Nghiên cứu ảnh hưởng của tế bào đệm cell co culture lên sự thành thục trứng và sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHUNG “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TẾ BÀO ĐỆM ( CELL-CO-CULTURE) LÊN SỰ THÀNH THỤC TRỨNG VÀ SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI LỢN THỤ TINH ỐNG NGHIỆM ” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn! Dân gian ta có câu, khơng thầy đố mày làm nên Là học trị cịn nhiều thiếu xót, kinh nghiệm chƣa nhiều, để hồn thành đề tài mình, tơi cần đến nhiều quan tâm, giúp đỡ tận tình thầy cô bạn bè đồng nghiệp Trƣớc hết không kể đến hƣớng dẫn hết lịng thầy TS Bùi Xn Ngun trƣởng phịng Cơng nghệ Phôi, ngƣời bảo suốt trình thực luận văn Là ngƣời thầy có trình độ chun mơn sâu, kiến thức rộng, tận tâm cơng việc hết lịng học trị Tơi thật lịng thán phục lực làm việc say mê khoa học ngƣời thầy Trong thời gian đƣợc làm việc thầy cảm thấy thật may mắn có đƣợc hƣớng dẫn định hƣớng thầy Sát cánh bên cạnh dẫn cô TS Nguyễn Thị Ƣớc, cô dạy bảo truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm quý báu công việc nhƣ sống Xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Văn Hạnh (Viện Công nghệ Sinh Học) có nhận xét thẳng thắn quý báu để giúp làm việc đƣợc tốt Qua xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Việt Linh có góp ý đắn để tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ đồng nghiệp phịng Cơng nghệ Phơi ln bên cạnh, ủng hộ suốt thời gian qua! Hà Nội, 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục lục Trang ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 Tế bào trình thành thục, thụ tinh tế bào trứng lợn 12 1.1 Cấu tạo buồng trứng lợn 12 1.2 Cấu tạo tế bào trứng 13 1.3 Sự thành thục tế bào trứng 14 1.3.1 Sự thành thục nhân 14 1.3.2 Sự thành thục tế bào chất 15 1.3.3 Một số nhân tố điều hòa hoạt động tế bào trứng 16 1.4 Sự thụ tinh phát triển phơi in vivo lợn 16 Tình hình nuôi thành thục trứng thụ tinh ống nghiệm lợn 17 2.1 Nuôi thành thục trứng lợn 17 2.2 Thụ tinh phát triển phôi in vitro lợn 19 Ảnh hƣởng co-culture với tế bào đệm lên thành thục trứng 23 phát triển phôi 3.1 Tế bào màng vòi trứng, vai trò tế bào màng vòi trứng lên 23 thành thục trứng phát triển phôi 3.1.1 Tế bào màng vòi trứng 23 3.1.2 Vai trò tế bào màng vòi trứng 23 3.2 Ảnh hƣởng nguyên bào sợi bào thai chuột (Fibroblast cells) lên 25 thành thục trứng phát triển phôi PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 Nguyên vật liệu 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1 Đối tƣợng thí nghiệm 29 1.2 Dụng cụ thí nghiệm 29 1.3 Thiết bị thí nghiệm 29 1.4 Hóa chất mơi trƣờng 29 Phƣơng pháp 32 2.1 Phƣơng pháp thu nhận buồng trứng 32 2.2 Nuôi thành thục trứng invitro 33 2.3 Nuôi thành thục trứng với môi trƣờng bổ sung nguyên bào sợi thai chuột 33 2.4 Nuôi thành thục trứng với mơi trƣờng bổ sung tế bào màng vịi trứng 34 2.5 Quan sát hình thái, đánh giá mức độ thành thục trứng 35 2.6 Nhuộm đánh giá giai đoạn phát triển trứng 35 2.7 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm 36 2.8 Đánh giá chất lƣợng phát triên phôi lợn thụ tinh ống nghiệm 36 2.9 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu 36 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 Kết thu phân loại trứng 38 Kết nuôi thành thục trứng 40 2.1 Ảnh hƣởng co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên thành 40 thục trứng 2 Ảnh hƣởng co-culture với tế bào màng vòi trứng (oviduct 41 cell) lên thành thục trứng 2.3 Ảnh hƣởng co-culture lúc với với tế bào sợi bào thai chuột 43 tế bào màng vòi trứng lên thành thục trứng 44 Kết thụ tinh phát triển phôi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1 Ảnh hƣởng co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên phát 44 triển phôi thụ tinh ống nghiệm 3.2 Ảnh hƣởng co-culture với tế bào màng vòi trứng lên 46 phát triển phôi thụ tinh ống nghiệm 3.3 Ảnh hƣởng co-culture lúc với với tế bào sợi bào thai chuột 49 tế bào màng vòi trứng lên sƣ thụ tinh phát triển phôi IV KET LUAN 54 TAI LIEU THAM KHAO 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Danh mục từ viết tắt Thụ tinh ống nghiệm TTON In vitro fertilization IVF Nuclear deoxyribonucleic acid DNA Luteinizing hormone LH Nhiễm sắc thể NST Nuclear ribonucleic acid RNA Maturation promoting factor MPF Follicle stimulating hormone FSH In vitro maturation IVM Maturation promoting factor MPF Cumulus oocyte complex COC Metaphase I MI Metaphase II MII Germinal vesicle GV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Danh mục hình Hình 1: Thai chuột 14 ngày tuổi Hình 2: Miếng thai chuột Hình 3: Tế bào sợi thai chuột sau ngày nuôi Hình 4: Tế bào sợi thai chuột sau 10 ngày ni Hình 5: Vịi trứng lợn Hình 6: Tế bào màng vịi trứng sau thu Hình 7: Các cụm tế bào màng vịi trứng sau ni ngày Hình 8: Một cụm tế bào màng vịi trứng điển hình Hình 9: Buồng trứng lợn thu từ lị mổ Hình 10: Trứng lợn sau thu Hình 11:Trứng lợn sau ni 22 Hình 12: Trứng lợn nuôi môi trƣờng bổ sung tế bào màng vịi trứng Hình 13: Trứng thành thục sau tách cumulus (x1600) Hình 14: Trứng giai đoạn bóng mầm Hình 15: Trứng giai đoạn metaphase I Hình 16: Giai đoạn metaphase II Hình 17: Phơi giai đoạn tế bào Hình 18: Phơi tế bào Hình 19: Phơi dâu Hình 20: Phơi nang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Danh mục bảng Bảng 1: Kết thu phân loại trứng nang có kích 38 thƣớc > mm Bảng 2: Kết thu phân loại trứng nang có kích 39 thƣớc 2-3 mm Bảng 3: Ảnh hƣởng tế bào sợi thai chuột lên tỉ lệ thành thục 41 trứng lợn Bảng 4: Ảnh hƣởng tế bào màng vịi trứng lên chất 42 lƣợng trứng lợn sau ni Bảng 5: Ảnh hƣởng việc bổ sung hai loại tế bào vào môi 43 trƣờng nuôi trứng lên tỉ lệ thành thục trứng lợn Bảng 6.1: Ảnh hƣởng tế bào sợi thai chuột lên chất lƣợng 44 phôi thu từ nang > mm Bảng 6.2: Ảnh hƣởng tế bào sợi thai chuột lên chất lƣợng 45 phôi thu từ nang 2-3 mm Bảng 7.1: Kết phát triển phôi lợn trứng ni 47 mơi trƣờng IVM có bổ sung tế bào màng vòi trứng (Đối với nang > mm) Bảng 7.2: Kết phát triển phôi lợn trứng nuôi 48 mơi trƣờng IVM có bổ sung tế bào màng vòi trứng (Đối với nang 2- mm) Bảng 8.1: Sự phát triển phôi bổ sung vào môi trƣờng nuôi 49 trứng hai loại tế bào (nang > mm) Bảng 8.2: Sự phát triển phôi bổ sung vào mơi trƣờng ni Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn trứng hai loại tế bào (nang 2-3 mm) ĐẶT VẤN ĐỀ Kĩ thuật thụ tinh ống nghiệm (TTON) hay kĩ thuật IVF (in vitro fertilization) giúp trứng tinh trùng thụ tinh bên thể bƣớc đột phá quan trọng ngành y học sinh học Cho đến nay, thụ tinh ống nghiệm đƣợc áp dụng nhiều loài động vật khác hầu hết nƣớc giới Năm 1959 Chang cộng tạo thỏ (động vật có vú đầu tiên) phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm Tiếp theo thành cơng hàng loạt đối tƣợng nhƣ cừu, chuột đồng, mèo, khỉ … Ngày 25 tháng năm 1978 em bé đƣợc đời phƣơng pháp TTON mở hi vọng cho hàng nghìn cặp vợ chồng muộn khắp giới Trong năm nhà khoa học phải thực khoảng 5000 chu kỳ để có hai trƣờng hợp em bé TTON đời Sau năm với cố gắng không nhỏ, em bé TTON đƣợc đời Pháp Úc Vào thời gian đó, khơng nghĩ 30 năm sau, triệu em bé TTON đƣợc sinh nhiều nƣớc giới Giải Nobel Sinh lý Y học năm 2010 đƣợc trao cho TS Adward cơng trình nghiên cứu thành công kỹ thuật TTON ngƣời vào năm 1978 đóng góp cho việc phát triển kỹ thuật tồn giới Nhằm mục đích cải thiện khả sinh sản động vật cao sản, bảo tồn đa dạng loài động vật quý hiếm, tăng khả thụ thai điều trị vô sinh, kĩ thuật TTON năm gần đƣợc quan tâm đầu tƣ nhiều Tại Việt Nam, công nghệ Phôi TTON đƣợc bắt đầu nghiên cứu Viện Khoa học công nghệ Việt Nam từ năm 1978 – 1980 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đạt đƣợc nhiều thành công đối tƣợng nhƣ thỏ (1978) trâu bò ( 1986, 2002) TTON đƣợc ứng dụng để điều trị vô sinh từ 10 năm sau giới với tảng khoa học nhiều hạn chế, việc phát triển TTON ngƣời Việt Nam đạt đƣợc nhiều thành cơng đáng khích lệ Lợn động vật đƣợc quan tâm đặc biệt nhƣ mơ hình nghiên cứu y học có đặc điểm di truyền lồi ngƣời Buồng trứng lợn có chứa số lƣợng lớn (hơn 200.000) nang trứng sơ cấp (primordial follicles) Trong năm đầu thập kỉ 1980 ngƣời ta thu đƣợc phôi in vivo từ lợn phơi ni, phát triển từ giai đoạn tế bào đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) Sau hiểu biết đặc điểm phát triển trứng giúp hình thành loại mơi trƣờng nuôi trứng thành thục điều kiện in vitro Thụ tinh ống nghiệm đối tƣợng lợn đƣợc Chan cộng công bố vào năm 1986 Mặc dù tế bào trứng lợn trƣởng thành ống nghiệm thụ tinh với tinh trùng cách dễ dàng điều kiện thích hợp Sự phát triển phôi lợn in vitro thu nhiều so với điều kiện in vivo nguyên nhân cụ thể dẫn đến khác biệt vấn đề cần đƣợc giải Các kết nghiên cứu TTON lợn Việt Nam năm gần cho thấy đặc điểm đặc trứng phƣơng thức nuôi dƣỡng, đặc điểm thời tiết, độ tuổi giết thịt… kết TTON từ nguồn trứng lợn thu Việt Nam có khác biệt so với kết TTON số nƣớc khác, việc tạo đƣợc nguồn trứng chất lƣợng đảm bảo chìa khóa then chốt nhằm nâng cao hiệu TTON 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Việt Nam Hiện phƣơng thức chăn nuôi chủ yếu nuôi nhốt theo hình thức cơng nghiệp, nguồn thức ăn chứa nhiều hormone tăng trọng rút ngắn thời gian nuôi để giết thịt, đàn lợn đƣa vào giết thịt thu trứng đạt tiêu chuẩn trọng lƣợng nhƣng chƣa đảm bảo độ thành thục giới tính Chính trứng thu đƣợc thƣờng cịn non, chƣa đảm bảo thành thục chất lƣợng Đây nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ thành thục sau nuôi tỉ lệ phôi phát triển sau thụ tinh ống nghiệm thấp nhiều so với số nƣớc khác Mặt khác nguyên nhân khách quan phƣơng tiện vận chuyển, trang thiết bị thí nghiệm điều kiện thí nghiệm chƣa thực đƣợc đảm bảo có ảnh hƣởng không tốt đến chất lƣợng trứng phôi PHẦN IV: KẾT LUẬN 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đối với nguồn trứng lợn Việt Nam đƣợc thu từ lị mổ trứng đƣợc thu nang có kích thƣớc > mm có tỉ lệ trứng loại A, tỉ lệ trứng thành thục tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang cao so với trứng đƣợc thu nang có kích thƣớc 2-3 mm (43,3 ±7,30% 27,9± 5,42% ; 59,57±1,00% 29,79±1,27 %; 9,57±3,07% 6,96±3,50%) Khi bổ sung tế bào màng ống dẫn trứng vào môi trƣờng nuôi trứng làm tăng tỉ lệ thành thục trứng tỉ lệ phát triển đến giai đoạn sau phơi hai loại kích thƣớc nang Tỉ lệ thành thục trứng tăng từ 54,93±1,17% lên 76,39±2,05% nang >3mm, từ 30,44±9,34% lên 55,17±6,72% nang 2-3mm Tỉ lệ phôi dâu/trứng chia nang > 3mm tăng từ 23,40±4,90 % lên 39,72±2,59% 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Khi bổ sung tế bào sợi thai chuột vào môi trƣờng nuôi trứng làm tăng tỉ lệ thành thục trứng chất lƣợng phôi sau thụ tinh ống nghiệm Cụ thể tỉ lệ thành thục trứng tăng từ 59,57±1,00 %, lên 76,39 ± 2,05% tỉ lệ phôi dâu từ 23,40±4,93% lên 37,92±0,54% nang >3mm Tế bào sợi thai chuột có tác dụng tƣơng thích so với tế bào màng vòi trứng việc nâng cao tỉ lệ thành thục trứng tỉ lệ phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm Với môi trƣờng bổ sung tế bào sợi thai chuột làm tăng tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phơi dâu-phơi nang 13,94±0,60% , cịn với mơi trƣờng bổ sung tế bào màng vịi trứng tỉ lệ đạt 12,38±1,11% với lô đối chứng đạt 9,57±3,07% Việc bổ sung hai loại tế bào (tế bào sợi thai chuột tế bào màng vòi trứng) làm tăng tỉ lệ thành thục trứng tỉ lệ phát triển phôi giai đoạn sau Tuy nhiên sử dụng hai loại tế bào vào q trình ni trứng khơng cho tỉ lệ thành thục trứng tỉ lệ phát triển phôi cao so với việc sử dụng tế bào sợi thai chuột Trong tỉ lệ phơi dâu/trứng chia, phơi dâu-phơi nang/trứng chia lơ thí nghiệm (38,49±0,53% 13,65±0,44%) cao lô đối chứng (23,40±4,93% 9,57±3,07%) KIẾN NGHỊ Từ kết thu đƣợc đƣa kiến nghị nhƣ sau: Với quy trình thụ tinh ống nghiệm trứng lợn thu Việt Nam, sử dụng loại tế bào đệm (tế bào sợi thai chuột tế bào màng vịi trứng) vào q trình ni trứng để nâng cao chất lƣợng trứng phôi 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỘT SỐ HÌNH ẢNH THU ĐƢỢC TRONG QUÁ TRÌNH THÍ NGHIỆM 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1:Thai chuột 14 ngày tuổi (X2) Hình 2: Miếng thai chuột(X2) Hình 3: Tế bào sợi thai chuột sau ni Hình 4: Tế bào sợi thai chuột sau ngày (X1000) ni 10 ngày(X1000) 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 5: Vịi trứng lợn(X3( Hình 6: Tế bào màng vịi trứng sau thu(X100) Hình 7: Các cụm tế bào màng Hình 8: Một cụm tế bào màng vịi trứng sau ni ngày (X100) vịi trứng điển hình (X600) 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn A Nang trứng C B A A Hình 9: Buồng trứng lợn thu từ lị mổ Hình 10: Trứng lợn sau thu (X2) (x100) Tế bào cumulus cu Hình 11: Trứng lợn sau ni 22 Hình 12: Trứng lợn ni mơi (x100) trƣờng bổ sung tế bào màng vịi trứng (x400) 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Thể cực Hình 13: Trứng thành thục sau tách Hình 14: Trứng giai đoạn bóng mầm cumulus (x1600) (X3000) Hình 15: Trứng giai đoạn metaphase I Hình 16: Giai đoạn metaphase II (X3000) (X1000) 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tế bào tế bào tế bào Hình 17: Phơi giai đoạn tế bào Hình 17: Phơi tế bào Hình 18: Phơi dâu Hình 19: Phơi nang 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Xuân Nguyên (2003), “Phát triển công nghệ phôi tế bào phôi Việt Nam”, Kỷ yếu viện công nghệ sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 411 - 417 Bùi Xuân Nguyên, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ứơc, (1994), “Kết bƣớc đầu nghiên cứu nuôi trứng thụ tinh in vitro trâu bị”, Kỷ yếu Viện Cơng nghệ sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Tr 166-168 Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, Nguyễn Quốc Đạt (2003), “Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm heo”, Báo cáo khoa học; Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr 639 - 642 Nguyễn Thị Ƣớc, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Trần Thị Thơm, Nguyễn Thị Mến, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, Bùi Xuân Nguyên, (2008) “Nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa tổ hợp công nghệ ống nghiệm nhân vơ tính” Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 625-635 Nguyễn Thị Ứơc, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Thùy Anh, Hồng Nghĩa Sơn, Dƣơng Đình Long, Bùi Xn Ngun, (2003), “Sản xuất bê sữa thụ tinh ống nghiệm cấy phơi xác định giới tính, Tài liệu hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, Tr 717- 719 A Nader Fatehi et al Presence of cumulus cells during in vitro fertilization protects the bovine oocyte against oxidative stress and 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn improves first cleavage but does not affect further development Zygote (Cambridge, England) 2005;13(2):177-85 Archibong AE et al Development of porcine embryos from one- and two-cell stages to blastocysts in culture medium supplemented with porcine oviductal fluid Biol Reprod 1989: 41: 1076-1083 Barry D., Bavister B D (2002), “Early history of in vitro fertilization”, Reproduction 124, pp 181-196 Beckmann, L S., Day, B N (1993), “Effects of media NaCl concentration and osmolarity onthe culture of early-stage porcine embryos and the viability of embryos cultured in a selected superiormedium”, Theriogenol 39, pp 611-622 10 Brakett B G., Bousquet D., Boice M L., Donawick W J., Evans J F and Dressel M A (1982), “Normal development following in vitro fertilization in the cow”, Biol Reprod 2, pp 147-158 11 Buhi W C., Alvarez I.M and Kouba A J (2000), “Secreted proteins of the oviduct Cells Tissues Organs”, 166, pp 165-179 12 Coskun et al Effects of transforming growth factors and activin- A on in vitro porcine oocyte maturation Mol, Reprod Dev 1994: 38: 153-159 13 Chen L et al Identification of a factor in fetal bovine serum that stabilizes the cumulus extracellular matrix J Biol Chem 1992: 267:12380–12386 14 Chen L et al Proteins of the inter-alpha-trypsin inhibitor family stabilize the cumulus extracellular matrix through their direct binding with hyaluronic acid J Biol Chem 1994: 269:28282–28287 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 Cheng W T K., Moor R M., Polge C (1986), “In vitro fertilization of pig and sheep oocytes matured in vivo and in vitro”, Theriogenology, pp 25:146 16 Ding et al Effect of protein synthesis on maturation, sperm penetration, and pronuclear development in porcine oocytes Mol, Reprod Dev 1992: 33: 59-66 17 Eric J Schoevers et al Nuclear and cytoplasmic maturation of sow oocytes are not synchronized by specific meiotic inhibition with roscovitine during in vitro maturation Theriogenology 2005;63(4):1111-30 18 Freeman M., Whitworth M and Hill G (1995), “Granulosa cell coculture enhances human embryo development and pregnancy rate following in-vitro fertilization”, Hum Reprod 10, pp 408-414 19 Gandolfi F., Moor R M (1987), “Stimulation of early embryonic development in the sheep by co- with oviduct epithelial cells”, J Reprod Fertil 81(1), pp 23-28 20 Hatoya S., Sugiyama Y., Torii R., Wijewardana V., Kumagai D., Sugiura K (2006), “Effect of co-culturing with embryonic fibroblasts on IVM, IVF and IVC of canine oocytes”, Theriogenology, 66(5), pp 1083-1090 21 HG Verhage et al The baboon oviduct: characteristics of an oestradioldependent oviduct-specific glycoprotein Human Reproduction Update 1997, Vol 3, No pp 541–552 22 Hyttel P et al Ultrastructural abnormalities of in vitro fertilization of in vitro matured bovine oocytes Anatomy and Embryology April II 1988, Volume 178, Issue 1, pp 47-52 70 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 23 Hajializadeh, N The development of mouse early embryos in vitro in fibroblasts and cumulus cells co-cultures supplemented with retinoic acid Iranian Journal of Veterinary Research, Shiraz University, Vol 9, No 1, Ser No 22, 2008 24 H Funahashi et al Effects of the d uration of the exposure to h ormone supplements on cytoplasmic maturation of pig oocytes in vitro J Reprod Fertil 06/1993; 98(1):179-85 25 Hiroyuki Suzuki et al In vitro fertilization and polyspermy in the Pig: Factors affecting fertilization rates and cytoskeletal reorganization of the oocyte Microscopy research and technique 2003: 61:327-334 26 Kikuchi K et al Development to the blastocyst stage of immature pig oocytes arrested before the metaphase-II stage and fertilized in vitro Animal Reproduction Science 2005 90: 307-28 27 Laurincik J et al 1994 Pronucleus development and DNA synthesis in bovine zygotes in vivo Theriogenology 1994: 42: 1285-1293 28 Laura C Bolling The effect of growth hormone on pig embryo development in vitro and an evaluation of sperm mediated gene transfer in the pig Animal and poultru sciences,2001 29 Li X et al Influence of co-culture during maturation on the developmental potential of equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) Reproduction 2001 Jun;121(6):925-32 30 Mahmoud Heidari et al Effect of fibroblast co-culture on in vitro maturation and fertilization of mouse preantral follicles.International journal of fertility and sterllity Vol5, No1, Apr-Jun 2011, pages: 1-8 31 Nagai T et al Effect of oviduct cells on the incidence of polyspermy in pig eggs fertilized in vitro Mol Reprod Dev 1990 Aug;26(4):377-82 71 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Department of Molecular Embryology, Institute of Animal Physiology and Genetics Research, Babraham, Cambridge, United Kingdom 32 Park J S., Han Y M., Lee C S., Kim S J., Kim Y.H., Lee K J., Lee K S and Lee K K (2000), “Improved development of DNA-injected bovine embryos co-cultured with mouse embryonic fibroblast cells”, Anim Reprod, Sci, 59, pp 13-22 33 Pavasuthipaisit K., Lhuangmahamongkol S., Tocharus C., Kitiyanant Y., Prempree P (1994), “Porcine oviductal cells support in vitro bovine embryo development”, Theriogenology, 41 (5), pp 1127-38 34 Prather, R.S et al Development of early porcine embryos in vitro and in vivo Biology of reproduction,59,pp.451-455 35 I.K.Komg et al Coculturing denuded oocytes during the in vitro maturation of bovine cumulus oocyte complexes exerts a synergistic effect on embryo development Theriogenology, 2011 36 Salustri A et al Hyaluronic acid synthesis by mural granulosa cells and cumulus cells in vitro is selectively stimulated by a factor produced by oocytes and by transforming growth factor-b J Biol Chem 265:19517– 19523 37 Salustri A et al Mouse oocytes regulate hyaluronic acid synthesis and mucification by FSH-stimulated cumulus cells Dev Biol 1990: 138:26–32 38 Somfai T et al Development to the blastocyst stage of immature pig oocytes arrested before the metaphase II stage and fertilized in vitro Animal reproduction science,2005, 90(3),pp.307-328 39 Terlouw,S.L et al In vitro development of nuclear transplant pig embryos Theriogenology,37,pp.309-312 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 Zai-Dong Hua et al Effect of cumulus-oocyte complexes (COCs) culture duration on in vitro maturation and parthenogenetic development of pig oocyte 41 X Lucas Influence of follicle size on the penetrability of immature pig oocytes for homologous in vitro penetration assay.Theriogenology 60(4):659-67 42 Foxcroft GH et al Basic physiology of follicular maturation in the pig J Reprod Fertil Suppl, 1985, 33:1-19 43 H Gonzales Figueroa et al Maturation of pig oocytes in vitro in a medium with p yruvate Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2005) 38: 869-872 44 White K L., Hehnke K., Rickords L F., Southern L L., Thompson D L Jr., Wood T C (1989), “Early embryonic development in vitro by coculture with oviductal epithelial cells in pigs”, Sep 41(3), pp 425-430 45 Wiemer K E., Cohen J., Tucker M J and Godke R A (1998), “The application of co-culture in assisted reproduction: 10 years of experience with human embryos”, Hum Reprod 13, pp 226-238 73 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... Tế bào trình thành thục, thụ tinh tế bào trứng lợn 12 1.1 Cấu tạo buồng trứng lợn 12 1.2 Cấu tạo tế bào trứng 13 1.3 Sự thành thục tế bào trứng 14 1.3.1 Sự thành thục nhân 14 1.3.2 Sự thành thục. .. thành thục tế bào trứng Sự thành thục tế bào trứng bao gồm thành thục nhân thành thục tế bào chất Sự thành thục tế bào chất gắn liền tách rời với thành thục nhân (Schoevers cs, 2005) Ở lợn, nuôi trứng. .. thục trứng lợn 17 2.2 Thụ tinh phát triển phôi in vitro lợn 19 Ảnh hƣởng co- culture với tế bào đệm lên thành thục trứng 23 phát triển phôi 3.1 Tế bào màng vòi trứng, vai trò tế bào màng vòi trứng