Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh acid lactic của lactobacillus acidophilus

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L + - lactic .... Khảo sát phương pháp

DINH DƯỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH

ACID LACTIC CỦA

Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

LÊ THỊ MINH PHƯƠNG

Mã sinh viên: 1101398

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ

DINH DƯỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH

ACID LACTIC CỦA

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới

cô giáo TS.Đàm Thanh Xuân đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt những kiến

thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành

đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo DS.Lê Ngọc Khánh, thầy giáo

ThS.Nguyễn Khắc Tiệp và cô giáo ThS.Kiều Thị Hồng đã cho tôi những bài

học giá trị, nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu thực hiện khóa luận đến nay

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật

viên Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Vật lý & Hóa lý - Trường Đại

học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá

trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể Ban giám hiệu và các thầy cô giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học ở trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn luôn động viên, ủng hộ và hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Lê Thị Minh Phương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Acid lactic 2

1.1.1 Đặc điểm 2

1.1.2 Công dụng 4

1.2 Các phương pháp sản xuất acid lactic 5

1.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 5

1.2.2.Phương pháp sinh học 5

1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic 9

1.3.1 Đặc điểm của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 9

1.3.2 Chi Lactobacillus 9

1.3.3 Loài Lactobacillus acidophilus 10

1.4 Phương pháp xác định đồng phân quang học 12

1.4.1 Phương pháp xác định độ quay cực riêng 13

1.5 Một số nghiên cứu về điều chế acid lactic bằng phương pháp sinh tổng hợp từ vi sinh vật 13

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Thiết bị sử dụng 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) - lactic 17

2.2.2 Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu được và xác định góc quay cực riêng của acid lactic 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp nhân giống và nuôi cấy 18

2.3.2 Phương pháp tách chiết Calci lactat từ dịch lên men 19

2.3.3 Phương pháp Schoorl – Regenbogen định lượng đường [8] 19

2.3.4 Phương pháp tính hiệu suất quá trình sinh tổng hợp calci lactat [8] 20 2.3.5 Phương pháp xác định độ quay cực riêng của dung dịch chứa acid lactic [3] 20

2.3.6 Phương pháp định tính glucose 21

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 22

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) - lactic 22

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất sản phẩm sinh tổng hợp calci lactat 22

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng glucose được L.acidophilus tiêu thụ theo thời gian trong môi trường lên men chứa 10 % glucose 25

3.1.3 Lựa chọn thời điểm kết thúc quá trình lên men 26

3.2 Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu được và xác định góc quay cực riêng 283.2.1 Xác định sản phẩm calci lactat thu được sau khi lên men với nồng

độ glucose lần lượt là 1 % và 2 % 283.2.2 Quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu được 293.2.3 Sơ bộ xác định góc quay cực của acid lactic sau khi được tinh chế

từ calci lactat ở các nồng độ glucose khác nhau 31KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁCCHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection

(Trung tâm giữ giống Quốc gia Mỹ) DĐVN Dược điển Việt Nam

HPLC High Performance Liquid Chromatography

MRS De Man, Rogosa, Sharpe

L.acidophilus Lactobacillus acidophilus

PLA Poly acid lactic

tt

vd

Thể tích Vừa đủ

điện tử (b) Hình 3.1 Biểu đồ biến thiên hiệu suất tạo calci lactat trong dịch nuôi cấy

theo lượng glucose khởi điểm trong môi trường nuôi cấy Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat

DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC ĐỒ THỊ

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất

Bảng 2.2 Môi trường nhân giống MRS và lên men

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng

Bảng 3.1 Kết quả lượng sản phẩm calci lactat thu được sau khi thay đổi

nồng độ glucose trong môi trường lên men Bảng 3.2 Kết quả hàm lượng glucose mà L acidophilus đã tiêu thụ theo

thời gian Bảng 3.3 Kết quả định tính lượng đường dư trong dịch lên men theo thời

điểm thu sản phẩm Bảng 3.4 Kết quả sản phẩm calci lactat thu được ở các nồng độ glucose

khác nhau Bảng 3.5 Kết quả đo góc quay cực của acid lactic tinh chế sau khi lên men

ở các nồng độ glucose

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các sản phẩm lên men hiện nay ngày càng được ứng dụng phổ biến trong mọi lĩnh vực của đời sống như dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm dệt may… Trong số các sản phẩm của công nghệ lên men, acid lactic và các dẫn xuất của nó là những sản phẩm có lịch sử lâu đời và ứng dụng rất rộng rãi [1], [6], [28]

Phương pháp tổng hợp hóa học acid lactic thường tạo ra dạng racemic Trong khi đó phương pháp vi sinh có thể tạo ra sản phẩm dạng acid L (+) lactic với hiệu suất cao và thân thiện với môi trường [17] Với các ưu điểm của phương pháp vi sinh vật cùng với nhu cầu thị trường ngày càng cao, những năm gần đây, nghiên cứu để tăng năng suất quá trình sinh tổng hợp acid lactic đã thu hút được nhiều sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Mục tiêu của các nghiên cứu này là thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp, nhằm thu được sản phẩm với hiệu suất cao [22]

Các yếu tố quyết định tới sự thành công của một quá trình sản xuất theo phương pháp sinh tổng hợp chính là dinh dưỡng, điều kiện quá trình và thiết

bị lên men Với mong muốn được góp phần vào các nghiên cứu cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp acid lactic, chúng tôi lựa chọn đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh acid lactic của

Lactobacillus acidophilus”, với các mục tiêu sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy

Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) –lactic

- Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat

thu được và xác định góc quay cực riêng

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Acid lactic

Khối lượng phân tử: 90,08g/mol

 Công thức cấu tạo:

 Các dạng của acid lactic

Trong phân tử của acid lactic có 1 carbon bất đối nên acid lactic có 1 cặp đối quang: acid D (-) - lactic, acid L (+) - lactic

Acid D (-) - lactic Acid L (+) - lactic

Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, nhưng chỉ khác nhau về khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái Do đó tính chất sinh học của chúng khác nhau

 Cấu trúc không gian

Acid lactic là hỗn hợp của 2 dạng đồng phân acid D (-) -lactic và acid L (+) -lactic

Acid D (-) - lactic Acid L (+) - lactic

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của acid D (-) - lactic và acid L (+) - lactic

Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị ánh sáng phân cực đi qua, các dạng phân cực có thể chuyển thành dạng acid racemic dưới tác dụng của enzym racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic Nếu acid D (-) - lactic và acid

L (+) - lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50 người ta gọi là hỗn hợp racemic Hỗn hợp này được kí hiệu là DL- lactic acid[1], [26]

 Tính chất của acid lactic

Ở dạng dung dịch: acid lactic là chất lỏng trong suốt, không màu, không mùi, vị chua đặc trưng, tan tốt trong nước, không bay hơi

Ở dạng tinh thể: dễ tan ở áp suất khí quyển tạo chất lỏng

Khi ở pha lỏng, acid lactic dễ chuyển sang dạng dime mạch thẳng lactoyl lactat và polyme mạch thẳng cao hơn, khi đó nhóm hydroxyl của phân

tử này liên kết ester với nhóm carbonyl của phân tử khác Dạng dimer mạch vòng lactic cũng có thể được hình thành nếu được thực hiện đun nóng kéo dài [1], [26]

Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao, là chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị trường ở những dạng khác nhau về chất lượng và phụ thuộc vào độ tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau như: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid lactic plastic Ở dạng đồng phân acid D (-) - lactic hoặc acid L (+) - lactic lần lượt có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi là 530C và

1220C[33], [36] Một trong những tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: khi đun nóng dung dịch chứa 80% acid lactic lên đến 1800C, ta thu được dung dịch không màu [1], [26]

Bên cạnh đó một dẫn xuất khác của acid lactic là magnesi lactat cũng

có vai trò rất quan trọng trong lĩnh vực y học Magnesi lactat tác động lên quá trình tăng trưởng, giống như vitamin D, nó giúp Calci và Phospho cố định trên xương [11], [30] Magnesi lactat còn được dùng trong điều trị đau cổ tử cung trong thai kì [15] hay cần thiết cho quá trình phát triển và hoạt động bình thường của tổ chức, đặc biệt liên quan đến chuyển hóa [31] và các hoạt động bình thường của não [34], [35]

b Trong công nghệ thực phẩm

Acid lactic thường được ứng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa như sữa chua, phomat… làm cho sản phẩm thêm giàu dinh dưỡng Đặc

biệt lên men sữa chua không chỉ giúp tăng giá trị dinh dưỡng mà còn có tác dụng điều trị bệnh đường ruột giúp ăn ngon dễ tiêu hóa

Ngoài ra, acid lactic dùng để sản xuất dưa chua, sản xuất tương hay được ứng dụng trong sản xuất các loại sữa bột và bột giàu calci dưới dạng calci lactat [1]

c Trong công nghiệp khác

Acid lactic và các dẫn xuất của nó (polylactid – nhựa sinh học PLA) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, công nghiệp dệt, tổng hợp vecni, nhựa gia công bằng nhiệt [28]

1.2.Các phương pháp sản xuất acid lactic

1.2.1.Phương pháp tổng hợp hóa học

Từ những năm 1960, các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất acid lactic bằng phương pháp tổng hợp hóa học Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi sản xuất acid lactic cho các ngành công nghiệp khác nhau [28]

 Cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd

Acetaldehyd hydrogen cyanid lactonitril

 Thủy phân lactonitril bằng acid sulfuric

2CH3CHOHCN + 4H2O + H2SO4

2CH3CHOHCOOH + (NH4)2SO4

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như thường tạo ra dạng acid racemic DL - lactic và acid D (-) - lactic Đây là các dạng gây hại với sức khỏe con người nên ít dùng [19], [21]

1.2.2.Phương pháp sinh học

Cơ sở của phương pháp sinh học là tiến hành lên men trong điều kiện

kị khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic Acid lactic

được tạo thành từ sự chuyển hóa mono hoặc disaccharid bước đầu đi theo con đường Embden - Mayerhoff – Parnas (hình 1.1) Sau đó, dưới điều kiện kỵ khí, acid piruvic sinh ra sẽ được khử hóa thành acid lactic dưới tác dụng của enzym lactat dehydrogenase Lactat dehydrogenase (LDH) của các vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid L (+) - hay D (-) -

lactic do khả năng lập thể hóa của sản phẩm (do gen ldhD hay ldhL quy định),

tùy theo chủng vi khuẩn lactic có loại gen nào thì sẽ cho sản phẩm tương ứng Gen mã hóa enzym L (+) - lactat dehydrogenase được nghiên cứu trên

Lactobacillus plantarum Gen mã hóa enzym D (-) - lactat dehydrogenase

được nghiên cứu trên Lactobacillus johnsonii[10]

Hình 1.2 Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và

dị hình (heterolactic) [10]

Cả hai dạng lên men tạo acid lactic từ hydratcarbon là đồng hình (homolactic) hay dị hình (heterolactic) Lên men lactic đồng hình khi lượng

acid lactic chiếm đại đa số do vi khuẩn lactic loại này có enzym aldolase nhưng không có enzym phosphoketolase Lên men dị hình khi lượng acid lactic chiếm tỷ lệ thấp, đi kèm với hỗn hợp các chất khác như acid lactic, acid formic hoặc CO2, do vi khuẩn lactic không có enzym aldolase nhưng có enzym phosphoketolase [10]

Phương pháp sinh tổng hợp acid lactic dựa trên quá trình lên men của

vi sinh vật đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và pH Trung hòa các acid

do các vi sinh vật tiết ra trong quá trình lên men là điều cần thiết do việc tạo

ra các acid sẽ làm giảm pH của môi trường lên men, gây bất lợi cho sự trao đổi chất của vi sinh vật và có thể làm quá trình lên men dừng lại Do vậy, việc

bổ sung các hợp chất của Calci hay Magnesi vào môi trường lên men sẽ giúp giữ pH ở giá trị thích hợp với sự phát triển của vi sinh vật Sau khoảng thời gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên men, kết tinh và tinh chế sẽ thu được sản phẩm Calci lactat hoặc Magnesi lactat Sau đó tiếp tục tiến hành quy trình chuyển thành acid lactic thông qua H2SO4 Thực chất quá trình lên men tạo acid lactic chính là phương pháp lên men vi sinh tạo Calci lactat hay Magnesi lactat [12], [14], [16], [25]

Phương pháp sinh tổng hợp acid lactic từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tổng hợp hóa học [17], [20], [22], [29]

- Có khả năng tạo ra được dạng acid L (+) - lactic nhiều hơn

- Nhiệt độ sản xuất thấp, thiết bị và quy trình sản xuất đơn giản, dễ áp dụng trong điều kiện kinh tế Việt Nam

- An toàn với môi trường do các dư phẩm của quá trình được tận dụng để làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc hoặc phân bón

1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic

1.3.1 Đặc điểm của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic

Vi khuẩn sinh Lactic gồm các trực khuẩn hay cầu khuẩn Gram (+), tỉ lệ

GC (guanin và cystein) thấp, chịu được acid, thường không sinh nha bào, kị khí hoặc vi hiếu khí, được phân nhóm dựa vào đặc điểm chung trong quá trình trao đổi chất và các đặc tính sinh lý Ban đầu, các vi khuẩn này được tìm thấy trong thực vật đã phân hủy và các sản phẩm chứa acid lactic Điểm chung lớn nhất của vi khuẩn nhóm này là sự lên men hydratcarbon sinh ra acid lactic là sản phẩm trao đổi chất cuối cùng[4], [24]

Vi khuẩn sinh Lactic chủ yếu thuộc 4 chi: Lactobacillus, Pediococcus,

Streptococcus, Leuconostoc; ngoài ra có một số loài nấm thuộc chi Rhizopus[2], [10] Hình dạng và kích thước của vi khuẩn sinh Lactic rất đa

dạng và phức tạp: hình cầu, hình oval, hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc thành chuỗi Sinh lý của vi khuẩn Lactic khá giống nhau, chúng là các vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, hầu như không di động, ưa nhiệt, là vi khuẩn yếm khí hoặc vi hiếu khí, sử dụng năng lượng từ phân giải glucid và tiết ra acid lactic Chúng phát triển và tồn tại tốt ở pH thấp (4,5 – 6,8), nhiệt

độ khoảng 10 – 500C [2], [10]

Vi khuẩn Lactic là vi khuẩn dị dưỡng nên môi trường dinh dưỡng tương đối phức tạp, giàu chất dinh dưỡng gồm: các vitamin, các acid amin, các peptid ngắn… Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đường: glucose, saccarose, lactose, mantose… một vài loài cũng có khả năng sử dụng đường cao phân tử [2]

1.3.2 Chi Lactobacillus

Là chi lớn nhất trong các vi khuẩn sinh lactic với nhiều chủng đã được

nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất Chi Lactobacillus được phát hiện với

hơn 125 loài, dựa vào sự chuyển hóa glucid trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men, chia thành 3 nhóm chính[4]

 Nhóm 1: Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu là acid lactic (90 – 98%), các sản phẩm khác

chỉ tồn tại dạng vết nhỏ Đại diện: L acidophilus, L bulgaricus, L

delbrueckii…

 Nhóm 2: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình không bắt buộc, sản phẩm của quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic,

ethanol Đại diện: L plantarum, L casei, L leichmannii…

 Nhóm 3: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc, sản phẩm cuối cùng

là acid lactic, acid acetic, carbonic, ethanol Đại diện: L brevis, L

fermentum, L buchneri…

1.3.3 Loài Lactobacillus acidophilus

Loài L acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli,

bộ lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống Lactobacillus [4]

Hình 1.3 L acidophilus dưới kính hiển vi quang học (a),

kính hiển vi điện tử (b) [4]

Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), dạng hình que, mọc

đơn, mọc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn, không có lông roi, không sinh bào tử, không di động, phản ứng catalase âm tính, không ưa muối, ưa acid, phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt thấp và có khả năng kháng lysozym, hô hấp hiếu khí và kị khí nhưng chủ yếu là kị khí Do đó môi trường nuôi cấy thường là kị khí hoặc là giảm áp oxy với 5 – 10 % CO2, là vi khuẩn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao (ở 45oC), tuy nhiên nhiệt độ tối ưu để phát triển là

370C, không phát triển trong khoảng 20 – 22oC Là đại diện chính của nhóm

vi khuẩn sinh acid lactic, nó có khả năng chịu được điều kiện môi trường acid

trong khoảng pH thấp (5 – 6) trong thời gian 24 – 36 giờ [2], [10] L

acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình có khả năng chuyển hóa

hydratcarbon: fructose,glucose,lactose… [10]

Lactobacillus acidophilus là vi sinh vật probiotic, chúng là các vi

khuẩn có lợi trong hệ thống tiêu hóa giúp chống lại vi khuẩn có hại gây bệnh,

góp phần duy trì hệ vi khuẩn có lợi Lactobacillus acidophilus được phân lập

từ dịch ruột trẻ em và dịch ruột bê

Hiện nay, Lactobacillus acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế

phẩm men tiêu hóa như: Antibio, Lactomin… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa ở trẻ mới ăn dặm hoặc do dùng kháng sinh dài ngày [7]

1.4 Phương pháp xác định đồng phân quang học

Mỗi cặp đối quang sẽ quay mặt phẳng ánh sáng phân cực những góc bằng nhau, nhưng ngược chiều nhau Một chất có tính hoạt quang khi số lượng đối quang này nhiều hơn đối quang kia Xác định thành phần đối quang của một chất là rất quan trọng trong tổng hợp bất đối [27]

Thành phần đối quang của một mẫu có thể được thể hiện thông qua giá trị ee (enantimer exess) là phần nhiều hơn của một đối quang này so với đối quang còn lại

Trong đó [S], [R] lần lượt là đồng phân S, R

Tương tự như vậy, thành phần các đồng phân lập thể không đối quang được thể hiện qua giá trị de (diastereomer excess) là phần nhiều hơn của một đồng phân lập thể không đối quang này so với đồng phân kia

Trong đó [S*S] và [S*R] lần lượt là lượng của các đồng phân lập thể không đối quang

Có nhiều phương pháp để xác định thành phần của các đối quang của một đôi đồng phân quang học.Một số phương pháp định lượng được áp dụng cho phân tử gốc và một số phương pháp khác được áp dụng cho các dẫn xuất của các hợp chất cần xác định Các phương pháp hiện nay bao gồm: phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di mao quản

và phương pháp xác định độ quay cực riêng

1.4.1 Phương pháp xác định độ quay cực riêng

Để đặc trưng cho tính quang hoạt của một chất, người ta dùng độ quay cực riêng tính theo công thức (a) đối với chất lỏng nguyên chất, công thức (b) đối với chất trong dung dịch [9]

Trong đó:

α là góc quay cực đo được (0)

L là độ dài của ống đựng chất (dm)

c là nồng độ (g/100ml)

λ là độ dài sóng (thường là 589 nm, vạch D của Na)

to nhiệt độ khi đo (oC)

d là tỷ trọng của chất lỏng (g/ml)

Đối với hợp chất bất kỳ mà góc quay cực của một đối quang tinh khiết của nó đã biết thì giá trị ee có thể xác định trực tiếp từ góc quay cực xác định theo công thức (c) [27]

Độ tinh khiết quang học = [ ]

[ ] % (c)

Trong đó:

αobs là độ quay cực xác định được

αmax là độ quay cực của mẫu tinh khiết đối quang

1.5 Một số nghiên cứu về điều chế acid lactic bằng phương pháp sinh tổng hợp từvi sinh vật

a Nghiên cứu ở nước ngoài

Garvie Ellen và các cộng sự (1967) đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid L (+) - lactic và D (-) - lactic

bằng cách lên men một số vi khuẩn sinh acid lactic, với nghiên cứu đặc biệt

trên Lactobacillus acidophilus [17]

Kamila Goderska và các cộng sự (2008) đã tiến hành đánh giá khả năng

sinh acid L (+) - lactic và D (-) - lactic của Lactobacillus acidophilus DSM

20079 trong các môi trường ở các nồng độ khác nhau của một số loại đường Kết quả cho thấy môi trường MRS không chứa carbohydrat sinh nhiều acid L (+) - lactic nhất rồi đến inulin, saccarose, lactose, glucose ( 68% dạng L, thời gian nuôi cấy 48h, pH 6,6) và cuối cùng là fructose [22]

Hoshino và cộng sự đã nghiên cứu lên men với chủng

Lactobacilluscasei từ nguyên liệu là tinh bột Sử dụng enzyme amylase để

thủy phân tinh bột Duy trì tốc độ pha loãng thích hợp, nồng độ acid lactic cao nhất là 31g/l sau 144h lên men [23]

Roukas và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất acid lactic từ nước sữa đã

tách bơ và protein, sử dụng chủng Lactobacillus casei và chủng Lactococcus

lactis Nồng độ acid lactic cao nhất là 41g/l có thể đạt được sau 48h lên men

[32]

b Nghiên cứu trong nước

Lê Thị Thu Hiền đã tiến hành cố định tế bào L.acidophilus trên chất

mang alginat làm cơ sở cho quá trình lên men liên tục sinh tổng hợp acid lactic và calci lactat [5]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Chủng giống: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 dạng đông khô

Nguyên liệu và hóa chất

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu,

hóa chất Nguồn gốc

Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc

Sữa bột Việt Nam NaK(C4H4O6) Trung Quốc Cao nấm men Merck – Đức H2SO4 98% Trung Quốc (NH4)2SO4 Trung Quốc Na2S2O3 Trung Quốc

KH2PO4 Trung Quốc Cao thịt Merck – Đức MnSO4.H2O Trung Quốc Pepton Merck – Đức FeSO4.7H2O Trung Quốc HCl Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc CuSO4 Trung Quốc