Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh acid lactic của lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ THỊ MINH PHƯƠNG Mã sinh viên: 1101398 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ DINH DƯỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ MINH PHƯƠNG Mã sinh viên: 1101398 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ DINH DƯỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo TS.Đàm Thanh Xuân hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm bảo giúp đỡ hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo DS.Lê Ngọc Khánh, thầy giáo ThS.Nguyễn Khắc Tiệp cô giáo ThS.Kiều Thị Hồng cho học giá trị, nhiệt tình bảo giúp đỡ từ ngày đầu thực khóa luận đến Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược Bộ môn Vật lý & Hóa lý - Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu làm thực nghiệm môn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể Ban giám hiệu thầy cô giáo trường dạy dỗ dìu dắt suốt năm học trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người luôn động viên, ủng hộ hết lòng giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Lê Thị Minh Phương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Acid lactic 1.1.1 Đặc điểm 1.1.2 Công dụng 1.2 Các phương pháp sản xuất acid lactic 1.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 1.2.2.Phương pháp sinh học 1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic 1.3.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 1.3.2 Chi Lactobacillus 1.3.3 Loài Lactobacillus acidophilus 10 1.4 Phương pháp xác định đồng phân quang học 12 1.4.1 Phương pháp xác định độ quay cực riêng 13 1.5 Một số nghiên cứu điều chế acid lactic phương pháp sinh tổng hợp từ vi sinh vật 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.2 Thiết bị sử dụng 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) - lactic 17 2.2.2 Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu xác định góc quay cực riêng acid lactic 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp nhân giống nuôi cấy 18 2.3.2 Phương pháp tách chiết Calci lactat từ dịch lên men 19 2.3.3 Phương pháp Schoorl – Regenbogen định lượng đường [8] 19 2.3.4 Phương pháp tính hiệu suất trình sinh tổng hợp calci lactat [8] 20 2.3.5 Phương pháp xác định độ quay cực riêng dung dịch chứa acid lactic [3] 20 2.3.6 Phương pháp định tính glucose 21 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 22 3.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) - lactic 22 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose tới hiệu suất sản phẩm sinh tổng hợp calci lactat 22 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng glucose L.acidophilus tiêu thụ theo thời gian môi trường lên men chứa 10 % glucose 25 3.1.3 Lựa chọn thời điểm kết thúc trình lên men 26 3.2 Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu xác định góc quay cực riêng 28 3.2.1 Xác định sản phẩm calci lactat thu sau lên men với nồng độ glucose % % 28 3.2.2 Quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu 29 3.2.3 Sơ xác định góc quay cực acid lactic sau tinh chế từ calci lactat nồng độ glucose khác 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁCCHỮ VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Collection (Trung tâm giữ giống Quốc gia Mỹ) DĐVN Dược điển Việt Nam HPLC High Performance Liquid Chromatography kl Khối lượng MRS De Man, Rogosa, Sharpe L.acidophilus Lactobacillus acidophilus PLA Poly acid lactic tt Thể tích vd Vừa đủ VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Hình 1.1 Cấu trúc không gian acid D (-) - lactic acid L (+) - lactic Hình 1.2 Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) dị hình (heterolactic) Hình 1.3 L acidophilus kính hiển vi quang học (a), kính hiển vi điện tử (b) Hình 3.1 Biểu đồ biến thiên hiệu suất tạo calci lactat dịch nuôi cấy theo lượng glucose khởi điểm môi trường nuôi cấy Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC ĐỒ THỊ Tên bảng Nội dung Bảng 2.1 Các nguyên liệu hóa chất Bảng 2.2 Môi trường nhân giống MRS lên men Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng Bảng 3.1 Kết lượng sản phẩm calci lactat thu sau thay đổi nồng độ glucose môi trường lên men Bảng 3.2 Kết hàm lượng glucose mà L acidophilus tiêu thụ theo thời gian Bảng 3.3 Kết định tính lượng đường dư dịch lên men theo thời điểm thu sản phẩm Bảng 3.4 Kết sản phẩm calci lactat thu nồng độ glucose khác Bảng 3.5 Kết đo góc quay cực acid lactic tinh chế sau lên men nồng độ glucose ĐẶT VẤN ĐỀ Các sản phẩm lên men ngày ứng dụng phổ biến lĩnh vực đời sống dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm dệt may… Trong số sản phẩm công nghệ lên men, acid lactic dẫn xuất sản phẩm có lịch sử lâu đời ứng dụng rộng rãi [1], [6], [28] Phương pháp tổng hợp hóa học acid lactic thường tạo dạng racemic Trong phương pháp vi sinh tạo sản phẩm dạng acid L (+) lactic với hiệu suất cao thân thiện với môi trường [17] Với ưu điểm phương pháp vi sinh vật với nhu cầu thị trường ngày cao, năm gần đây, nghiên cứu để tăng suất trình sinh tổng hợp acid lactic thu hút nhiều ý nhiều nhà khoa học giới nói chung Việt Nam nói riêng Mục tiêu nghiên cứu thay đổi yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp, nhằm thu sản phẩm với hiệu suất cao [22] Các yếu tố định tới thành công trình sản xuất theo phương pháp sinh tổng hợp dinh dưỡng, điều kiện trình thiết bị lên men Với mong muốn góp phần vào nghiên cứu cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp acid lactic, lựa chọn đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy dinh dưỡng đến khả sinh acid lactic Lactobacillus acidophilus”, với mục tiêu sau: - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) –lactic - Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu xác định góc quay cực riêng 25 Như vậy, với nồng độ glucose 10% môi trường lên men lượng calci lactat thu đạt giá trị lớn Nồng độ glucose 10% lựa chọn áp dụng cho thí nghiệm 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng glucose L.acidophilus tiêu thụ theo thời gian môi trường lên men chứa 10% glucose Theo số nghiên cứu khả sinh acid lactic L acidophilus công bố, L.acidophilus thuộc loại vi sinh vật có khả chuyển hóa glucose cho sản phẩm chứa acid L (+) - lactic nhiều vòng 48 nuôi cấy đầu tiên[17], [22] Vì thí nghiệm thiết kế với: Mục tiêu: xác định lượng glucose tiêu thụtrong vòng 48 với môi trường lên men chứa 10% nồng độ glucose Tiến hành:lên men L acidophilustrong bình nón 250ml chứa 100ml môi trường lên men với nồng độ glucose 10% Nuôi cấy tủ ấm CO2 370C vòng 96 giờ.Định lượng hàm lượng đường tiêu thụ thời điểm 24 giờ, 48 96 Kết thực nghiệm: thể bảng sau (bảng 3.2): Bảng 3.2 Kết hàm lượng glucose mà L.acidophilus tiêu thụ theo thời gian Thời gian lên men (giờ) 24 48 96 Nồng độ glucose khởi điểm (%) 9,30 9,30 9,30 Nồng độ glucose kết thúc (%) 8,32 7,29 0,00 Nồng độ glucose tiêu thụ (%) 0,98 2,01 9,30 Nhận xét bàn luận: Dựa vào kết định lượng nồng độ glucose khởi điểm nồng độ glucose kết thúc dịch nuôi cấy, lượng đường mà L.acidophillus tiêu thụ 26 tăng dần vòng 24 giờ, 48 96 0,98%, 2,01 % 9.3% Trong 24 đầu tiên, L acidophilusđang phát triển giai đoạn pha log Acid lactic sản phẩm cuối cùng, sinh trình lên men nên 24 có acid lactic dịch nuôi cấy.Tuy nhiên đến 48 giờ, lượng acid lactic dịch nhiều Bên cạnh sau 48 nuôi cấy, L acidophilusmới tiêu thụ glucose Lượng glucose dư dịch lên men nhiều ảnh hưởng đến việc đo góc quay cực riêng acid lactic glucose chất có góc quay cực riêng lớn [3] Các nghiên cứu giới công bốchủngL.acidophilus nuôi cấy vòng 48 sinh 68% acid L (+) - lactic [22] nuôi cấy vòng 13,5 sinh 91% dạng acid L (+) - lactic [17] Điều có nghĩa theo tác giả vòng 48 nuôi cấy đầu tiên, lượng acid L (+) - lactic sinh nhiều Có thể dựa vào kết thực nghiệm trên, lựa chọn lượng glucose 1% 2% để tiến hành thí nghiệm 3.1.3 Lựa chọn thời điểm kết thúc trình lên men Sau lên men, acid lactic cần làm tinh khiết Điều phụ thuộc nhiều vào yếu tố dinh dưỡng VSV nuôi cấy Các tạp sau lên men bao gồm protein, cations, anions, đường…[18] Đặc biệt loại tạp đường dư vô quan trọng glucose có góc quay cực riêng lớn [3], ảnh hưởng sử dụng phép đo góc quay cực riêng sử dụng để định lượng acid L (+) - lactic Do vậy, nghiên cứu khảo sát với: Mục tiêu: khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến việc loại tạp đường Từ lựa chọn thời điểm thích hợp kết thúc trình lên men để thu hiệu suất cao 27 Tiến hành: Lên men L.acidophilus theo phương pháp lựa chọn từ kết nghiên cứu mục 3.1.1 (lên men với nồng độ glucose 10%) kết mục 3.1.2 (lên men mẫu với nồng độ glucose 1%, 2%), định tính đường dư thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 120 Kết thực nghiệm: trình bày bảng sau (bảng 3.3) Bảng 3.3 Kết định tính lượng đường dư dịch lên mentheo thời điểm thu sản phẩm Thời điểm thu sản phẩm (giờ) 24 48 72 96 120 Mẫu % + + + - - Mẫu % + + + - - Mẫu 10% + + + - - Chú thích: (+): dương tính, glucose dịch lên men (-): âm tính, không glucose dịch lên men Nhận xét bàn luận: Kết bảng 3.3 cho thấy, mẫu lên men với nồng độ glucose 1%, 2% 10% nuôi cấy vòng 72 đầu tiên, định tính dịch nuôi cấy glucose dư Từ thứ 96 trở đi, kết định tính cho thấy không glucose dư dịch nuôi cấy Do vậy, nghiên cứu định chọn khoảng thời gian 96 làm thời điểm kết thúc trình lên men Sau lên men 96 giờ, tiếp tục xử lý thu calci lactat từ dịch lên men theo phương pháp nêu mục 2.3.2 Phương pháp áp dụng cho nghiên cứu Thời gian lên men VSV phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trung bình thời gian lên men mẻ sản xuất acid lactic công nghiệp từ đến ngày [1] tùy thuộc vào loài VSV sử dụng nuôi cấy khác loại B coagulans khoảng 11 đến 19 [13], chủng L acidophilus nuôi cấy 48 28 tùy theo mục đích thu sản phẩm dạng D (-) - lactic hay dạng L (+) – lactic [17] Do vậy, sau lựa chọn điều kiện lên men khác như: chủng VSV, loại đường, nồng độ đường… thời gian lên men yếu tố lựa chọn cuối Thời điểm tốt để thu sản phẩm thời điểm ngắn cho loại bỏ tạp nhiều Nếu chọn thời điểm trước 72 dịch lên men glucose Lượng glucose dư ảnh hưởng đến việc đo góc quay cực riêng acid lactic góc quay cực riêng glucose lớn [3] Còn thời điểm 96 đến 120 không glucose dịch lên men kéo dài thời gian nuôi cấy làm tăng khả nhiễm trùng, tốn lượng trì điều kiện lên men nhân công Vì vậy, cân ưu điểm nhược điểm, nghiên cứu chọn thời điểm 96 thời điểm kết thúc trình lên men 3.2 Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu xác định góc quay cực riêng 3.2.1 Xác định sản phẩm calci lactat thu sau lên men với nồng độ glucose % 2% Mục tiêu: thu sản phẩm calci lactat sau lên men với nồng độ glucose khác Tiến hành: lên men L acidophilus bình nón 750ml chứa 500ml môi trường lên men với nồng độ glucose 1%, 2% Nuôi cấy tủ ấm CO2 370C vòng 96 Sau 96 giờ, tiến hành xử lý dịch lên men, tinh chế thu sản phẩm calci lactat theo phương pháp nêu mục 2.1.3 Định lượng nồng độ glucose khởi điểm kết thúc dịch nuôi cấy để tính hiệu suất sinh tổng hợp calci lactat Kết thực nghiệm: trình bày bảng sau (bảng 3.4) 29 Bảng 3.4 Kết sản phẩm calci lactat thu nồng độ glucose khác Nồng độ glucose 1% 2% 0,95 1,93 Nồng độ glucose kết thúc (%) 0 Nồng độ glucose kết thúc (%) 0,95 1,93 Khối lượng calci lactat (%) 0,54 1,47 Hiệu suất sinh calci lactat (%) 33,22 44,51 Nồng độ glucose khởi điểm (%) Nhận xét bàn luận: Các số liệu bảng 3.4, lên men L acidophilus môi trường lên men với nồng độ glucose tăng dần từ % đến 2% lượng sản phẩm calci lactat thu tăng dần Với môi trường lên men có chứa 1% % có chứa glucose với hàm lượng Khi tiến hành nuôi cấy L acidophilustrong bình nón 250ml có chứa 100ml môi trường với nồng độ glucose 1% 2%, sản phẩm calci lactat thu Như khó khăn cho việc tách chiết sang acid latic Thí nghiệm thiết kế lên men với 500 ml môi trường làm cho môi trường giàu dinh dưỡng hơn, VSV tăng khả đồng hóa Do vậy, sản phẩm thu sau trình lên men tăng cao nồng độ 2% so với nồng độ 1% 3.2.2.Quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu Mục tiêu: tách chiết acid lactic từ sản phẩm thu được, từ tạo điều kiện cho việc xác định góc quay cực riêng nhằm xác định acid lactic tồn dạng D (-) – lactic; L (+) – lactic hay hỗn hợp racemic Tiến hành: tiến hành theo quy trình trình bày hình 3.2 30 Calci lactat Hòa tan Nước nóng Dung dịch Calci lactat Đun cách thủy 10 phút, Than hoạt 2% Lọc nóng Burchner Than hoạt Dịch pH=3-4 Làm lạnh H2SO4 loãng 25% Dung dịch gồm CaSO4, acid lactic calci lactat Aceton Lọc loại tủa CaSO4 Dịch acid lactic/ H2O / aceton Cất quay chân không 500C Sản phẩm acid lactic/ H2O Hình 3.2.Sơ đồ quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat 31 Giai đoạn : tách chiết acid lactic Thực tách chiết acid lactic với mẫu sản phẩm calci lactat sau lên men L acidophilus với nồng độ glucose %, % 10 % sau sấy khô theo nguyên tắc sử dụng acid H2SO4 để giải phóng acid lactic từ calci lactat Hòa tan calci lactat mẫu nước nóng đến tan hoàn toàn Bổ sung 2% (kl/tt) than hoạt vào dung dịch để tẩy màu, đun cách thủy 10 phút sau lọc nóng phễu Burchner loại bỏ than hoạt thu dịch lọc Đưa dịch lọc nhiệt độ phòng Thêm từ từ dung dịch H2SO4 loãng 25% từ từ đến đạt pH = 3-4 Thêm tiếp dung dịch aceton vào để tủa muối CaSO4.Để yên vòng 30 phút để kết tủa lắng xuống Lọc loại tủa CaSO4thu dịch có chứa acid lactic aceton Cất quay chân không 500C để thu hồi aceton, thu dung dịch suốt chứa acid lactic Việc sử dụng H2SO4 có tác dụng giải phóng acid lactic từ calci lactat thu giải phóng nhiều calci sulfat [25] Calci sulfat chất thải rắn, bị kết tủa aceton, nhiên nghiên cứu gặp số khó khăn sau loại tủa CaSO4, thử sơ dung dịch thu với H2SO4 xuất kết tủa trắng (CaSO4) Điều có nghĩ chưa thực loại hết ion Ca2+ dịch tinh chế Việc chưa loại hết ion Ca2+ ảnh hưởng đến việc đo góc quay cực riêng thành phần dung dịch chứa chất tan acid lactic 3.2.3 Sơ xác định góc quay cực acid lactic sau tinh chế từ calci lactat nồng độ glucose khác Các nghiên cứu công bố giới sử dụng phương pháp HPLC, GC… để định lượng hàm lượng acic L (+) – D (-) – lactic [17], [22].Với điều kiện nghiên cứu hạn chế, nghiên cứu định sử dụng 32 phương pháp đo góc quay cực riêng để định lượng hàm lượng acid L (+) – lactic D (-) – lactic Mục tiêu: định lượng hàm lượng acid L (+) – lactic acid D (-) – lactic dung dịch acid lactic thu sau tinh chế mục 3.2.2 Tiến hành:Sản phẩm calci lactat sau nuôi cấy L acidophilus với môi trường lên men với nồng độ glucose 1%, 2% 10 % thu được, sử dụng để điều chế thành dung dịch có chứa acid lactic nước Tiến hành đo góc quay cực dung dịch acid lactic nước nhiệt độ 200C với chiều dài ống đựng chất lỏng dm Kết thực nghiệm: trình bày bảng (bảng 3.5) Bảng 3.5 Kết đo góc quay cực acid lactic tinh chế sau lên men nồng độ glucose 1% 2% 10% Nồng độ glucose (mẫu 1) (mẫu 2) (mẫu 3) Lượng calci lactat (g) 0,5 1,4 H20 (ml) 20 20 50 Góc quay cực đo Số mililit dung dịch acid lactic/ -0,1 Nhận xét bàn luận: Nghiên cứu sử dụng sản phẩm calci lactat sau nuôi cấy L acidophilus môi trường lên men với nồng độ glucose 1%, 2% 10% điều chế theo phương pháp mục 3.2.2 Tuy nhiên nồng độ acid lactic dung dịch với dung môi nước cất chưa tính toán Phép đo góc quay cực riêng thực tương đối nhanh lại bị hạn chế nhiều yếu tố như: độ dài bước sóng ánh sáng phân cực, có mặt 33 hay không dung môi, dung môi để đo, nồng độ dung dịch, nhiệt độ tiến hành có mặt tạp chất có góc quay cực riêng lớn Như nồng độ acid lactic loãng điều kiện thiết bị không cho phép dẫn đếngây sai số xác định góc quay cực riêng Mặt khác bên cạnh chưa xác định nồng độ dung dịch acid lactic với khó khăn chưa chuẩn bị dạng chất chuẩn D (-) - lactic L (+) – lactic nên việc xác định góc quay cực riêng [α]D20 acid lactic phần trăm dạng D (-) - lactic L (+) – lactic mẫu chưa thể tiến hành Đây hạn chế khó khăn lớn thực nghiên cứu 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Sau thời gian thực đề tài, nghiên cứu đạt số kết sau: Đã lựa chọn số điều kiện trình nuôi cấy Lactobacillus acidophilus sinh tổng hợp theo hướng tạo L-calci lactat quy mô phòng thí nghiệm  Đã lựa chọn nồng độ glucose bổ sung môi trường lên men % %  Lựa chọn thời gian nuôi cấy 24 48 Nhưng thời điểm kết thúc trình lên men 96 cho L acidophilus tiêu thụ hết toàn glucose dịch lên men Bước đầu lựa chọn phương pháp tinh chế acid lactic từ calci lactat đo góc quay cực riêng acid lactic 200 C  Sử dụng H2SO4 loãng 25 % để chuyển calci lactat thành acid lactic, dùng aceton để loại CaSO4, cất quay chân không 500C để thu hồi aceton, thu dung dịch suốt chứa acid lactic với dung môi nước cất  Kết xác định góc quay cực dung dịch acid lactic tinh chế từ calci lactat sau lên men L acidophilusvới nồng độ glucose %, % 10 % vòng 96 Kết 00, (- 0.10), 00 II Kiến nghị Để đề tài có tính ứng dụng thực tế, xin đưa số đề xuất sau:  Tiếp tục nghiên cứu phương pháp nghiên cứu sinh tổng hợp acid lactic với chủng L acidophilus lên men với nồng độ glucose % % quy mô lớn 35  Nghiên cứu phương pháp loại bỏ hoàn toàn ion Ca2+ (CaSO4) trình sử dụng H2SO4 chất để chuyển calci lactat thành acid lactic  Tính toán nồng độ acid lactic dung dịch sau điều chế, tránh sai số trình đo góc quay cực riêng  Bên cạnh nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC, GC ứng dụng để định lượng dạng acid L (+) lactic acid D (-) lactic TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng việt Ngô Lâm Tuấn Anh (2010), Công nghệ sản xuất acid lactic, khóa luận tốt nghiệp, đại học Sư Phạm Kỹ Thuật thành phố Hồ Chí Minh, tr.2-54 Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.40-50 Bộ Y Tế (2012), Dược điển Việt Nam IV Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học phần I, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, tr.134-137 Lê Thị Thu Hiền (2012), "Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định chất mang alginat lên men sản xuất calci lactat", Tạp chí Hóa Học, tr.117-122 Lê Xuân Hoành (2006), Phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với vitamin B12, Luận văn thạc sỹ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.1-20 Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân (2013), Cơ sở công nghệ sinh học sản xuất dược phẩm, NXB Y Học, tr.42-54 Nguyễn Đình Luyện (2009), Thực tập kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.71-75 Đặng Như Tai (1998), Cơ sở hóa học lập thể, NXB Giáo Dục, tr.5-6, 25-26 45-47 10 Nguyễn Văn Thanh (2010), Công nghệ sinh học Dược, NXB Giáo Dục, tr.100-110 Tài liệu Tiếng Anh 11 Abrams SA, Chen Z, Hawthorne KM, (2014), "Magnesium metabolism in 4-year-old to 8-year-old children", Journal of Bone and Mineral Research, 29(1), pp 118-122 12 Aharon Meir Eyal, Rod Fisher (1998), "A process for the recovery of Lactic acid", Patent WO 1998037050, pp 1-10 13 Baets, Peter Johannes Marie (2013), "Process for the fermentative production of lactic acid from a plant extract the presence of a caustic magnesium salt", Patent WO 2013/087901 A1, pp 1-16 14 Ben - Yoseph Eliahu, Kogan Leni, Wajc Samuel (1999), "Process for preparing lactic acid", Patent WO 20000173378 A3, pp 1-7 15 Dumont (1965), "Treatment of uterine pain in pregnancy with magnesium lactate", Lyon Med, 213(21), pp 1571-1582 16 Eli, Bode Harold (1996), "High purity magnesium lactate from steepwater", patent US3429777, pp 17 Ellen, Garvie (1967), "Production of L (+) lactic acid and D (-) lactic acid in cultures of some lactic acid and bacteria with a special study of Lactobacillus acidophilus NCD02", J.Dairy Res, pp 31-34 18 G Stendig - Lindberg (2001), "The Israel society for research on Magnesium in Biology and Medicine: proceeding of the first meeting", Isr Med Assoc J, 3(10), pp 783-786 19 Giesecke D, Stangassinger M, Henle K (1985), "D(-) - Lactic acid - a metabolism problem", Z Ernahrungswiss, 24(3), pp 172 20 J.H.Litchefield (1996), "Microbiological production of acid lactic", Advances in applied microbiology, pp 532 21 K.L.Waseewar (2005), "Separation of Lactic acid", Recent Advances, Chem, Bio Chem, Eng.Q, 19(2), pp 159-172 22 Kamila Goderska, Jacek Nowak, Zbigniew Crarnecki (2008), "Comparison of the growth of Lactobacillus acidophilus and bifidobacterim bifidum species in media supplemented with selected saccharides including prebiotics", Acta Sci.Pol, Technol Aliment, 7(2) 23 Kazahiro Hoshino, Masayuki Taniguchi, Hideji Marumoto, Kazuyuki Shimizu, Michihiro Fuju (1991), "Continuous Lactic acid production from raw starch in a fermentation system using a reversibly soluble auto precipitating amylase and immobilized cells of Lactobacilluscasei", Agricultural and Biological Chemistry, 55(2), pp 479-485 24 Kozaki M, Uchimura T and Okada S (1992), "Experimental manual of lactic acid bacteria", Asakurasyoten, Tokyo, Japan, pp 1-10 25 Krieken, Jan Van (2007), "Method for preparing an organic aminelactic acid complex", Patent CN 101426755 B, pp 1-10 26 L.A.Schelef (1994), "Antimicrobial effects of lactates", A review, J.of food protection, 57 pp 445-450 27 Lin CQ, Li Y.M, Chan A.S.C (2003), "Principle and applications of asymmetric synthesis", John Wiley Sons, pp 7-13, 16-20, 26-29, 46, 136-137, 156-197 28 Marcus J.A.W, Vorage (2009), "Metal lactate powder and method for preparation", Patent US 8337867, pp 1-20 29 Moon S.H, Tsai S.P (1998), "An intergrated bioconversion process for production of L-lactic acid from starchy potato feed stocks", Applied biochemistry and biotechnology, (70-72), 30 R, Stedl L and Ditmar (1991), "Osteoporosis treated with magnesium lactate", Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med, 139 pp 99-106 31 R.A, Womersley (1958), "Metabolic effects of prolonged intravenous administration of magnesium lactate to the normal human", J Physiol, 142(2), pp 300-306 32 Roukas T, Kotzekidou (1998), "Lactic acid production from deproteinized whey by mixed cultures of free and coimmobilized Lactobacillus casei and Lactococcus lactis cells using fedbatch culture", Enzym and microbial technology, 22 pp 199-204 33 Sepitla, A (1961), Prumsyl Potravin, 13 pp 661-665 34 Steidl L, Tolde L and Svomova V (1987), "Metabolism of magnesium and zinc in patients treated with antiepileptic drugs and with magnesium lactat", Magnesium, 6(6), pp 284-295 35 Steidl L, Tolde L and Svomova V (1988), "Innovation of the antiepileptic therapy with magnesium lactate", Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med, 120 pp 271-282 36 The Merck Index 14th [...]... 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) - lactic  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất sản phẩm sinh tổng hợp calci lactat  Khảo sát ảnh hưởng của lượng glucose được L .acidophilus tiêu thụ theo thời gian trong môi trường lên men chứa 10% glucose  Lựa chọn thời điểm... nghiên cứu về điều chế acid lactic bằng phương pháp sinh tổng hợp từvi sinh vật a Nghiên cứu ở nước ngoài Garvie Ellen và các cộng sự (1967) đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid L (+) - lactic và D (-) - lactic 14 bằng cách lên men một số vi khuẩn sinh acid lactic, với nghiên cứu đặc biệt trên Lactobacillus acidophilus [17] Kamila Goderska và các cộng sự (2008)... các thí nghiệm tiếp theo 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng glucose được L .acidophilus tiêu thụ theo thời gian trong môi trường lên men chứa 10% glucose Theo một số nghiên cứu khả năng sinh acid lactic của L acidophilus đã công bố, L .acidophilus thuộc loại vi sinh vật có khả năng chuyển hóa glucose cho sản phẩm chứa acid L (+) - lactic nhiều nhất trong vòng 48 giờ nuôi cấy đầu tiên[17], [22] Vì vậy... Fehling Đun đến sôi Nếu dịch còn có glucose sẽ hình thành tủa nâu đỏ[3] Nếu không còn glucose, không xuất hiện tủa nâu đỏ 22 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo dạng acid L (+) - lactic 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất sản phẩm sinh tổng... acid D (-) -lactic và acid L (+) -lactic Acid D (-) - lactic Acid L (+) - lactic Hình 1.1 Cấu trúc không gian của acid D (-) - lactic và acid L (+) - lactic Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị ánh sáng phân cực đi qua, các dạng phân cực có thể chuyển thành dạng acid racemic dưới tác dụng của enzym racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic Nếu acid D (-) - lactic và acid L (+) - lactic có trong một... hành đánh giá khả năng sinh acid L (+) - lactic và D (-) - lactic của Lactobacillus acidophilus DSM 20079 trong các môi trường ở các nồng độ khác nhau của một số loại đường Kết quả cho thấy môi trường MRS không chứa carbohydrat sinh nhiều acid L (+) - lactic nhất rồi đến inulin, saccarose, lactose, glucose ( 68% dạng L, thời gian nuôi cấy 48h, pH 6,6) và cuối cùng là fructose [22] Hoshino và cộng sự đã... nên acid lactic có 1 cặp đối quang: acid D (-) - lactic, acid L (+) - lactic Acid D (-) - lactic Acid L (+) - lactic 3 Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, nhưng chỉ khác nhau về khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái Do đó tính chất sinh học của chúng khác nhau  Cấu trúc không gian Acid lactic là hỗn hợp của 2 dạng đồng phân acid D (-) -lactic. .. tiên đã có acid lactic trong dịch nuôi cấy. Tuy nhiên đến 48 giờ, lượng acid lactic trong dịch nhiều hơn Bên cạnh đó sau 48 giờ nuôi cấy, L acidophilusmới tiêu thụ được một glucose Lượng glucose dư trong dịch lên men còn nhiều sẽ ảnh hưởng đến việc đo góc quay cực riêng của acid lactic do glucose là chất có góc quay cực riêng lớn [3] Các nghiên cứu trên thế giới đã công bốchủngL .acidophilus nuôi cấy trong... mục 2.3.2 Phương pháp này áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Thời gian lên men VSV phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trung bình thời gian lên men của mỗi mẻ sản xuất acid lactic trong công nghiệp từ 2 đến 6 ngày [1] và tùy thuộc vào loài VSV sử dụng nuôi cấy khác nhau như loại B coagulans chỉ khoảng 11 đến 19 giờ [13], chủng L acidophilus nuôi cấy 48 ... cấy trong vòng 48 giờ sinh ra 68% acid L (+) - lactic [22] và nuôi cấy trong vòng 13,5 giờ sinh 91% dạng acid L (+) - lactic [17] Điều này có nghĩa là theo các tác giả trong vòng 48 giờ nuôi cấy đầu tiên, lượng acid L (+) - lactic sinh ra là nhiều nhất Có thể dựa vào kết quả thực nghiệm trên, lựa chọn lượng glucose 1% và 2% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo 3.1.3 Lựa chọn thời điểm kết thúc quá