Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của tế bào huyền phù cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)

Cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là một cây thuốc phổ biến, có các đặc tính dược lý như chống co thắt, gây độc tế bào, chống khối u, chống loét, kháng khuẩn và kích thích tình dục. Bài viết trình bày việc đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào huyền phù cây bách bệnh dưới ảnh hưởng của môi trường và các điều kiện nuôi cấy khác nhau.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 16, Số (2020) NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY BÁCH BỆNH (Eurycoma longifolia Jack) Nguyễn Hữu Nhân1,3, Hoàng Tấn Quảng4, Nguyễn Hoàng Lộc1,2* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Viện nghiên cứu hoạt chất sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Trường Cao đẳng Lương thực – Thực phẩm, Đà Nẵng Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế *Email: nhloc@hueuni.edu.vn Ngày nhận bài: 31/10/2019; ngày hoàn thành phản biện: 23/12/2019; ngày duyệt đăng: 02/4/2020 TÓM TẮT Cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thuốc phổ biến, có đặc tính dược lý chống co thắt, gây độc tế bào, chống khối u, chống lt, kháng khuẩn kích thích tình dục Trong nghiên cứu này, đánh giá khả sinh trưởng tế bào huyền phù bách bệnh ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy khác Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện nuôi cấy tốt môi trường MS có bổ sung 1,25 mg/L NAA mg/L KIN, 3% sucrose, pH 5,75, tỷ lệ tiếp giống g/bình, tốc độ lắc 120 vịng/phút Sau 14 ngày ni cấy, tích lũy sinh khối tươi khơ đạt cao nhất, tương ứng 17,27 g/bình 0,76 g/bình Phân tích HPLC cho thấy hàm lượng eurycomanone tế bào 1,672 mg/g chất khô, khoảng 80% so với mẫu rễ tự nhiên cao nhiều lần so với callus Eurycomanone tổng hợp tốt tế bào bách bệnh dịng tế bào sử dụng để sản xuất eurycomanone quy mơ lớn Từ khóa: bách bệnh, điều kiện nuôi cấy, Eurycoma longifolia Jack, eurycomanone, tế bào huyền phù MỞ ĐẦU Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thảo mộc, thường xanh, sinh trưởng chậm, bụi gỗ nhỏ, chiều cao tối đa 15-18 m sau 2-3 năm trồng Trong tự nhiên, trưởng thành hồn tồn đến 25 năm [5] Cây bách bệnh có phổ phân bố theo độ cao biến thiên từ điểm thấp khoảng 200 m độ cao 155 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy lên khả sinh trưởng … 1.129 m, phân bố tập trung khoảng độ cao từ 500 m đến 900 m Bách bệnh thường phân bố theo dải mọc thành cụm khoảng 3-8 ven rừng rộng [3] Hầu tất phận bách bệnh sử dụng phương thuốc dân gian Dịch chiết rễ sử dụng để phục hồi lượng sinh lực, tăng cường lưu thông máu, bổ sung vào thành phần thảo dược cho phụ nữ sau sinh Lá sử dụng để điều trị sốt rét, khối u, bệnh nướu [19] Dịch chiết bách bệnh chứa tanin, polysaccharid trọng lượng phân tử cao, glycoprotein mucopolysaccharid Các hợp chất eurycomanone; 9methoxycanthin 6-one; 14,15-β-dihydroxyklaineanone 13,21-epoxyeurycomanone thường sử dụng chất chuẩn để tiêu chuẩn hóa sản phẩm bách bệnh [6] Ở Việt Nam, tác giả tập trung nghiên cứu phân bố thành phần hóa học bách bệnh cơng trình cơng bố chưa nhiều Trong đó, nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù bách bệnh để sản xuất hợp chất thứ cấp chưa tìm thấy Trên giới, nhiều cơng trình nghiên cứu phương pháp chiết xuất, xác định thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học bách bệnh công bố [12], [17] Tuy nhiên, nghiên cứu nuôi cấy tế bào bách bệnh chưa nhiều Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy tế bào bách bệnh để thu lượng sinh khối lớn, có khả tích luỹ cao hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm chủ động nguồn nguyên liệu, đảm bảo cho việc tách chiết dược chất có ý nghĩa lớn mặt khoa học thực tiễn Trong nghiên cứu này, đánh giá ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng tế bào bách bệnh, nguyên liệu để sản xuất hợp chất thứ cấp NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Callus bách bệnh mà sử dụng nghiên cứu cung cấp Viện nghiên cứu hoạt chất sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế [4] 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nuôi cấy huyền phù tế bào Callus có màu vàng nhạt, rời cấy chuyển lên bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng để nuôi cấy tế bào huyền phù Công thức môi trường cho callus sinh trưởng tốt (MS có chứa 3% sucrose, bổ sung 1,25 mg/L NAA 156 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 16, Số (2020) mg/L KIN) sử dụng để nuôi cấy huyền phù tế bào [4] Quá trình ni cấy thực với cường độ chiếu sáng khoảng 500 lux, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, tốc độ lắc 120 vòng/phút Sinh khối tế bào thu sau ngày nuôi cấy 20 ngày để xác định đường cong sinh trưởng tế bào Tế bào lọc rửa môi trường với nước cất hệ thống lọc chân không, cân để xác định trọng lượng tươi Tế bào sau sấy 500C đến trọng lượng không đổi, cân để xác định trọng lượng khơ Đối với thí nghiệm thăm dò tỷ lệ tiếp giống, lượng callus đưa vào bình ni cấy 2-4 g tươi/bình Sau chọn tỷ lệ tiếp giống tối ưu tối ưu, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác (sucrose, fructose glucose nồng độ từ 2-4%) lên khả sinh trưởng tế bào Để khảo sát ảnh hưởng pH lên khả sinh trưởng tế bào, sử dụng mơi trường có giá trị pH từ 4,75 đến 6,75, khoảng chênh lệch pH môi trưởng 0,25 Chiết xuất eurycomanone Eurycomanone chiết xuất theo phương pháp Mohamad cs (2013) [14] có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện cụ thể phịng thí nghiệm Sinh khối khơ callus nghiền thành bột mịn, sau chiết cách ngâm 0,5 g mẫu 10 mL methanol, lắc 120 vòng/phút 60oC giờ, sau để lắng thu dịch chiết Quy trình chiết lặp lại lần Dịch chiết (khoảng 30 mL) lọc qua giấy lọc Whatman (No.1) đặc 50oC Sau đó, kết tủa hòa tan mL methanol, lọc qua màng lọc Minisart 0,2 µm (Sartorius, Goettingen, Đức), để xác định hàm lượng eurycomanone Xác định hàm lường eurycomanone Hàm lượng eurycomanone xác định máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) theo Norhidayah cs (2015) [16] có điều chỉnh phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm 20 µL dịch chiết tiêm vào máy HPLC Hamilton syringe Điều kiện chạy HPLC nhiệt độ phịng, cột C18 (Xbridge: µm, 4,6 x 250 mm), tốc độ chạy: 0,8 mL/phút, thời gian chạy: 17,5 phút, detector đọc bước sóng 245 nm, pha tĩnh silica gel pha động acetonitril: H2O (15:85) Quy trình phân tích HPLC thực máy LC-20 Prominence (Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản), với SPD-20A UV-VIS detector, sử dụng phần mềm LCSolution Các hóa chất sử dụng để phân tích HPLC mua từ hãng Merck & Co.Inc (Darmstadt, Đức) Đường chuẩn eurycomanone (Santa Cruz, CA, Mỹ) sử dụng để xác định hàm lượng eurycomanone chứa mẫu phân tích Xử lý thống kê Tất thí nghiệm lặp lại lần Số liệu trung bình phân 157 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy lên khả sinh trưởng … tích one-way ANOVA (Duncan’s test, p