Xây dựng phương pháp định lượng vitamin b5 trong viên nang mềm carmanus

Vitamin đóng vai trò là các chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất đến xây dựng hệ thống miễn dịch của cơ thể.Vitamin có vai trò đặc biệt quan trọng trong v

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS NGUYỄN THỊ KIỀU ANH

2 ThS NGÔ MINH THÚY

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất

2.Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc nhất đến

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Dược

phẩm Quốc gia, Ths Ngô Minh Thúy – Giảng viên bộ môn Hóa phân tích –

Độc chất đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia,

bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và bộ môn Vật lý – Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô và các anh chị đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để em có thành quả như này hôm nay

Em xin cảm ơn gia đình, bạn bè – những người đã luôn ở bên giúp đỡ em trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Đỗ Minh Hậu

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vitamin B 5 3

1.1.1 Công thức hóa học 3

1.1.2 Nguồn gốc 3

1.1.3 Tính chất lý hóa 3

1.1.4 Tác dụng và cơ chế tác dụng 3

1.1.5 Một số phương pháp định lượng vitamin B 5 4

1.1.6 Một số chế phẩm chứa vitamin B 5 lưu hành trên thị trường 5

1.2 Vài nét về viên nang mềm Carmanus 6

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3.1 Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3.2 Cấu tạo hệ thống HPLC 9

1.3.3 Các thông số đặc trưng trong HPLC 11

1.3.4 Pha tĩnh trong HPLC 13

1.3.5 Pha động trong HPLC 14

1.3.6 Một số phương pháp định lượng trong HPLC 15

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Điều kiện thực nghiệm 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Hóa chất, dung môi 17

2.1.3 Dụng cụ thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch pha mẫu và dung dịch chuẩn 18

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 18

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 19

2.3.4 Ứng dụng định lượng vitamin B 5 trong viên nang mềm Carmanus 20 2.4 Phương pháp xử lí kết quả 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp phân tích 23

3.1.1 Xác định điều kiện sắc ký 23

3.1.2 Xây dựng qui trình xử lí mẫu 26

3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 27

3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 27

3.2.2 Độchọn lọc 28

3.2.3 Khoảng tuyến tính 30

3.2.4 Độ đúng 32

3.2.5 Độ lặp lại 33

3.2.6 Độ chính xác trung gian 34

3.3 Kết quả định lượng vitamin B 5 trong viên nang mềm Carmanus 35

3.4 Bàn luận 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ KIỆU VIẾT TẮT

Acetonitril Methanol Pha đảo

Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn Sắc ký đồ

Số thứ tự Diện tích pic Thời gian lưu Trung bình Dược điển Mỹ

Tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa vitamin B 5 lưu hành trên thị trường 6

Bảng 3.1 Kết quả độ phù hợp hệ thống 28

Bảng 3.2 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 30

Bảng 3.3 Kết quả xác định khoảng tuyến tính 31

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 32

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 34

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian 35

Bảng 3.7 Kết quả định lượng 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin B 5 (Calci pantothenat) 3 Hình 1.2 Sơ đồhệ thống HPLC 9 Hình 3.1.SKĐ vitamin B 5 chuẩn khảo sát tỉ lệ thành phần pha động 25 Hình 3.2 SKĐ phân tích viên nang mềm Carmanus với hệ pha động MeOH - dung dịch KH 2 PO 4 0,05M pH 2,5 (10 : 90) 25 Hình 3.3 Kết quảđánh giá độchọn lọc của phương pháp 29 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mỗi quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng

độ vitamin B 5 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vitamin là những chất không thể thiếu trong cuộc sống hàng ngày của mỗi con người Vitamin đóng vai trò là các chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất đến xây dựng hệ thống miễn dịch của cơ thể.Vitamin có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, duy trì các hoạt động sống của cơ thể.Chính bởi vậy, đã từ lâu vitamin có mặt rất nhiều trong các chế phẩm đa sinh tố, các sản phẩm dinh dưỡng[3].Hiện nay,

sự có mặt của vitamin trong các sản phẩm thuốc chữa bệnh ngày càng nhiều nhằm tác dụng hỗ trợ điều trị hoặc phối hợp với các hoạt chất chính để tạo ra

tác dụng hiệp đồng.Carmanus - viên nang mềm của công ty cổ phần

Traphaco là một trong những sản phẩm đó

Carmanus có thành phần chính là các hoạt chất chiết từ cây Carduus

marianuskết hợp với các vitamin nhóm B (B1, B2, B3, B5, B6) được bào chế dưới dạng viên nang mềm giúp cho việc điều trị và dự phòng gan nhiễm mỡ đạt hiệu quả cao.Các vitamin nhóm B đóng một vai trò quan trọng trong chuyển hóa trung gian, phục hồi các nhu mô gan tổn thương, hiệp đồng tác

dụng với các hoạt chất chính có trong cây Carduus marianus[21].

Hiện nay, một số kết quả phân tích cho thấy có sự sụt giảm hàm lượng vitamin B5 trong một số sản phẩm thuốc nang mềm trong đó có Carmanus

ngay cả khi sản xuất mới được ít tháng.Vì vậy, cần có phương pháp định lượng vitamin B5một cách khách quan hơn.Một trong những phương pháp phổ biến, có độ chính xác cao và được các nhà sản xuất ứng dụng nhiều đó là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.Tuy vậy đối với các dạng bào chế

tiến hành định lượng mà ở đây là dạng bào chế viên nang mềm.Trong khi

thuốc dưới dạng bào chế viên nang mềm bằng HPLC còn ít.Dược điển

Mỹ[18] cũng đưa ra một số phương pháp định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm bằng HPLC nhưng trong các chế phẩm đa vitamin và khoáng chất, chưa có thành phần dược liệu.Thông thường cách định lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc nang mềm trải qua các giai đoạn: lấy thuốc trong nang, làm đồng nhất, cân thuốc, sau đó xử lí với qui trình thích hợp rồi tiến hành định

đọng vào thành vỏ nang vì vậy cần có cách xử lí phù hợp để có thể chiết được hoàn toàn vitamin B5

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng

phương pháp định lượngvitamin B 5 trong viên nang mềm Carmanus” bằng

sắc ký lỏng hiệu năng caovới 2 mục tiêu chính:

1 Xây dựng phương pháp định lượng vitamin B 5 trong viên nang mềm Carmanus

2 Ứng dụng định lượng vitamin B 5 trong viên nang mềm Carmanus bằng phương pháp đã xây dựng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ VITAMIN B 5

1.1.1 Công thức hóa học

Hình 1.1.Công thức cấu tạo của vitamin B 5 (Calci pantothenat) [2], [18] Công thức phân tử:C18H32CaN2O10 [2], [18]

Khối lượng phân tử: 476,5 [2], [18]

Tên khoa học:

Calci bis[(R)-3-(2,4-hydroxy-3,3-dimethylbutyramido)propionate] [2]

1.1.2 Nguồn gốc

các loại thực phẩm Các nguồn tốt nhất là bia men, pho mát, bắp, súp lơ, cải xoăn, cà chua, bơ, các loại đậu, thịt bò, lòng đỏ trứng, thận, gan, tôm hùm, mầm lúa mì, cá hồi, bánh mỳ làm từ ngũ cốc và các loại ngũ cốc…[3]

1.1.3 Tính chất lý hóa

Bột kết tinh màu trắng, hơi hút ẩm.Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroform, ether[2], [18]

trong nước không có CO2) [2]

1.1.4 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Vitamin B5 là tiền chất của coenzyme A cần cho phản ứng acetyl hóa trong tân tạo glucose, giải phóng năng lượng từ carbohydrat, tổng hợp và giáng hóa acid béo, tổng hợp sterol, nội tiết tố steroid, porphyrin, acetylcholin

và những hợp chất khác Vitamin B5 còn có vai trò trong định vị tế bào, sự ổn định và hoạt tính của protein [3]

thể người thiếu hụt vitamin B5 Tuy nhiên nếu thiếu hụt vitamin B5 sẽ kéo theo thiếu hụt coenzym A, lúc đó sẽ xuất hiện các triệu chứng như thoái hóa thần kinh, thiểu năng tuyến thượng thận với các triệu chứng mệt mỏi, nhức đầu, rối loạn giấc ngủ, đau bụng, đầy hơi, dị cảm tay chân, co thắt cơ [3]

1.1.5 Một số phương pháp định lượng vitamin B 5

1.1.5.1 Phương pháp chuẩn độ đo thế

Hòa tan 0,18g chế phẩm Calci pantothenat trong 50 ml acid acetic khan Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M Xác định điểm kết thúc bằng chuẩn độ đo thế[2]

1 ml dung dịch acid percloric 0,1M tương đương với 23,83mg

C18H32CaN2O10

1.1.5.2 Phương pháp HPLC

Dược điển Mỹ (USP) [18] đã đưa ra một số phương pháp định lượng

- Pha động:MeOH –dung dịch đệm tỉ lệ1 :9(dung dịch đệm được pha

- Pha động: MeOH – dung dịch đệm tỉ lệ3 : 97 (dung dịch đệm sử dụng

là dung dịch NaH2PO4 0,2M được điều chỉnh đến pH 3,2 ± 0,1 bằng acid phosphoric 1,7M)

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Thể tích tiêm: 20µl

1.1.6 Một số chế phẩmchứa vitamin B 5 lưu hành trên thị trường

các sản phẩm dinh dưỡng hoặc phối hợp với một số hoạt chất để tạo ra tác dụng hiệp đồng trong các sản phẩm thuốc[3].Các sản phẩm chứa vitamin

B5được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau: viên nén (bao phim, bao đường), viên nang mềm, viên sủi bọt, dung dịch uống, kem… nhằm đáp ứng nhu cầu

1.2 Vài nét về viên nang mềm Carmanus

Carmanuslà một sản phẩm thuốc của công ty cổ phần Traphaco.Carmanus

có thành phần chính là các hoạt chất chiết từ cây Kế sữa (Carduus marianus)

hiệp đồng tác dụng với các vitamin nhóm B, được bào chế dưới dạng viên nang mềmgiúp cho việc điều trị và dự phòng gan nhiễm mỡ đạt hiệu quả cao [21]

Cây Kế sữa là thảo dược đã được sử dụng hàng ngàn năm nay ở các nước châu Âu để điều trị các bệnh về gan mật, bảo vệ gan khỏi các chất độc.Ngày nay ở Mỹ có đến 1/3 dân số trưởng thành sử dụng các sản phẩm từ Kế sữa một cách thường xuyên để chăm sóc sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật [21]

Các thành phần tá dược khác gồm: gelatin, glycerin, nipagin, nipasol, dầu

cọ, dầu đậu nành, ethyl vanillin, sáp ong trắng, aerosol, sorbitol special, lecithin, oxyd sắt đỏ, oxyd sắt nâu, ethanol 96%

Các thành phần trong công thức có tác dụng sau:

Cao Carduus marianus(silymarin, silybin): thúc đẩy sự phát triển của tế

bào gan và ngăn chất độc thấm qua tế bào, làm gia tăng khối lượng gan và protein của microsom, tăng cường giải độc gan do làm tăng sự tạo thành các cytochrom P-450 trong lưới nội bào, làm giảm những tổn thương do thiếu máu cục bộ trên các tế bào không phải mô mềm của gan[6]

Vitamin B1: tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid, ngăn chặn sự ứ đọng các thể cetonic trong máu, bảo vệ gan[3]

Vitamin B2: tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid, lipid, protid góp phần bảo vệ và tăng sức đề kháng cho gan [3]

Vitamin B3: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa cholesterol, acid béo và tạo năng lượng ATP cung cấp cho chuỗi hô hấp tế bào, tăng cường bảo vệ gan, chống lại những độc tố và hóa chất gây hại [3]

Vitamin B5: tham gia vào quá trình tái tạo glucose, phân hủy acid béo, tổng hợp sterol, hormon steroid, porphyrin, hỗ trợ hoạt động chức năng gan [3]

glucid và lipid, tăng cường hỗ trợ và bảo vệ gan [3]

Tác dụng của chế phẩm:

Bảo vệ gan duy trì ổn định màng tế bào gan

Tăng khả năng oxy hóa các acid béo ở gan

Chống hủy hoại tế bào gan, kích thích tái tạo các nhu mô gan

Chỉ định:

Gan nhiễm mỡ, mỡ máu cao

Rối loạn chức năng gan mãn tính, suy gan ở người nghiện rượu bia, bảo

vệ nhu mô gan khi dùng các thuốc có độc tính với gan

Viêm gan cấp và mãn tính, hỗ trợ điều trị suy gan

Liều dùng và cách dùng:

Người lớn: 1 viên/lần × 3 lần/ngày

Trẻ em 6 – 12 tuổi: 1 viên/lần × 1 – 2 lần/ngày

Liệu trình điều trị thông thường từ 4 – 6 tuần

Chống chỉ định:

Mẫn cảm với các thành phần của thuốc

Bệnh nhân đang bị loét dạ dày tiến triển, xuất huyết động mạch, hạ huyết

áp nặng

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1 Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ

số phân bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lí [1]

1.3.2.Cấu tạo hệ thống HPLC

Hình 1.2.Sơ đồhệ thống HPLC [1]

Do bản chất các chất phân tích khác nhau vì vậy có nhiều kĩ thuật để định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau và có cùng 1 số bộ phận như sau:

1.3.2.1.Hệ thống cấp pha động

Pha động trong HPLC thường chứa trong bình thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ Trước khi sử dụng cần lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm để đuổi khí hòa tan.Có 2 cách dùng pha động rửa giải:

Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong qua trình sắc kí

Hệ thống cấp

Bộ phận tiêm mẫu

Cột sắc

ký Detectơ

Hệ thống thu

nhận, xử lí dữ

liệu (máy tính)

Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 dung môi đựng trong các bình khác nhau Tỉ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc kí theo chương trình đã định (chương trình dung môi)[1].

1.3.2.2.Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột sắc ký Yêu cầu chung của hệ thống bơm trong sắc ký lỏng:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (1 psi

= 0,068 atm, 1atm = 1,01 bar)[1]

- Đảm bảo bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01-5 ml/phút [1]

Cột HPLC có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trình sắc ký.Một số cột còn có đầu bảo vệ

Các máy sắc ký lỏng hiện đại còn trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột

1.3.2.5.Detectơ

Chất phân tích được rửa giải trong cột và được phát hiện bởi detectơ Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng các detectơ thích hợp bao gồm các loại sau: UV-VIS, Huỳnh quang, Chỉ số khúc xạ, Tán xạ bay hơi, Điện hóa…[1], [4]

1.3.3.Các thông số đặc trưng trong HPLC

1.3.3.1.Hệ số phân bố K

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

chất tan trong pha động)

K càng lớn chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh càng chậm [1]

1.3.3.2.Thời gian lưu t R

Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột tới khi được phát hiện bởi detectơ.Thời gian lưu càng lớn chất phân tích càng bị lưu giữu mạnh, thời gian phân tích sẽ kéo dài.Thời gian lưu quá ngắn thì khả năng tách kém

Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là xác định.Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện, định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc của hạt nhồi

- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký [1], [8]

1.3.3.3.Hệ số dung lượng k ’

Mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột hay còn được gọi là hệ

số phân bố khối lượng giữa hai pha

k’= .

. = K =

Trong đó: CS, CM lần lượt là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh và pha động

VS, VM lần lượt là thể tích của pha tĩnh và pha động tương ứng

tR là thời gian lưu của chất phân tích, tM là thời gian chết tức thời gian của chất không lưu trữ

pha mà còn phụ thuộc vào tỉ lệ VS/VM

k’ quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài Thường chọn điều kiện sắc kí để

chiều cao pic[1], [4], [8]

1.3.3.6.Hệ số đối xứng F

Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng:

F =Trong đó:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0

Hệ số đối xứng thấp do hiện tượng mở rộng dải (doãng pic), nguyên nhân

có thể do quá trình khuếch tán xoáy, khuếch tán dọc, hoặc quá trình chuyển khối không cân bằng [1], [4], [8]

Trong đó (tR)A và (tR)B là thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B)

WA và WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2A, W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: RS> 1, Giá trị tối ưu RS = 1,5[1], [4], [8]

1.3.4 Pha tĩnh trong HPLC

Pha tĩnh HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ phân tách một hỗn hợp chất phân tích.Đó là những chất rắn xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính hạt thường dao động từ 3 - 10 µm Kích thước hạt càng nhỏ chiều cao đĩa lý thuyết càng giảm nên số đĩa lý thuyết càng tăng Tuy nhiên khi kích thước hạt càng nhỏ áp lực đối với pha động càng lớn khi đó cột phải chịu được áp suất đầu vào cao

Chất nhồi cột cho sắc ký lỏng thường chế tạo từ silica (silic oxyd) bằng cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau [1]

Điều kiện đối với một pha tĩnh:

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc

- Tính chất bề mặt phải ổn định

- Cỡ hạt tương đối đồng nhất

- Cân bằng động học của quá trình tách phải xảy ra nhanh và lặp lại

1.3.5.Pha động trong HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột Là một yếu tố linh động và dễ dàng thay đổi Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi được trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ nhất định

Pha động là một trong những yếu tố quyết định khả năng tách của các chất phân tích trong một hỗn hợp mẫu Nó ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian lưu của các chất phân tích và hiệu quả của quá trình sắc ký.Pha động có thể ảnh hưởng đến:

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu trữ chất tan

- Hiệu lực tách của cột

- Độ phân giải các chất trong pha tĩnh

- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký

Điều kiện đối với pha động:

- Phải trơ với pha tĩnh

- Hòa tan được các chất phân tích

- Bền vững theo thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với các loại detectơdùng để phát hiện các chất phân tích

- Có tính kinh tế và không quá nguy hiểm

Các yếu tố cần chú ý trong lựa chọn pha động:

- Bản chất, thành phần dung môi lựa chọn làm pha động

- Tốc độ dòng pha động

- pH của pha động

1.3.6 Một số phương pháp định lượng trong HPLC

Các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất phân tích tỉ lệvới chiều cao hoặc diện tích pic Các phương pháp thường được sử dụng trong sắc ký là:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại.Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp

so sánh (chuẩn hóa 1 điểm) hoặc đường chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm)

- So sánh (chuẩn hóa 1 điểm): Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng

độ của mẫu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: CX = CS ×

CX, CS: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn

SX, SS: diện tích pic của chất phân tích trong SKĐ mẫu thử và mẫu chuẩn

- Đường chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm):

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn.Sử dụng khoảng tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định: y = ax + b

Trong đó:

y: diện tích pic (hoặc chiều cao)

a: độ dốc của đường chuẩn

b: giao điểm của đường chuẩn với trục tung

x: nồng độ của chất phân tích

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn [1], [4], [8]

CHƯƠNG 2.NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Điều kiện thực nghiệm

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: viên nang mềm Carmanus, số lô: 0217

Vitamin B5 chuẩn (calci pantothenat) hàm lượng 99,0%

2.1.2.Hóa chất, dung môi

- KH2PO4 tinh khiết phân tích (Merck – Đức)

- Dung dịch H3PO4 85 % tinh khiết phân tích (Scharlau – Tây Ban Nha)

- Cloroform tinh khiết phân tích (Việt Nam)

- MeOH tinh khiết HPLC (Merck – Đức)

-Tủ lạnh bảo quản: Haier HYC – 940của Trung Quốc

-Tủ sấy: Memmert ULM – 500 của Đức

-Máy lắc xoáy: Labinco L46của Hà Lan

-Máy hút chân không: 22AN – 18 KNFcủa Đức

-Máy siêu âm: WUC – A22Hcủa Hàn Quốc

-Bình gạn 500ml, pipet thủy tinh, bình định mức, ống đong, cốc có mỏcủa Đức

2.2.Nội dung nghiên cứu

Xây dựng phương pháp định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus bằng HPLC: xác định điều kiện sắc ký, xây dựng qui trình xử lí mẫu

Thẩm định phương pháp với các chỉ tiêu: Độ phù hợp hệ thống, độchọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian

Định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus bằng phương pháp đã xây dựng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch pha mẫu và dung dịch chuẩn

2.3.1.1.Chuẩn bị dung dịch pha mẫu

Dung dịch pha mẫu là dung dịch đệm sử dụng trong pha động

2.3.1.2.Chuẩn bịdung dịchchuẩn gốc

Cân chính xác khoảng 20 mg Calcipantothenat (99,0%) cho vào bình định mức 25 ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung dịch pha mẫu thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng chính xác khoảng0,8 mg/ml

2.3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Hút chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch bằng dung dịch pha mẫu thu được dung dịchchuẩn

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích

Từ kết quả khảo sát lựa chọn các điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus bằng phương pháp HPLC với detectơ UV

2.3.2.2.Xây dựng qui trình xử lí mẫu

Phân tích đặc điểm thành phần của viên nang mềm Carmanus kết hợp với tham khảo các qui trình xử lí mẫu tương tự thu thập được, tiến hành thực nghiệm, từ đó lựa chọn phương pháp xử lí mẫu và xây dựng qui trình xử lí

mẫu phù hợp

2.3.3 Thẩm định phương pháp

2.3.3.1 Độ phù hợp hệ thống

Xác định thời gian lưu tR, diện tích pic Spic, tính RSD của tR và Spic

So sánh thời gian lưu của pic vitamin B5 trên sắc ký đồ (SKĐ)của mẫu

chiều cao và diện tích

Sắc ký đồ của mẫu placebo không được có pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của hoạt chất Nếu có đáp ứng pic thì phải ≤ 1,0 % so với đáp ứng pic củamẫu chuẩn

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính

Chuẩn bị dãy chuẩn (5 điểm) có nồng độ chính xác bằng 50%, 80%, 100%, 120%, 160%so với nồng độ làm việctừ dung dịchchuẩn gốc

Tiến hành chạy sắc ký trong cùng điều kiện

Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ vitamin B5

Yêu cầu: Khoảng tuyến tính có hệ số tương quan r ≥ 0,995

2.3.3.4 Độ đúng

Xác định tỉ lệ lượng hoạt chất tìm lại được so với lượng chuẩn thêm vào nền mẫu placebo ở 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120% so với nồng độ làm việc.Mỗi mức nồng độ làm 3 lần

Yêu cầu: phần trăm lượng tìm lại nằm trong khoảng 98-102%

RSD phần trăm tìm lại tại mỗi nồng độ≤ 2%

2.3.4.Ứng dụng định lượng vitamin B 5 trong viên nang mềm Carmanus

trình xây dựng Làm lặp lại 3 lần.Tính kết quả trung bình hàm lượng vitamin

B5 trong viên so với lượng ghi trên nhãn

2.4.Phương pháp xử lí kết quả

Giá trị trung bình, độ đúng, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi qui, hệ số tương quan hồi quiđược xác định bằng phần mềm Excel 2010

chuẩn có nồng độ tương đương thực hiện song song

Một số công thức tính các giá trị thống kê:

Trong đó xi là giá trị đo mẫu thứ i

xlà giá trị trung bình của các lần phân tích

mC (mg): khối lượng mẫu chuẩn vitamin B5

mt (g): khối lượng mẫu thử

m (g):khối lượng thuốc trung bình trong viên nang mềm Carmanus

St, SC (mAU.s): Diện tích pic vitamin B5 trong SKĐ của mẫu thử và mẫu chuẩn

Vt, VC (ml): thể tích khi chuẩn bị dung dịch gốc trong mẫu thử và mẫu chuẩn

ft, fC: hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1.Xác định điều kiện sắc ký

với nội dung cụ thể như sau:

µm

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 32 mg chuẩn vitamin B5 vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong pha động, pha loãng bằng pha động đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Tiêm sắc ký dung dịch chuẩn và thử

Sau khi tiến hành nhận thấy thời gian phân tích kéo dài và hàm lượng

Để rút ngắn thời gian phân tích và xác định chính xác lượng vitamin B5 có trong viên, chúng tôi tiến hành khảo sát lại điều kiện sắc ký và xây dựng qui trình xử lí mẫu phù hợp hơn

Dựa trên dược điển Mỹ [18] và một số tài liệu tham khảo [13], [16], [17]chúng tôi tiến hành sắc ký với:

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

- Thể tích tiêm: 20 µl

Đối với pha tĩnh:

Trên cơ sở các tài liệu tham khảolựa chọn HPLC pha đảo với cột C18 (4,6

mm × 25 cm; 5µm)[14], [16], [17], [19] Tiến hành khảo sát 2 cột sau:

Hypersil C18 BDS (4,6 mm × 25 cm; 5µm)

Apollo RP C18 (4,6mm × 25 cm; 5µm)

Kết quả thu được cho thấy cột Apollo RP C18 (4,6 mm × 25 cm; 5µm) cho pic đẹp, cân đối rõ ràng

Đối với pha động:

Khảo sát dựa trên hỗn hợp MeOH – nước có pH thích hợp[18], [14] Để

ổn định pH chúng tôi sử dụng dung dịch đệm Dung dịch đệm sử dụng có pH

pH 2,5 bằng acid phosphoric [14], [17], [19]

Về tỉ lệ dung môi pha động, tiến hành khảo sát ở 2 tỉ lệ:

- MeOH - dung dịch KH2PO4 0,05M điều chỉnh đến pH 2,5bằng acid phosphoric tỉ lệ 6 : 94

- MeOH - dung dịch KH2PO4 0,05M điều chỉnh đến pH 2,5 bằng acid phosphoric tỉ lệ 10 : 90

Kết quả được trình bày ở hình 3.1

B5 trên SKĐ có thời gian lưu khoảng 18,3 phút Với MeOH – dung dịch

KH2PO4 0,05MpH 2,5 tỉ lệ 10 : 90, pic của vitamin B5 trên SKĐ có thời gian lưu khoảng 10,3 phút

Nhận xét:So sánh thời gian lưu khi phân tích với 2 tỉ lệ, chúng tôi quyết

vì có thời gian lưu ngắn hơn, tiết kiệm thời gian phân tích mà vẫn đảm bảo