Kết quả:
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein (dcasein) của dịch lên men ở các
thời điểm khác nhau
Thời điểm dcasein (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ∆p (%) 24h 17,81 17,35 17,69 17,62 ± 0,24 0 48h 18,38 17,86 18,18 18,14 ± 0,26 2,95 72h 17,98 17,55 17,96 17,83 ± 0,24 1,19
Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải tinh bột (dtinh bột) của dịch lên men ở các thời điểm khác nhau
Thời điểm dtinh bột Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ∆p (%) 24h 12,64 12,94 12,58 12,72 ± 0,19 0 48h 13,84 13,91 13,63 13,79 ± 0,15 8,41 72h 13,05 13,29 13,02 13,12 ± 0,15 3,14
Bảng 3.3. Đường kính vòng phân giải CMC (dCMC) của dịch lên men ở các
thời điểm khác nhau
Thời điểm dCMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ∆p (%) 24h 11,02 11,46 11,36 11,28 ± 0,23 0 48h 12,12 12,46 12,49 12,36 ± 0,21 9,57 72h 11,86 12,13 12,07 12,02 ± 0,14 6,56
Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải các cơ chất của dịch lên men tại các thời điểm được thể hiện trên Hình 3.1
Hình 3.1. Biến thiên hoạt độ enzym ngoại bào trong dịch lên men theo thời gian nuôi cấy B. subtilis natto
0 5 10 15 20 24 48 72
Protease Amylase Cellulase dcơ ch ất (m m ) thời gian (h)
Kết quả đường kính vòng phân giải các cơ chất của dịch chiết enzym (dịch lên men sau tách chiết protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa) ở các thời điểm thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Đường kính vòng phân giải cơ chất ( cơ chất) của dịch chiết enzym ở các
thời điểm khác nhau
Cơ chất Thời điểm Casein Tinh bột CMC casein ∆p (%) tinh bột ∆p (%) CMC ∆p (%) 24h 22,94 ± 0,27 0 14,65 ± 0,16 0 14,02 ± 0,14 0 48h 23,96 ± 0,28 4,45 15,93 ± 0,21 8,73 15,14 ± 0,19 7,99 72h 23,04 ± 0,23 0,44 15,21 ± 0,17 3,82 14,54 ± 0,16 3,71 Nhận xét:
Hoạt độ các enzym ngoại bào của dịch lên men được thể hiện qua đường kính vòng phân giải cơ chất tương ứng. Từ Bảng 3.1,Bảng 3.2,Bảng 3.3 thấy: hoạt độ cả ba enzym (protease, amylase, cellulase) có sự thay đổi khi thay đổi thời gian nuôi cấy. Sau 48h nuôi cấy, B. subtilis natto sinh tổng hợp nhiều protease nhất (thể hiện casein của dịch lên men sau 24h, 48h, 72h nuôi cấy tương ứng là 17,62mm; 18,14mm; 17,83mm). Tuy nhiên, sự chênh lệch về hoạt độ protease giữa các thời điểm là không đáng kể. Chênh lệch hoạt độ protease ở thời điểm 48h; 72h so với thời điểm 24h tương ứng là 2,95%; 1,19%.
Sau khi so sánh kết quả tinh bột và CMC ở các thời điểm bằng phương pháp Anova thấy (F>Fcrit) chứng tỏ thời điểm thu enzym có ảnh hưởng tới hoạt độ amylase và cellulase. Kết luận có ý nghĩa thống kê pvalue<0,05. Tại thời điểm 48h, hoạt độ amylase là cao nhất tinh bột sau 48h là 13,79mm, lớn hơn nhiều so với hoạt độ amylase sau thời điểm 24h (chênh lệch ∆p: 8,41%). Hoạt độ của cellulase tăng sau 48h nuôi cấy ( CMC: 12,36 mm) cao hơn hẳn so với sau 24h và 72h lên men ( CMC tại 24h, 72h lần lượt là 11,28 mm; 12,02 mm).
B. subtilis natto sinh tổng hợp enzym ngoại bào (protease, amylase, cellulase) nhiều nhất sau 48h nuôi cấy. Sau 72h nuôi cấy, hoạt độ của cả ba enzym đều giảm so với thời điểm 48h.
Từ Bảng 3.4 thấy: sau khi chiết tách protease bằng amoni sulfat 60% bh cho kết quả tương tự ở dịch lên men. Đường kính vòng phân giải casein lớn nhất là
casein: 23,96mm thu được sau 48h nuôi cấy, chênh lệch không nhiều so với casein ở 24h, 72h. Hoạt độ amylase, cellulase của dịch chiết enzym tại thời điểm 48h cao nhất, chênh lệch nhiều so với hoạt độ ở 24h (∆p tương ứng theo amylase, cellulase là 8,73% và 7,99%).
Do mức độ chênh lệch hoạt độ protease giữa các thời điểm không nhiều, mặt khác mục tiêu của nghiên cứu là lựa chọn thời gian lên men để tạo điều kiện cho quá trình thu nhận, tách chiết protease (hạn chế sự có mặt của các enzym tạp cellulase, amylase) nên lựa chọn thời gian lên men B. subtilis natto là 24h. Việc lựa chọn thời gian nuôi cấy 24h sẽ tiết kiệm nhiều chi phí khi lên men ở quy mô công nghiệp.
Bàn luận:
Sau 72h nuôi cấy, hoạt độ của cả ba enzym đều giảm so với thời điểm 48h. Sự giảm hoạt độ các enzym theo thời gian nuôi cấy có thể giải thích bởi nhiều lý do: thành phần môi trường thay đổi, lượng dinh dưỡng giảm… làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzym bất hoạt. Hơn nữa, có thể xảy ra hiện tượng autolysis (hiện tượng enzym bị thủy phân) hoặc do vi khuẩn tổng hợp nên các chất kìm hãm trong môi trường.
Có nhiều công trình nghiên cứu khảo sát về hoạt độ enzym ngoại bào của B. subtilis nói chung và B. subtilis natto nói riêng theo thời gian nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây. Theo Sun Yan (2011) trên B. subtilis natto, sau 48h vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase cao nhất [57]; nghiên cứu của Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) cũng cho thấy sau 48h nuôi cấy một số chủng Bacillus cho hoạt độ nattokinase cao hơn so với thời điểm 24h [8]. Một số tác giả lựa chọn thời gian lên men B. subtilis natto là 24h để tạo điều kiện cho quá trình
chiết tách protease [18], [20]. Theo E. M. El-Safey (2004) thì sau 24h lên men B. subtilis sinh tổng hợp nhiều protease nhất [24]. Theo Shabeb Mohamed S.A. (2010) sau 24h nuôi cấy ở 400C cho hoạt độ cellulase cao nhất ở B. subtilis OK2 [46]. Peddapalli Siva Rasagnya (2013) khảo sát trên B. subtilis NCIM 2724 tại các thời điểm 12h, 24h, 48h, 60h, 72h thì hoạt độ nattokinase cao nhất là 653μg/ml sau nuôi cấy 24h [42].
Kết luận sơ bộ:
Thời điểm thích hợp để thu enzym ngoại bào từ môi trường lên men B. subtilis natto là 24h. Tiếp tục chọn 24h là thời gian lên men cho các nghiên cứu tiếp theo.