30 độ C 37 độ C
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto
của B. subtilis natto
B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, lượng oxy ảnh hưởng lớn tới
q trình trao đổi chất và tích lũy các sản phẩm sinh tổng hợp của vi sinh vật. Vì vậy, tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc tới hoạt độ enzym ngoại bào của B. subtilis natto.
Mục đích: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh
tổng hợp enzym ngoại bào của B. subtilis natto
Tiến hành: Nuôi cấy B. subtilis natto trong trong 2 mẫu, mỗi mẫu gồm 3
bình nón chứa 100ml môi trường canh thang theo phần 2.3.1 c, nuôi vi sinh vật
trong máy lắc ở hai điều kiện lắc là 100v/p và 150v/p. Sau 24h lên men, đem li tâm mơi trường ni cấy (4.000 vịng/20 phút) để thu riêng phần dịch trong hay dịch lên men. Tiếp theo, tách chiết protease từ dịch lên men bằng amoni sulfat 60% bão hòa thu được dịch chiết enzym theo phần 2.3.3. Thử và so sánh hoạt tính enzym của
dịch lên men và dịch chiết enzym giữa các mẫu theo nguyên tắc khuếch tán trên thạch theo phần 2.3.2. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Bảng 3.9. Đường kính vịng phân giải casein (dcasein ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc dcasein (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ∆p (%) 100v/p 17,56 17,78 18,13 17,82 ± 0,29 4,60 150v/p 18,44 18,63 18,98 18,68 ± 0,27 0
Bảng 3.10. Đường kính vịng phân giải tinh bột (dtinh bột ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc dtinh bột (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ∆p (%) 100v/p 12,37 12,76 12,25 12,66 ± 0,27 6,12 150v/p 11,69 12,23 11,87 11,93 ± 0,27 0
Bảng 3.11. Đường kính vịng phân giải CMC (dCMC) của dịch lên men khi nuôi
cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc dCMC (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ∆p (%) 100v/p 11,12 11,48 11,54 11,38 ± 0,23 0,14 150v/p 11,26 11,52 11,78 11,52 ± 0,26 0
Kết quả trung bình đường kính vịng phân giải các cơ chất của dịch lên men ở các điều kiện tốc độ lắc được thể hiện trên Hình 3.3
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới hoạt tính enzym ngoại bào trong dịch lên men
Bảng 3.12. Đường kính vịng phân giải cơ chất ( cơ chất) của dịch chiết enzym khi
nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau
Cơ chất Tốc độ lắc Casein Tinh bột CMC casein ∆p (%) tinh bột ∆p (%) CMC ∆p (%) 100v/p 22,33 ± 0,27 7,00 14,98 ± 0,31 8,31 15,60 ± 0,23 2,86 150v/p 24,01 ± 0,22 0 13,83 ± 0,25 0 16,06 ± 0,26 0 Nhận xét:
Từ kết quả hoạt độ các enzym ngoại bào trong dịch lên men thể hiện qua đường kính vịng phân giải cơ chất ở Bảng 3.9, Bảng 3.10, Bảng 3.11 thấy: Khi
thay đổi tốc độ lắc thì hoạt tính của protease, amylase, cellulase có sự thay đổi, nhưng mức độ thay đổi không giống nhau.
Đường kính vịng phân giải cơ chất casein của dịch lên men khi lắc với tốc độ 150v/p là 18,68mm lớn hơn so với khi lắc ở 100v/p (17,82mm). Nuôi cấy B. subtilis natto ở điều kiện lắc 150 v/p, vi khuẩn sinh tổng hợp amylase ít hơn so với
khi lắc ở 100v/p ( tinh bột ở tốc độ lắc 150v/p; 100v/p lần lượt là 11,93mm; 12,66 0
5 10 15 20
Protease Amylase Cellulase
100v/p 150v/p dcơ ch ất (m m ) (Enzym)
mm). Mức độ chênh lệch về hoạt độ protease, amylase giữa hai tốc độ lắc lần lượt là
4,60% và 6,12%. Từ phân tích t-Test về casein; tinh bột thấy (| t |˃ t Critical two-tail), chứng tỏ khả năng sinh protease, amylase của vi khuẩn bị ảnh hưởng nhiều khi thay đổi điều kiện tốc độ lắc. Còn hoạt độ cellulase khi nuôi cấy B. subtilis natto ở hai tốc độ lắc gần như tương đương, mức chênh lệch nhỏ ∆p: 0,14%; | t |≤ t Critical
two-tail.
Sau khi chiết tách enzym bằng amoni sulfat 60% bão hòa (Bảng 3.12) thấy hoạt độ protease khi nuôi vi khuẩn với điều kiện tốc độ lắc 150v/p lớn hơn nhiều so với ở 100v/p ( casein ở điều kiện lắc 150v/p và 100v/p lần lượt là 24,01mm và 22,33mm) độ chênh lệch lớn (∆p: 7,00%). Về các enzym amylase, cellulase thì
thấy: đường kính vịng phân giải cơ chất tinh bột khi lắc ở 100v/p lớn hơn nhiều so với lắc 150v/p ( tinh bột ở điều kiện lắc 150v/p và 100v/p tương ứng là 13,83mm và 14,98mm), chênh lệch ∆p lớn (8,31%). Sau khi chiết tách enzym bằng amoni sulfat 60% bh, mức độ chênh lệch hoạt độ cellulase ở hai điều kiện tốc độ lắc trong dịch chiết enzym hơn so với trong dịch lên men (chênh lệch ∆p ở dịch lên men và dịch chiết enzym lần lượt là 0,14% và 2,86%). Tuy nhiên, mức chênh lệch này là không nhiều.
Bàn luận:
Kết quả thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ming Fei-ping (2009) B. natto phát tiển mạnh mẽ hơn khi tốc độ lắc ở 150v/p so với ở 100v/p. Một số tác giả lựa chọn tốc độ lắc 150v/p để nghiên cứu tách chiết protease [20], [50]. Một số tác giả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tốc lắc tới thời hoạt độ enzym của B. subtilis nói chung và B. subtilis natto nói riêng. Sun Yue-e và Qian He (2005) khảo sát tốc độ lắc (150v/p; 180v/p; 200v/p) kết quả cho thấy lên men điều kiện lắc 180v/p vi sinh vật phân lập từ đậu tương Douchi sinh tổng hợp nhiều enzym tiêu fibrin nhất [61]. Theo nghiên cứu của Ming Fei-ping (2009) B. natto phát triển
mạnh mẽ nhất khi lắc ở tốc độ 200v/p [60]. Nghiên cứu của B. Christudhas Williams et al. (2012) về tối ưu hóa điều kiện lên men B. subtilis cho mục tiêu tách
cho thấy ở nhiệt độ 370C và tốc độ lắc 180v/p, vi sinh vật sinh tổng hợp nhiều protease nhất [54].
Kết luận sơ bộ:
Lựa chọn điều kiện tốc độ lắc khi lên men B. subtilis natto là 150v/p để thu được protease với hoạt độ cao, đồng thời hạn chế được hoạt độ của hai enzym tạp cellulase và amylase.