TS Bùi Tấn Nghĩa Cán chấm nhận xét 2: PGS.TS Trương Vũ Thanh Ủy viên: TS Phan Thị Hoàng Anh Thư ký: TS Nguyễn Đăng Khoa Xác nhận Chủ tịch hội đồng đánh giá LV Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Công Minh MSHV: 2070036 Ngày, tháng, năm sinh: 10/04/1997 Nơi sinh: Trà Vinh Chuyên ngành: Kỹ thuật Hoá học Mã số: 8520301 I TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình định lượng Alanine mẫu thử khảo sát ảnh hưởng Alanine đến trình kết tinh Glutamic acid Establish a quantitative method of Alanine in the sample and investigate the effects of Alanine on the crystallization of Glutamic acid NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Phát triển phương pháp phân tích sắc ký đầu dị huỳnh quang nhằm phân tích đồng phân L-Alanine D-Alanine; định lượng hàm lượng chúng mẫu thử - Khảo sát ảnh hưởng Alanine đến trình kết tinh Glutamic acid II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 25/11/2022 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Huỳnh Khánh Duy Tp HCM, ngày … tháng ….năm CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TS Huỳnh Khánh Duy PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc chân thành đến TS Huỳnh Khánh Duy, thầy hướng dẫn tận tình q trình tơi thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất quý thầy cô, cán công tác Khoa Kỹ thuật Hóa học tận tình giảng dạy cung cấp kiến thức chuyên môn cần thiết suốt khố học Tơi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị em đồng nghiệp hỗ trợ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt luận văn Cuối xin cảm ơn gia đình ln bên cạnh động viên, ủng hộ trở thành chỗ dựa vững cho đường học vấn Cảm ơn người bạn giúp đỡ, hỗ trợ suốt trình thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! ii TÓM TẮT Đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng Alanine mẫu thử khảo sát ảnh hưởng Alanine đến trình kết tinh Glutamic acid Thông qua kết thực hiện, luận văn xác định điều kiện sắc ký phù hợp để định lượng Alanine mẫu thử: pha tĩnh cột MCI Gel CRS10W (3 µm, 50 x 4,6 mm), pha động dung dịch CuSO4 0,1 mM Phương pháp thẩm định đạt tiêu chí đánh giá Với ưu điểm phân tách đồng phân L-Alanine D-Alanine mẫu thử với độ nhạy độ xác cao giúp nâng cao hiệu phân tích Đề tài khảo sát ảnh hưởng Alanine đến q trình kết tinh Glutamic acid, từ kết luận Alanine có vai trị kích thích tăng trưởng kích thước tinh thể, nâng cao hiệu suất li tâm giảm thất thoát sản phẩm ABSTRACTS The topic of this thesis is to develop a quantification process for Alanine in the sample and investigate the influence of Alanine on the crystallization process of Glutamic acid Based on the results obtained, the thesis identified the appropriate chromatographic conditions to quantify Alanine in the sample: the stationary phase is MCI Gel CRS10W column (3 µm, 50 x 4.6 mm), and the mobile phase is CuSO4 0,1 mM solution The method has been evaluated and met the evaluation criteria With the advantage of separating L-Alanine and D-Alanine isomers in the sample with high sensitivity and accuracy, the efficiency of the analysis is enhanced The thesis also investigated the effect of Alanine on the crystallization process of Glutamic acid and concluded that Alanine plays a role in stimulating the growth of crystal size, increasing the efficiency of centrifugation and reducing the loss of products iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực nghiên cứu cảm ơn, số liệu sử dụng phân tích có nguồn gốc trích dẫn rõ ràng theo quy định TP.Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2022 Tác giả Lê Công Minh iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG ix ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Glutamic acid 1.1.1 Cấu trúc hóa học 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Ứng dụng vai trò glutamic acid 1.1.4 Phương pháp sản xuất Glutamic acid 1.1.5 Những nghiên cứu trình kết tinh Glutamic acid 1.2 Tổng quan Alanine 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Tính chất hóa lý 1.2.3 Ứng dụng vai trò của Alanine 10 1.2.4 Những nghiên cứu trước định lượng Alanine 12 1.3 Tổng quan sắc ký lỏng 15 1.4 Thông số đánh giá hiệu sắc ký 17 1.5 Sắc ký trao đổi ligand 19 1.6 Thẩm định phương pháp 20 1.6.1 Tính đặc hiệu 21 1.6.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 22 1.6.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 25 1.6.4 Độ xác (accuracy) 27 1.6.5 Độ chụm (precision) 28 1.6.6 Độ (trueness) 29 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 32 v 2.1 Mục tiêu – nội dung nghiên cứu 32 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 32 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32 2.2 Hóa chất – thiết bị 32 2.2.1 Hóa chất 32 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 32 2.3 Phương pháp thực nghiệm 33 2.3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine mẫu thử 33 2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp 33 2.3.1.2 Thẩm định phương pháp 37 2.3.1.3 Khảo sát độ bền dung dịch chuẩn 39 2.3.1.4 So sánh kết phân tích phương pháp nội phương pháp đối chứng 39 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng Alanine đến quy trình kết tinh Glutamic acid 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ 45 3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine mẫu thử 45 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp 45 3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích 48 3.1.3 Khảo sát độ bền dung dịch chuẩn 54 3.1.4 So sánh kết phân tích phương pháp nội phương pháp phân tích đối chứng 55 3.2 Nội dung : Khảo sát ảnh hưởng alanine đến quy trình kết tinh glutamic acid 56 3.2.1 Khảo sát điều kiện kết tinh phù hợp 56 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng đồng phân quang học Ala 58 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Ala 60 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 70 vi DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile Ala Alanine AOAC Association of Official Analytical Chemists - Hiệp hội nhà hoá phân tích thống D-Ala D-Alanine D-Glu D-Glutamic Glu Glutamic acid HPLC High Performance Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng hiệu cao L-Ala L-Alanine L-Glu L-Glutamic LEC Ligand exchange chromatography – Sắc ký trao đổi ligand LOD Limit of detection – Giới hạn phát LOQ Limit of quantification – Giới hạn định lượng MSG Monosodium Glutamate – Bột ngọt/mì OPA ortho-Phthalaldehyde UV – VIS Ultra Violet – Visible acid acid vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu tạo phân tử glutamic acid Hình 1.2: Sản lượng amino acid (đơn vị: nghìn tấn) [3] Hình 1.3: Tỷ lệ tinh thể dạng a-Glu có diện amino acid [15] Hình 1.4: Cấu trúc hóa học Alanine Hình 1.5: (S)-Alanine (trái) (R)-Alanine (phải) Hình 1.6: Chu trình Alanine [18] 12 Hình 1.7: Sắc kí đồ phân tích amino acid GC-qMS [23] 13 Hình 1.8: Sắc kí đồ phân tích amino acid HPLC đầu dị huỳnh quang [24] 14 Hình 1.9: Hình minh họa peak kéo đuôi [26] 18 Hình 1.10: Cơ chế tạo dẫn xuất phù hợp [26] 20 Hình 1.11: Minh họa số S/N [26] 26 Hình 1.12: Minh họa khái niệm độ chụm, độ đúng, độ xác [26] 28 Hình 2.1: Quy trình kết tinh glutamic acid 42 Hình 3.1: Khảo sát bước sóng phát xạ 45 Hình 3.2: Khảo sát bước sóng kích thích 45 Hình 3.3: Khảo sát nồng độ CuSO4 46 Hình 3.4: Khảo sát tốc độ dòng 47 Hình 3.5: Khảo sát nhiệt độ cột 47 Hình 3.6: Khảo sát thể tích tiêm mẫu 48 Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu trắng 49 Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn DL-Ala 4,0 ppm 49 Hình 3.9: Đường chuẩn D-Ala 50 Hình 3.10: Đường chuẩn L-Ala 50 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu Ala nguyên liệu 56 Hình 3.12: Thí nghiệm kết tinh Glu bể điều nhiệt 57 Hình 3.13: Khảo sát điều kiện kết tinh Glu 57 Hình 3.14: Ảnh hưởng đồng phân Ala đến hiệu suất kết tinh 58 Hình 3.15: Ảnh hưởng đồng phân Ala đến hiệu suất li tâm 59 Hình 3.16: Ảnh hưởng đồng phân Ala đến kích thước tinh thể Glu 59 Hình 3.17: Ảnh chụp kính hiển vi tinh thể Glu (độ phóng đại: 10 lần) a) Mẫu đối chứng b) D-Ala c) DL-Ala d) L-Ala 59 Hình 3.18: Nồng độ Ala tinh thể Glu sau li tâm 60 Hình 3.19: Ảnh hưởng nồng độ Ala đến hiệu suất kết tinh 61 Hình 3.20: Ảnh hưởng nồng độ Ala đến hiệu suất li tâm 61 Hình 3.21: Ảnh hưởng nồng độ Ala đến kích thước tinh thể Glu 62 Hình 3.22: Ảnh chụp kính hiển vi tinh thể Glu (độ phóng đại: 10 lần) a) Mẫu đối chứng b) L-Ala 100 ppm c) L-Ala 200 ppm d) L-Ala 400 ppm 62 Hình 3.23: Nồng độ Ala tinh thể Glu sau li tâm 63 viii 76 77 78 Phụ lục 2: Chứng nhận phân tích D-Ala L-Ala 79 80 Phụ lục 3: Sắc ký đồ kết phân tích Mẫu trắng Mẫu #1L Mẫu #2L 81 Mẫu NL Mẫu LC-1 Mẫu LC-2 82 Mẫu Ala CP Ala Back up 83 Phụ lục 4: Kết đo phân bố kích thước tinh thể Glu 84 85 86 87 88 89 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Lê Công Minh Ngày, tháng, năm sinh: 10/04/1997 Nơi sinh: Trà Vinh Địa liên lạc: ấp Ơng Yển, xã Hịa Minh, huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 2015 - 2019: Đại học quy, ngành Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP.HCM 2020 đến nay: Cao học quy, ngành Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP.HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC 11/2019 đến nay: Kỹ sư công nghệ lên men, Công ty Ajinomoto Việt Nam 90