cứu
a) Phương pháp tạo thạch fibrin để thử khả năng phân giải fibrin của các chất
Do điều kiện phòng thí nghiệm, phương pháp được tiến hành có sự khác biệt so với phương pháp của Ekio Ohta (2008) [51]. Fibrin được tách trực tiếp từ huyết tương nghèo tiểu cầu.
Bước 1: Tạo màng fibrin [14]
+ Chuẩn bị fibrin thử: Li tâm máu lợn khỏe mạnh (đã được chống đông) với tốc độ 1.500 vòng/phút trong 5 phút thu được huyết tương nghèo tiểu cầu.
+ Tạo fibrin: dung dịch NaCl 0,9%: 50ml; huyết tương nghèo tiểu cầu: 1ml; dung dịch CaCl2 0,1M: 0,8ml
+ Khuấy kĩ bằng đũa thủy tinh (một đầu đã mài ráp). Để tủ ấm 2 – 3 giờ ở 370C (đũa thủy tinh vẫn cắm trong cốc). Sau đó đổ thêm vào cốc khoảng 20ml dung dịch NaCl 0,9% cho cục fibrin tách khỏi cốc, bám vào đũa thủy tinh. Ấn nhẹ đũa thủy tinh vào thành cốc, vừa ấn vừa cuộn. Fibrin sẽ bám vào thành đũa thủy tinh
thành một màng mỏng. Đổ phần nước còn lại trong cốc, thay bằng dung dịch NaCl 0,9% để rửa màng fibrin dính ở đầu đũa thủy tinh. Rửa lại bằng nước.
+ Tách màng fibrin ra khỏi đũa thủy tinh, đặt vào đĩa petri
+ Bước tạo màng fibrin được lặp lại nhiều lần và thu fibrin vào các đĩa petri.
Bước 2: Đông khô fibrin
+ Sau khi tách được fibrin, tiến hành đông khô fibrin. Phương pháp đông khô là phương pháp tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển nước từ trạng thái đá (rắn) sang trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng [60]. Tiến hành tiền đông ở nhiệt độ – 850C; đông khô ở nhiệt độ – 550
C, áp suất 0,055mBar.
Bước 3: Tạo đĩa thạch fibrin
+ Cân khoảng 0,25 g fibrin đông khô. Nghiền fibrin trong chày cối sứ, thêm nước vừa đủ 20ml theo nguyên tắc đồng lượng thu được hỗn dịch fibrin trong nước
+ Cân 2,0g thạch, phân tán thạch vào trong 80ml nước. Đun cho thạch tan hết. Để nguội đến nhiệt độ 450C thu được dung dịch thạch
+ Thêm dần dần dung dịch thạch vào 20ml hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng. Cốc đựng hỗn dịch fibrin được đặt trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút để đảm bảo phân tán đồng nhất thạch và fibrin. Sau khi tạo thành, hỗn dịch thạch – fibrin được đổ vào các đĩa petri đã chuẩn bị từ trước. Khi thạch đông lại thì có thể thử khả năng phân giải fibrin của các mẫu bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.
b) Các mẫu nghiên cứu
Mẫu đối chứng: Nattospes
Chuẩn bị mẫu chứng Nattospes: cân bột trong nang Nattospes vào cốc có mỏ. Phần bột được hòa tan vào 10ml dung dịch đệm phosphate pH 7,6. Lọc bỏ phần cắn không tan, thu lấy phần dịch trong. Phần dịch trong là mẫu chứng Nattospes có hàm lượng 300FU/10ml.
Bốn mẫu thử: dịch lên men (dịch trong) từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto (24h, 370C) với hai tốc độ tốc độ lắc (100v/p và 150v/p); dịch chiết enzym (kết tủa hai dịch lên men trên bằng amoni sulfat 60% bão hòa).
Một mẫu trắng: đệm phosphat pH 7,6.