Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của bacillus subtilis natto

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THÙY DƯƠNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THÙY DƯƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ

VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THÙY DƯƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ

VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ

NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn

chân thành tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp

Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy,

cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy

cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thùy Dương

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng

sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto

17

2.3.4 Phương pháp thử sơ bộ khả năng phân giải fibrin của các mẫu nghiên

cứu

19

3.1 Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B

subtilis natto

22

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng

sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto

26

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy tới khả năng

sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto

26

3.2.2 Kháo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh enzym ngoại

bào của B subtilis natto

fibrin của chất nghiên cứu)

tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)

Điện di SDS – PAGE : Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của natri

1.1 Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của Bacillus

subtilis natto

14

3.1 Đường kính vòng phân giải casein (dcasein) của dịch lên men ở

các thời điểm khác nhau

22

3.2 Đường kính vòng phân giải tinh bột (dtinh bột) của dịch lên

men ở các thời điểm khác nhau

23

các thời điểm khác nhau

23

3.4 Đường kính vòng phân giải cơ chất ( cơ chất) của dịch lên chiết

enzym ở các thời điểm khác nhau

24

3.5 Đường kính vòng phân giải casein (dcassein) của dịch lên men

khi nuôi cấy B subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau

27

3.6 Đường kính vòng phân giải tinh bột (dtinh bột) của dịch lên

men khi nuôi cấy B subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau

27

khi nuôi cấy B subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau

27

3.8 Đường kính vòng phân giải cơ chất ( cơ chất) của dịch chiết

enzym khi nuôi cấy B subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau

28

3.9 Đường kính vòng phân giải casein (dcassein) của dịch lên men

khi nuôi cấy B subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau

31

3.10 Đường kính vòng phân giải tinh bột (dtinh bột) của dịch lên

men khi nuôi cấy B subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau

31

khi nuôi cấy B subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau

31

nhau

1.1 Hình thái vi khuẩn B subtilis natto 4

3.1 Biến thiên hoạt độ enzym ngoại bào trong dịch lên men theo

thời gian nuôi cấy B subtilis natto

23

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt tính enzym ngoại bào

trong dịch lên men

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới, các bệnh có liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, thuyên tắc phổi… ngày càng tăng Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 900.000 người mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch Trong đó, khoảng 300.000

ca tử vong [30], chi phí điều trị của 600.000 ca còn lại là từ 5,8 tới 7,8 tỉ đô la[17]

Ở Việt Nam, theo thống kê tại thành phố Hồ Chí Minh mỗi năm có khoảng 17.500 người bị đột quỵ do tai biến mạch máu não, trong đó có 9.000 người tử vong, đa số còn lại là sống thực vật hay mất khả năng lao động Việc ngăn ngừa sự hình thành huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điều trị các bệnh này[13]

Trước đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông như heparin và coumarin Buớc sang những năm đầu thế kỉ 20, với việc phát hiện ra các enzym tiêu fibrin đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong điều trị bệnh huyết khối Các enzym làm tiêu huyết khối là những chất có thể làm tan cục máu đông do hoạt hóa plasminogen thành plasmin là chất có thể phá vỡ, ly giải sợi huyết (fibrin) Streptokinase, urokinase là những enzym tiêu huyết khối điển hình Tuy nhiên, chúng chỉ dùng đường tiêm truyền trong trường hợp điều trị cấp tính, không dùng

để phòng bệnh được, việc sử dụng những thuốc này lại làm tăng nguy có chảy máu

và các phản ứng dị ứng, mà chi phí điều trị lại cao [5], [62] Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong nấm, tảo, thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối an toàn, giá rẻ [6], [23]

Năm 1980, Giáo sư Hiroyuki Sumi đã phát hiện ra Natto - một loại thực phẩm truyền thống của người Nhật được lên men bằng cách ủ đậu tương nấu chín

với Bacillus subtilis natto chứa enzym có khả năng tiêu firbrin mạnh là nattokinase

Đặc biệt, nattokinase còn dùng được đường uống nên có thể dùng để phòng bệnh

[26], [58] B subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzym ngoại bào như

protease, amylase, cellulase… Khi thay đổi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, tốc độ lắc, dinh dưỡng, thời gian lên men… có thể ảnh hưởng tới hoạt độ các enzym của vi khuẩn Việc lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu protease với hoạt độ cao nhất, đồng thời hạn chế sự tổng hợp các enzym còn lại đóng vai trò rất quan trọng trong

việc chiết tách protease, sau đó là nattokinase Do đó, khóa luận “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của

Bacillus subtilis natto” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Lựa chọn thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto

2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, tốc độ lắc) tới khả

năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Tên khác: Bacillus subtilis subsp natto; Bacillus subtilis var natto

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis

được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [48]

1.1.1 Phân loại khoa học

B subtilis natto là một vi khuẩn nhân thật (Eurobacteria) thuộc: Giới:

Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi:

Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [52] Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto

[48], [52]

Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi sinh vật mới Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B nato và B subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [45], [49]; các khóa phân loại đã xếp B subtilis natto là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác

là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [39], [48]

Trong dòng B subtilis natto còn có nhiều loại như B subtilis natto B – 12 [53], B subtilis natto N - 77 [47]…

1.1.2 Nguồn gốc

B subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập từ Natto – món ăn truyền

thống của người Nhật Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt [39], [48]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

B subtilis natto là trực khuẩn hình que, Gr (+) Nội bào tử hình que có kích

thước dưới 1μm Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi

(Hình 1.1) Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn hơn hay hình dạng bất

định Bề mặt hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [48]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn B subtilis natto [63]

1.1.4 Đặc điểm sinh lý

B subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ oxy

lớn hơn 3% Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (300C – 500C); pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6 Sự phát

triển của B subtilis natto bị ức chế bởi nhiệt độ lớn hơn 550C và pH ≤4,5 Vi sinh vật có khả năng sinh bào tử, nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 400C, bào tử vẫn có thể này mầm sau khi bảo quản ở 00C [28], [48]

1.1.5 Đặc điểm sinh dưỡng

B subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydrocarbon: đường đơn như glucose, fructose…; đường đôi như maltose, saccarose…; polysaccharid như tinh bột… Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là acid amin và protein VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan,

phenylalamin [28], [48]

Vi sinh vật cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được

[28]

1.2 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis natto có khả năng sinh

nhiều sản phẩm trao đổi chất: γ-PGA theo Bhat năm 2013 [19]; levan (fructan) theo

Santos et al năm 2013 [44], trong đó đặc biệt quan trọng là nhóm các enzym ngoại bào: nhóm enzym γ–transpeptidase theo Noda năm 1989 [32] và Ogawa năm 1991 [56]; phytase theo M Shimizu năm 1992 [47]; amylase theo Elif Demirkan năm

2011 [21]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [57] và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease [23], [36], [51], [53]

1.2.1 Protease ngoại bào của B sutilis natto

B subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis Protease ngoại bào của loài B subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn

vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử Hai protease chính được sản xuất trong thời gian này là protease serin kiềm (subtilisin) và

protease trung tính [41]

 Đặc điểm một số protease ngoại bào của B subtilis natto

1 Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7

[27] Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 500

C; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [38]

2 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa, trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp [51]

3 Protease serin có TLTP 90kDa: có TLPT khoảng 90kDa; trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp, His, Ser [25]

4 Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT

hay subtilisin BSP Kí hiệu: EC 3.4.21.62

Trong đó: 3 (Loại) : Hydroxylase

disulfua trong phân tử TLPT: 27,7kDa đến 29kDa; pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 – 10, nhiệt độ <500C; được hoạt hóa bởi Zn2+

; bị bất hoạt bởi điều kiện pH <5, nhiệt độ ≥700C và các ion Fe3+, Al3+ Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và Asp Cơ chất đặc hiệu: Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – pNA [37], [53]

Với những ứng dụng trong y học, hiện nay nattokinase là protease được quan tâm nghiên cứu rộng rãi [23], [31] [51]

1.2.2 Nattokinase

a) Nguồn gốc

Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất mạnh có nguồn gốc từ Natto – món ăn truyền thống của Nhật Bản [37]

b) Cấu trúc của nattokinase

Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử Nattokinase có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và nhóm carboxyl của Asp-32 [4]

Hình 1.2 Cấu trúc của nattokinase [62]

c) Cơ chế tiêu fibrin

Nattokinase tiêu fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác nhau [35], [37]

Hình 1.3 Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase [35], [37]

- Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử thấp, hòa tan Như vậy, nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin

- Nattokinase giáng hòa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa Pro-urokinase thành urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm tăng plasminogen nội sinh là enzym phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể

- Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trình tổng hợp t-PA trong huyết tương Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin

Đặc biệt, nattokinase không ảnh hưởng tới sự hình thành fibrin từ fibrinogen,

do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể Vì vậy, nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc đông máu thông thường khác [35]

d) Công dụng

Đã có rất nhiều nghiên cứu về hiệu quả của nattokinase trong điều trị huyết khối, các bệnh liên quan tới tim mạch như nghiên cứu của Fujita M (1993) [36], Haritha M (2011) [37] Năm 2008, Kim J đã chỉ ra nattokinase có vai trò trong việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [31] Enzym cũng được dùng để giảm đau, đau

xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mãn tính, viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt cơ, vô sinh, ung thư và bệnh beriberi [64]

A-phân hủy fibrin trực tiếp

B-biến đổi prourokinase

thành urokinase

C – tăng lượng t-PA

Các sản phẩm phân hủy

Ở nước ta cũng có một số nghiên cứu về tác dụng của nattokinase trên lâm sàng: nghiên cứu của Nguyễn Văn Thông (2008) về đánh giá hiệu quả hỗ trợ điều trị của Nattospes (thành phần là nattokinase) trên bệnh nhân đột quỵ thiếu mãu não

ở Bệnh viện 108 cho thấy Nattospes có hiệu quả tương đương Aspirin [10]; Nguyễn

Bá Anh (2009) với nghiên cứu hỗ trợ điều trị phục hồi chức năng vận động của bệnh nhân nhồi máu não sau giai đoạn cấp ở Bệnh viện Bạch Mai cho thấy: trên lâm sàng và dự phòng tái phát Nattospes và Aspirin có tác dụng tương đương, enzym

còn rất ít tác dụng phụ so với Aspirin khi dùng trong thời gian dài [1]

Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nang: Nattospes (300FU/g), S-Nattokinase (5.000FU/g), Nattokinase plus FUcoidan (2.000FU/g), Nattokinase plus (3.000FU/g), Japato

(600FU/g)

1.3 Lên men sản xuất enzym từ Bacillus subtilis natto

Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ

yếu:

 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym

 Chiết tách và thu nhận enzym

 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym

Quá trình phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV nhằm tạo ra giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến nạp, tải nạp, tiếp hợp gen) [11], [29]

1.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym

a) Phương pháp lên men bề mặt (phương pháp rắn, phương pháp nổi: solid state fermentation)

Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng Môi trường này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, khô cám, cám mỳ, ngô (chiếm 90 - 95%) có bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa

(khoảng 5 - 10%) để làm xốp canh trường khiến oxy dễ thâm nhập Các nguyên liệu trên cung cấp các chất dinh dưỡng như: nitơ, carbon, vitamin, muối khoáng cho VSV phát triển Môi trường được làm ẩm (50 - 60%) và tiệt khuẩn (1atm, 1200C) sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 - 400C để gieo vi sinh vật Nuôi VSV ở nhiệt độ 28 -

320C trong 36 - 48h Trong điều kiện này hầu hết enzym được sinh tổng hợp [11]

b) Phương pháp lên men chìm (phương pháp lỏng, phương pháp bề sâu: Liquid state fermentation)

Người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có sục khí liên tục Thành phần dinh dưỡng gồm: nguồn carbon (các loại đường dễ đồng hóa: glucose, maltose, hoặc tinh bột đã thủy phân sơ bộ…); nguồn nitơ (nitơ vô cơ: amoni sulfat, ure…; nitơ hữu cơ: cao ngô, pepton, cao thịt,…); muối khoáng và vitamin (biontin, K2HPO4, MgSO4…) Môi trường dinh dưỡng được cho vào thùng lên men, tiệt khuẩn trực tiếp bằng hơi nước nóng (118 – 1250C/45 – 60 phút) Sau

đó, hạ nhiệt độ và bổ sung VSV và nuôi 2 – 4 ngày Nuôi cấy chìm thường tạo nhiều bọt, nên có thể sử dụng một số chất phá bọt như tween 20, acid oleic…[11]

Enzym ngoại bào của B subtilis natto được tổng hợp ở bên trong tế bào sau

đó mới tiết ra ngoài môi trường Do đó, khi kết thúc quá trình nuôi cấy có thể lọc, li tâm loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch enzym

So với lên men bề mặt, phương pháp lên men chìm có ưu điểm: tính liên tục,

dễ cơ giới hóa, tự động hóa, cho năng suất cao, enzym thu được ít lẫn tạp Nhược điểm của phương pháp là: nồng độ enzym thấp, tốn nhiều điện năng Với những ưu nhược điểm trên, ngày nay phương pháp lên men chìm được sử dụng cho việc sản xuất hầu hết các enzym trong công nghiệp [11], [29]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym của B subtilis natto

Vi sinh vật là những cơ thể sống, chúng có nhu cầu về các chất dinh dưỡng Ngoài ra, sự sinh trưởng chúng còn chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố môi trường sống như nhiệt độ, pH, lượng oxy,… Các yếu tố này có thể kích thích sinh trưởng phát triển, tăng hoạt lực enzym, hiệu quả lên men nhưng cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các tế bào vi sinh vật

a) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ môi trường và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của VSV cũng như tính

chất của enzym được tổng hợp Ví dụ khi nuôi Bacillus coagulans ở 350C và 550C thì amylase sinh ra có khả năng chịu nhiệt khác nhau Amylase thu nhận khi nuôi ở

350C bị mất 90 – 94% hoạt tính khi giữ ở 900C trong một giờ, trong khi amylase thu nhận ở trường hợp 550C chỉ mất có 12% hoạt tính [16]

Mỗi vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được Khi nhiệt độ quá cao thì vi sinh vật sẽ chết, enzym bị biến tính, màng

tế bào bị tổn thương tới mức khó phục hồi Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị đông kết lại, enzym cũng ngừng hoạt động [7], [62]

b) Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzym tối đa Thời gian đó phụ thuộc chủ yếu vào chủng

vi sinh vật

Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ kín trải qua bốn pha liên tiếp là pha tiềm phát (pha lag), pha lũy thừa, pha cân bằng, pha suy vong Tuy nhiên, độ dài các pha phụ thuộc vào nhiều yếu tố Độ dài của pha lag phụ thuộc chủ yếu vào

ba yếu tố chính là tuổi của giống, lượng giống, thành phần môi trường [7]

Enzym VSV thường được sinh vào pha log (pha lũy thừa) Protease ngoại

bào của loài B subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi

khuẩn vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [7], [41]

c) Ảnh hưởng của tốc độ lắc

Lượng oxy ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất và tích lũy các sản phẩm

sinh tổng hợp của vi sinh vật Ví dụ khi nuôi cấy nấm men trong điều kiện kỵ khí sẽ xảy ra quá trình lên men rượu, khi cung cấp oxy thì nấm men sẽ phát triển tăng sinh khối còn lên men rượu rất ít hoặc không lên men Ở vi khuẩn hiếu khí, tăng tốc độ thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, cũng như khả năng tích lũy các sản phẩm trao đổi chất trong tế bào như các enzym, acid amin, kháng sinh Tuy nhiên, nếu độ

thông khí quá mức độ thích hợp thì sự tích lũy của vi sinh vật sẽ giảm [2] Một số nghiên cứu chỉ ra có mối liên hệ giữa chế độ sục khí với tốc độ lắc khi lên men vi sinh vật

Một số tác giả nêu ra, khi nuôi cấy B subtilis natto thì việc sục khí và khuấy

trộn là hết sức cần thiết Oxy là yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát

triển và quá trình trao đổi chất của tế bào Khi nuôi B subtilis, nuôi thùng nhân

giống có cánh khuấy làm việc liên tục, lượng khí vô trùng sục vào môi trường với lưu lượng 40m3

/m3 môi trường/giờ; còn thùng lên men sản xuất enzym thì cánh khuấy phải làm việc liên tục và lưu lượng khí sục vào mạnh hơn 60m3/m3 môi

trường/giờ [16]

d) Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng tới sự phát triển và tổng hợp enzym của vi sinh vật Cùng một loại VSV nhưng nếu nuôi cấy trên các môi trường

có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ và thành phần enzym được tạo ra cũng khác nhau Nếu môi trường có những chất khó đồng hóa thì vi sinh vật sẽ tiết

ra những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được Vì vậy, khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng tổng hợp enzym của vi sinh vật có thể tăng lên gâp nhiều lần so với bình thường Trong công nghiệp sản xuất enzym cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối

ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [7], [15]

Một số nghiên cứu đã xác định maltose là nguồn hydratcarbon tốt nhất để tổng hợp nattokinase [4], [34] Khi bổ sung maltose vào môi trường cũng làm tăng khả năng sinh α-amylase của B subtilis [40]

e) Ảnh hưởng của pH

pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật, đó là do sự tác dụng trực tiếp của ion H+ hoặc ion OH- đến tính chất keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym [2] Việc lựa chọn pH môi trường thu

enzym phụ thuộc vào chủng vi sinh vật và loại enzym pH môi trường nuôi cấy B subtilis nhằm thu α-amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là

7,0 – 7,8 Theo Peddapalli Siva Rasagnya (2013) ở pH 7,5 B subtilis NCIM 2724

cho hoạt độ nattokinase cao nhất [42]

1.4 Một số nghiên cứu về B subtilis natto và nattokinase

1.4.1 Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy vi sinh vật

Cùng với những hiệu quả của nattokinase với sức khỏe, những năm gần đây

có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để B subtilis natto sinh tổng

và 24h để thu được hoạt độ protease cao nhất [24]

Năm 2007, Peddapalli Siva Rasagnya1et al lựa chọn thời gian lên men B subtilis NCIM 2724 là 24h để cho hoạt tính nattokinase cao nhất (653μg/ml) sau khi

xác định hoạt tính nattokinase từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật ở các thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h [42]

Năm 2009, Ming Fei-ping et al nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men B natto Tác giả lên men vi sinh vật trong khoảng nhiệt độ từ 300C – 390C và ở các tốc độ lắc là 100v/p; 150 v/p; 200v/p; 250v/p kết quả cho thấy từ 350C – 390C, B natto phát triển tốt và phát triển mạnh mẽ nhất ở điều kiện nhiệt độ 370C, tốc độ lắc 200v/p [60]

Năm 2010, Mukesh D Nimkar khảo sát nhiệt độ nuôi cấy B subtilis WB

trong khoảng nhiệt độ (100C – 500C) thấy hoạt độ amylase cao nhất khi lên men vi sinh vật ở 300C [40]

Năm 2011, Zhang Anping et al tiến hành lên men B subtilis natto trong

khoảng nhiệt độ từ 250C – 450C, tác giả đã lựa chọn 370C là nhiệt độ lên men B subtilis natto để vi sinh vật sinh tổn hợp nhiều nattokinase nhất [59]

Năm 2012, B Christudhas Williams et al nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men B subtilis cho mục tiêu tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Sau

khảo sát khoảng nhiệt độ (300C – 650C) và tốc độ lắc (110v/p – 200v/p) cho thấy ở nhiệt độ 370C và tốc độ lắc 180v/p, vi sinh vật sinh tổng hợp nhiều protease nhất

[54] Theo D J Muket et al (2012) khảo sát nhiệt độ lên men B subtilis từ 200C –

500C, sau 72h nuôi cấy, mẫu lên men ở 300c cho hoạt độ cellulase cao nhất [33]

b) Trong nước

Ở Việt Nam, phân lập vi khuẩn có khả năng sinh nattokinase và tối ưu hóa

điều kiện nuôi cấy B subtilis natto chưa được tiến hành nghiên cứu nhiều Một số

nghiên cứu về nattokinase của B subtilis đã được thực hiện như:

Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập được hai chủng là Bacillus sp 7.2 và Bacillus sp NP3 (từ một số chủng Bacillus spp trong bộ sưu tập

giống của Viện sinh học nhiệt đới và từ thực phẩm Natto) có khả năng tổng hợp mạnh nattokinase Hoạt tính enzym cao nhất sau 40h nuôi cấy (hoạt tính nattokinase

của Bacillus sp 7.2 và Bacillus sp NP3 tương ứng là 464,4 FU/g và 472,2 FU/g)

tương đương với hoạt tính nattokinase của một số thực phẩm chức năng trên thị trường [8]

Năm 2013, Nguyễn Quỳnh Uyển và nhóm nghiên cứu đã phân lập từ thức ăn lên men truyền thống được hai chủng là Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus atrophaeus có hoạt tính nattokinase Đồng thời khảo sát nhiệt độ lên men (300C và

370C) và thời điểm thu enzym (24h, 48h, 72h) cho thấy ở cả hai chủng, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy tối ưu là 370C và 24h [13]

Năm 2013, Dương Nhật Linh và cộng sự cũng đã tuyển chọn chủng vi sinh

vật sinh enzym phân giải fibrin từ đậu nành lên men và xác định hoạt tính enzym tiêu fibrin tại các thời điểm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ, 48

giờ, 66 giờ, 72 giờ Kết quả cho thấy chủng B subtilis NT68 phân lập từ Natto –

Miso (Nhật Bản) có hoạt tính tiêu fibrin mạnh nhất sau 36 giờ nuôi cấy [6]

1.4.2 Nghiên cứu về chiết tách và thu nhận enzym

Các nghiên cứu về quy trình chiết tách các protease ngoại bào của B subtilis

natto trên quy mô thí nghiệm được nêu trong Bảng 1.1 Phương pháp chiết tách hay

dùng là kết tủa protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa Tinh chế bằng cách kết hợp nhiều phương pháp khác nhau Nhìn chung hiệu quả và mức tinh sạch enzym sau chiết tách của các quy trình là rất khác nhau [48]

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của

Thẩm tích Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl Sắc kí trao đổi ion CM – toyopearl Sắc kí lọc gel Sephadex G – 50 Sumi H

(1999) [27]

Tách lấy E thô: NaCl 0,9%

Kết tủa enzym ở pI = 8,7

Sắc kí lọc gel Điện di SDS – PAGE Muramatsu

K (2000)

[38]

Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Hiệu quả: 10% Mức tinh sạch: 46,5

S Tokudome

(2005) [51]

Tách lấy E thô: nước Loại tạp: siêu lọc Làm giàu protein: cô dưới

áp suất giảm

Sắc kí kị nước Butyl – Toyopearl Quá trình tinh chế được lặp lại nhiều lần

Mức tinh sạch: 56,1 Nguyễn Thị

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng

Bacillus subtilis natto – Nhật Bản

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng

Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B

subtilis natto

 Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng

sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto

 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy (300

C và 370C) tới khả

năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto

 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện tốc độ lắc (100v/p và 150v/p) tới hoạt độ

enzym ngoại bào của vi sinh vật

 Sơ bộ thử khả năng phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto

a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch thường (theo phần 2.1.3), đun cho đồng nhất Chia đều

môi trường vào trong các ống nghiệm (5 – 6ml/ống), nút kín Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội cho thạch đông lại Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới theo hình ziczac Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ủ ở 370

C/24 giờ Bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở 4 – 50C Việc cấy truyền được thực hiện

1 – 2 tháng/lần [3], [9]

b) Phương pháp nhân giống trong bình nón

Pha 20ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 50ml,

nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400

C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống giống vào môi trường Nuôi trên máy lắc ở 370C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút [3], [9], [61]

c) Phương pháp lên men

Pha 100ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 250ml, nút

kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400

C, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường mới với tỷ lệ cấy truyền là 10% Nuôi VSV trên máy lắc ở điều kiện nhiệt

độ, tốc độ lắc và thời gian nghiên cứu [3], [9]

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym

a) Phương pháp thử hoạt tính protease

Nguyên tắc: Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein

của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch [3]

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có

mỏ 200ml, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều và đun cho đồng nhất Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ và đọc kết quả [4]

b) Phương pháp thử hoạt tính amylase

Nguyên tắc: amylase có khả năng phân giải tinh bột thành các oligosaccharid

và đường đơn không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I2) Dùng tinh bột làm cơ chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính amylase có trong dịch chiết enzym [3]

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% tinh bột và 2% thạch trong cốc có

mỏ 200ml, khuấy đều và đun cho đồng nhất Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch

để quan sát vòng phân giải tinh bột [3]

c) Phương pháp thử hoạt tính cellulase

Nguyên tắc: Cellulase có khả năng phân giải CMC thành các oligosaccharid

không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I2) Dùng CMC làm cơ chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính cellulase có trong dịch chiết enzym [3], [9]

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 0,5% CMC và 2% thạch trong cốc có

mỏ 200ml (chú ý ngâm cho CMC trương nở hoàn toàn), đun cho đồng nhất Đổ