Xây dựng phương pháp định lượng vitamin d2 trong sữa bằng HPLC

BOY TE TRÜÔNG DAI HOC DUOC HÀ NÔI BÙIVIÊT PHlTONG XÂY DUNG PHlTONG PHÂP DINH LÜÛNG • • • VITAMIN D2 TRONG SÜA BÂNG HPLC KHOÂ LU A • n TÔT NGHIÊP • DUOC • s i DAI • HOC • KHOÂ 2002-2007 / :A . r] i- * ■l ;■ ' ' v/ *7 \ Ngudi hucmg dân: [7 - \ Tin',. V h V CN. DOÀN THIHÜÔNG Th.S TRAN NGUYÊN HÀ Noi thuc hiêri: PHÔNG HOÂ DÔC THl/C PHAM TRUNG TÂM KIÉM NGHIÊM- VIÊN DINH DIJON G Thài gian thuc hiên: 01/2007-05/2007 HA NOI THANG 5 NAM 2007 LÔI CÂM ON Triïôc hêt tôi xin bày tô long biét cm sâu sàc nhât tôi Th.S Tràn Nguyên Hà, Th.S Tràn Quang Thuÿ, CN, Doàn Thi Hiïômg là nhüng nguôi dâ truc tiép huorng dân, dâ dành nhiêu thôi gian và tâm suc, kinh phi giüp do' tôi trong suot quâ trinh nghiên cüru và hoàn thành khoâ luân tôt nghiêp này. Tôi cüng xin trân trong câm cfn câc thày cô giâo, cân bô kÿ thuât viên trong bô môn Hoâ Phân Tîch - Truông dai hoc Duac Hà Nôi dâ nhiêt tînh giüp dô tao moi dieu kiên thuân loi cho tôi hoàn thành khoâ luân này. Tôi xin bày tô long biét on toi câc cân bô cüa phông hoâ dôc thuc phâm, trung tâm kiëm nghiêm- viên Dinh Duông dâ giüp âd vê hoâ chat cho tôi trong quâ trinh thuc hiên dé tài. Tôi xin chân thành câm on thu viên trucfng Dai hoc Duoc Hà Nôi dâ cung câfp nhüng tài lieu càn thiét cho tôi trong quâ trinh thuc hiên dè tài. Cuôi cùng tôi xin câm on gia dînh, ban bè và nhüng nguôi thân dâ dông viên và hét long giüp dô tôi hoàn thành khoâ luân này. Hà Nôi, thâng 5 nâm 2007 Bùi Viêt Phuong BÂNG CHÜ VIÊT TÂT ACN : Acetonitril HPLC : Sac kÿ long hiêu nâng MeOH : Methanol NXB : Nhà xuât bân PA : Tinh khiét phân tfch PDA : Photo Diod Array PL : Phu lue STT : So thu”tu TB : Trung binh THF : Tetrahydrofuran UV : Tir ngoai MUC LUC DAT VAN D E .................................................................... ...............................1 PHAN 1: TÔNG QUAN................................................................................. 3 1.1. VitaminD...................................................................................... 3 1.1.1. Công thûc câ'u tao................... ....................................... .. 3 1.1.2. NguÔn gôc...........................................................................3 1.1.3. Trnh chât............................................................................. 3 1.1.4. Tac dung duoc lÿ và ca ché tac dung................................. 4 1.1.5. Chî dinh..............................................................................4 1.1.6. Câc phirang phâp dinh lirçrng vitamin D .............................4 1.1.7. Mot s6 nghiên curu vê vitamin D ................... .....................5 1.2. Kÿ thuât sâc kÿ long hiêu nàng cao............................................... 9 1.2.1. Khâi niêm cobân................................................................ 9 1.2.2. Câc dai lirçmg dàc tnmg...................................................... 9 1.2.3. Hê thô'ng HPLC.................................................................11 1.2.4. Phatînh........................................... .................................. 11 1.2.5. Pha dông..................... ..................................................... 12 1.2.6. Phirang phâp dinh liïçfng và tmh két quâ trong HPLC......14 1.3. Mot so thông so thong kê de xur lÿ và dânh gia két quâ................. 15 PHAN 2: NGUYÊN LIEU, THIÊT BI, PHÜONG PHÂP VÀ KET QUÂ NGHIÊN CtTU.................................... ...........................................................16 2.1. Nguyên lieu và thiét b i ................................................................ 16 2.1.1. Dô'i tuçmg nghiên cûu........................................................16 2.1.2. Thiét bi và dung e u .......................... .................................16 2.1.3. Hoâ chât, dung môi và thuô'c thû ...................................... 16 2.2. Phuong phâp nghiên ciîu..............................................................17 2.2.1. Chuan bi dung dich gôc và dung dich làm viêc cüa viatamin D 2.......................................................................17 2.2.2. Du dinh mot so diêu kiên chay sâc k ÿ ..............................17 2.2.3. Thdm dinh phuong phâp................................................... 18 2.3. Két quâ nghiên crïu..................................................................... 20 2.3.1. Nguyên lÿ xü lÿ mâu.........................................................20 2.3.2. Xâc dinh diêu kiên chay sâc kÿ pha dâo...........................23 2.3.3. Khâo sât su phù hçfp cüa hê thong.................................... 25 2.3.4. Xâc dinh khoâng tuyén trnh............................................. 26 2.3.5. Xâc dinh giôi han phât hiên và gioi han dinh luçmg cûa vitamin D2.............................................................. ........ 29 2.3.6. Dânh giâ dô chrnh xâc cüa phuong phâp..........................30 2.3.7. Xâc dinh tmh dung cüa phuong phâp................................31 2.4.Bàn luân.........................................................................................34 PHAN 3: KÉT LUÂN VÀ DE XUAT........................................................35 3.1. Ket luân........................................................... ............................... 35 3.2. De xuât............................................. .............................................. 35 » DAT VAN DE Dë tôn tai, phât triën, câi thiên noi giông, co thë chüng ta luôn cân duoc cung cap dày dû câc chat dinh duông và nguôn cung câp câc chat này chfnh là thuc phâm hàng ngày. Câc chat dinh duông là câc nhôm cung câp nàng luong cho co thë nhu glucid, lipid, protein, nhôm cung câp muô'i khoâng, nhôm cung câp câc loai vitamin và nuôc. Trong dô vitamin là nhôm cô vai tro eue kÿ quan trong tôi sure khoè cua môi con nguèi. Vitamin không thë thiéu duoc dôi vôi su ton tai và phât triën cüa môi co thë sông. Vitamin cô vai trô tao ra câc coenzim càn thiét trong câc phân irng chuyën hoâ khâc nhau. Tât câ câc quâ trinh sông gân liên vôi su trao doi chat trong co thë dêu cô su tham gia truc tiép cüa vitamin. Nguôn cung câp vitamin chû yéu là tir thüc àn do vây trong co thë cô thë thiéu hay thùa vitamin. Néu co thë bi thiéu vitamin nào dô sê sinh ra mot s6 cân bênh nhât dinh nhu thiéu vitamin A dë dân tôi bênh mù loà, thiéu vitamin BI dê bi bênh tê phù, thiéu vitamin PP mâc bênh pellagra, thiéu vitamin D bi bênh rickets..., tuy nhiên mot sô loai vitamin mà du thùa cüng cô thë gây tâc hai dôi vôi co thë nhu vitamin A, D, K. Mot trong nhüng loai vitamin khâ quan trong giüp viêc hïnh thành, phât triën câc té chirc xuong cüa co thë không thë không dê câp dén dô là vitaminD. Rat nhiêu thuc phâm chüa vitamin D nhu sûa, bôt dinh duông, câc sân phâm câ, trirng... Do dô, xâc dinh hàm luong vitamin D trong thuc phâm giüp dânh giâ dung giâ tri dinh duông cüa thuc phâm và khuyén câo cho câc bà me nuôi con nhô, hay nguôi lôn tuéi khi sü dung bo sung loai vitamin D này. Do dô tôi tién hành làm dê tài: “ Xây dung phuong phâp dinh luong vitamin D2 trong sûa bàng HPLC”. Dê tài này nham mue tiêu: 1 Xây dung quy trînh kÿ thuât dinh luong vitamin D2 trong sûa dë ûng dung trong kiëm soât chat luong sân phâm và chàm soc suc khoê công dông. Chüng tôi hi vong ràng két quâ nghiên ciïu này së cô giâ tri thuc tiên cao, gôp phàn vào viêc thuc dây ûng dung sàc kÿ long hiêu nâng cao dë dinh luong câc chât trong thuc phâm. 2 PHAN 1. TÔNG QUAN 1.1 Vitamin D.[2],[4],[6] 1.1.1 Công thurc câu tao [6] C27H440 ( M = 384,6) Tên khoa hoc: ergocalciferol 1.1.2 Nguôn goc Vitamin D co nhiêu trong câ bien, thit, trûng, süa và trong mot so thuc phâm bô sung. Môt so nghiên cûu dua ra hàm luong vitamin D trong câ thu là 15|a,g/100g, trong gan bô l|ug/100g, trong trutng gà 2|ig/100g, trong nam rom là 2|ig/100g Trong co thë, vitamin D duoc tông hop à câc té bào ducfi da nhô ânh sâng tu ngoai. Vai tro lôn nhàt cüa vitaminD là duy tri nông dô calci trong mâu. Do do nhiêu bâo cao dua ra cân bo sung khoâng 400 don vi vitamin D môi ngày trong khi uông calci diêu tri bêng loâng xuong. Vitamin D côn co nguôn gôc tông hop hoâ hoc và sinh hoc. 1.1.3 Tmh chat [4] Tinh thë hînh kim, không màu, không mùi, không tan trong nuôc, dë tan trong câc dung môi htru co nhu ethanol, ether, cloroform, và câc chat béo. Vitamin D không bên vôi nhiêt dô, không khi, ânh sâng. 3 1.1.4 Tac dung dirçrc lÿ và co ché tac dung [2],[6] Vitamin D tham gia vào quâ trinh tao xuong: làm tâng hâp thu calci và phosphat à ruôt, tâng hâp thu calci à ông luçm gân, tham gia vào quâ trinh calci hoâ sun tâng truông. Vi vây vitamin D rat cân cho su phât triën binh thucmg cüa trê em. Diêu hoà nông dô calci trong mâu: Néu câc quâ trinh trên không cung câp du calci, làm nông dô calci mâu giâm thi vitamin D ( két hop vôi hormon tuyén cân giâp) së phât huy calci tuf xuong ra. Ngoài ra vitamin D con tham gia biêt hoâ té bào biëu mô. Gân dây câc nhà khoa hoc dang nghiên cûu tâc dung ûc ché tâng sinh té bào ung thu. Vi thé khi thiéu vitamin D, ruôt không hâp thu dü calci và phospho làm giâm calci huyét. Khi dô calci bi huy dông tù xuong ra gây hâu quâ là trè em châm lôn, coi xuong, châm biét di, châm km thôp, nguôi lôn së bi loâng xuong, xop xuong. 1.1.5 Chï dinh [2],[6] -Phong và diêu tri coi xuong do thiéu vitamin D. -Phong và diêu tri loâng xuong, dê gây xuong. -Chông co giât do suy tuyén cân giâp. -Ha calci huyét. -Mot sô bênh ngoài da nhu chiîng xo ciîng bi. 1.1.6 Câc phuong phâp dinh liïomg vitamin D [4] - Phuong phâp hôa hoc + Nguyên tâc: Tién hành làm mâu chuân và mâu thür. Cho vitamin D tao màu vàng vôi thuôc thü antimon clorid roi dem do quang à buée sông 500 và 550 nm. 4 + Nhân xét: Quy trinh thuc hiên rat phiïc tap, bao gôm câc giai doan xà phong hoâ trong diêu kiên trânh oxy hoâ, chiét tâch và tinh ché qua câc côt sâc kÿ bân diêu ché (su dung câc chât nhôi là dât tây màu và dât silic dùng cho sâc kÿ), sau do tao màu và do quang. Do tién hành qua nhiêu giai doan nên dô chmh xâc giâm. - Phuong phâp sinh hoc. + Nguyên tâc: Hoat lue vitamin D duoc dânh giâ thông qua xâc dinh mue dô vôi hoâ xuong trên thô hoâc chuôt. + Nhân xét: Phuong phâp này tién hành khâ phiîc tap. Két quâphu thuôc nhiêu vào câc câ thë và doi hôi nguôi thur nghiêm phâi duocdào tao kl luông. - Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao. + Nguyên tâc: Dua trên su phân bô khâc nhau cüa vitamin D giüa pha dông và pha tînh so vôi câc thành phân hoat chât khâc. + Nhân xét: dây là phuong phâp hiên dai, ngày càng duoc âp dung phô bién. Tuy nhiên cüng chî cô thë âp dung truc tiép vôi câc ché phâm don hoâc da thành phân trong dô vitamin D cô hàm luong cao (> 500UI/1 don vi phân liêu) côn vôi câc ché phâm cô hàm luong D thâp thi dôi hôi phâi cô bien phâp xü lÿ mâu phù hop dë làm sach và làm giàu mâu. 1.1.7 Mot so nghiên cuti ve vitamin D [8],[10],[11],[12],[15] Cùng vôi su phât triën cüa nên khoa hoc kÿ thuât tiên tién, su bùng no cüa ngành công nghê thông tin trong thôi kÿ nên kinh té tri thtrc, hàng loat câc hê thông mây phân tich hoâ hoc dâ duoc câi tién nâng câp, nhàm xâc dinh duoc nhiêu loai chât hoâ hoc dông thefi nâng cao dô nhay cüa phép phân tfch cüng nhu dô làp lai cüa két quâ. Câc nhà khoa hoc phân tich hoâ hoc trên thé giôi nôi chung, phân tich thuc phâm nôi riêng dâ cô nhiêu công trinh nghiên 5 cuu vê phuong phâp xâc dinh hàm luong vitamin D trong thuc phâm nhu thit, câ, sûa,... Môt nghiên cüu dâ dua ra câch xû lÿ mâu nhu hinh lvà diêu kiên phân tfch hàm luong vitamin D trong thuc phâm, dô thu hôi cua phuong phâp là 90110% dôi vôi D2 và D3 [10]. Ô môt công trinh nghiên cüu khâc ta lai cô câch xû lÿ mâu nhu hinh 2 dô thu hôi cüa phuong phâp là 93- 107% [8]. Ngoài ra côn nhiêu công trinh nghiên cuu xâc dinh hàm luong vitamin D trong mâu và huyét thanh, trong thuc v ât... Hiên nay à Viêt Nam chua cô 1 dê tài eu thé nào vê dinh luong vitamin D trong thuc phâm. Trong khuôn khô cüa dê tài này, chüng tôi sau khi tham khâo câc tài liêu, cân eu’ vào nâng lue trang thiét bi hiên cô cüa labo, dua ra phuong phâp phân tfch phù hop. Qua dô chüng tôi khâo sât diêu kiên chay mâu, phân tfch môt sô dôi tuçmg mâu nhu sûa bôt, sûa chua...làm thü nghiêm lap lai dë xâc dinh dô chum, xâc dinh dô dung, khoâng tuyén tfnh, giôi han phât hiên, giôi han dinh luong dë dânh giâ hiêu lue cüa phuong phâp. Trong thuc phâm tu nhiên nôi chung hay thuc phâm bô sung nôi riêng hàm luong vitamin D cüng khâ thâp, nên viêc tâch chiét là vân dê rat quan trong. Chüng ta cân phâi chü ÿ câc khâu, công doan ânh hucfng dén hàm luong vitamin D trong mâu nhu ânh sâng, diêu kiên thuÿ phân mâu. 6 Hinh 1. So âô chiê't mâu 1 Hînh 2. Sa dô chiê't mâu 8 1.2 Kÿ thuât sâc kÿ long hiêu nâng cao [2], [3], [5], [4] 1.2.1 Khâi niêm ca ban. - Sac kÿ long hiêu nâng cao( HPLC) là môt phuong phâp tâch hoâ lÿ dua vào âi lue khâc nhau cüa câc chât khâc nhau vôi 2 pha luôn tiép xüc và không dông tan vcfi nhau goi là pha dông và pha tlnh. Pha dông là chât long chày qua côt vôi môt toc dô nhât dinh, côn pha tïnh chiïa trong côt là mot chât ran dâ duoc phân chia duoi dang tiëu phân hoâc môt chât long phü lên mot chât mang rân hay mot chât mang dâ duoc biên d6i bàng liên két hoâ hoc vôi câc nhôm hüru co. Quâ trinh sâc kÿ xây ra do câc co ché: hâp thu, phân bô, trao doi ion hoâc rây phân tir. - Nguyên tac cüa quâ trinh sâc kÿ trong côt: Pha tïnh là yéu tô quan trong quyét dinh bân chât cüa quâ trinh sâc kÿ và loai sâc kÿ. Néu pha tïnh là chât hâp phu ta cô sâc kÿ hâp phu, néu pha tïnh là chât trao doi ion ta cô sâc kÿ trao doi ion, pha tïnh là chât dâ duoc gân pha liên két ta cô sac kÿ phân bô, néu pha tïnh là gel ta cô sâc kÿ gel hay sâc kÿ rây phân tu. Quyét dinh hiêu quâ su tâch à dây là tong hop câc tuong tâc: Chât tan Tong cüa 3 tuong tâc này së quyét dinh chât nào duoc rüa giâi ra truôc tiên khi lue luu giü là nhô nhât và nguoc lai. 1.2.2 Câc dai luong dàc trimg +Thdi sian lm (tD): Cüa 1 chât là thcfi gian tmh tù lue tiêm mâu vào côt dén khi chât dô ra khôi côt dat giâ tri eue dai và cho pic trên sâc kî dô. So sânh 9 thcfi gian liru cüa mâu thu và mâu chuan làm trong cùng diêu kiên ta së dinh tmh duoc chât dô. + Thài sian chef L,: là thcfi gian luu cüa 1 chât không bi luu giü ( tire là chât cô toc dô bang toc dô di chuyén trung binh cüa câc phân tü dung môi khi di qua côt). + Thùa soduns luons Dùng dë mô ta tôc dô di chuyën cüa 1 chât. VR —t R—t M + Thùa sochon loc a : mô ta tôc dô di chuyën tî dôi cüa 2 chât k' d fv a =■ B _ k' A t'll R, B t'1 R,A Quy uôc B là chât luu giû manh hon A nên a > 1. Dë tâch riêng 2 chât thi a > 1, thuông là tùr 1,05 - 2,0. + So âïa ly thuy et N : Biëu thi bàng hiêu lue côt sâc kÿ N N = 16x ' t* D * \ WsJ hoâc N = 5,54x \w yy\n y Trong dô: WB: chiêu rông cüa dây pic W1/2: chiêu rông pic do cf nüa chiêu cao cüa dînh + Dô phân giai R,: là dai luong do mûc dô tâch 2 chât trên mot cô sâc kÿ n Ï ,B Ï ,A «o =-;---------r 10 r Pha tïnh trong HPLC là chât nhôi côt dë làm nhiêm vu tâch môt hôn hop chât phân tfch. No là nhüng chât rân, xôp, kfch thuôc hat rât nhô, duông kfnh cô hat tù 3 - 10|Jm, diên tfch bê mât hat thuofng tù 50 -500m2/g. * Phân loai - Cân câ theo bân chât chfnh cüa quâ trinh sâc kÿ trong côt tâch, ngirài ta chia nô thành nhiêu loai nhu hâp phu, phân bô, trao doi ion và rây phân tü. Tuong üng vôi loai chât nhôi nhir thê nguôi ta cô 1 loai sâc kÿ riêng trong kÿ thuât HPLC. - Cân cü theo trang thâi rân hay long cüa pha tïnh, nguôi ta chia nô thành 2 loai, néu pha tïnh là chât rân ta cô sac kÿ long- ran(LSC), néu pha tïnh là chât long ta cô sac kÿ lông-lông(LLC) - Cân cü theo dô phân eue cüa pha tïnh và pha(dôpg, cô câc loai: Sac kÿ pha thuân, sâc kÿ pha dâo, sâc kÿ pha dâo tao câp ion và sac kÿ trao dôi ion. - Cân cü" theo câu truc xôp cüa pha tïnh là câc hat rân, nguôi ta chia nô thành 2 loai là xôp toàn phân hat và xôp bê mât hat ( xôp chî lôp vô ngoài ). * Diêu kiên dôi vôi 1 pha tïnh - Phâi tro và bên vüng dôi vôi câc diêu kiên cüa môi trucmg sâc kÿ - Cô khâ nâng tâch chon loc - Tfnh chât bê mât phâi ôn dinh - Cân bang dông hoc cüa su tâch phâi xây ra nhanh và lâp lai tôt - Cô hat phâi tuong dôi dông nhât 1.2.5 Pha dông Pha dông là dung môi dùng dë rüa giâi chât tan (chât cân phân tfch) ra khôi côt tâch dë thuc hiên 1 quâ trinh sâc kÿ. Dây là môt yéu tô rât linh dông và dê dàng thay dôi. Nô cô thë là môt dung môi hoâc hôn hop nhiêu dung môi 12 trôn lân vôi nhau theo nhûng tÿ lê nhât dinh. No cüng cô thé là dung dich câc muô'i cô chûa câc chat dêm, chât tao phûc. Pha dông là mot trong nhûng yêii to quyét dinh hiêu suât tâch sâc kÿ cüa môt hôn hçfp mâu. Nô quyét dinh thdi gian luu giCr câc chât phân tich và hiêu quâ quâ trînh sâc kÿ. Pha dông cô thë ânh hurông dén: + Dô chon loc cüa hê pha, + Thdi gian liru giiî cua chât tan, + Hiêu lue cüa côt tâch, + Dô phân giâi câc chât trong 1 pha tînh, + Dô rông và su cân doi cüa pic sac kÿ. - Dieu kiên doi voi 1 pha dông + Phâi tro doi vcfi pha tînh, + Hoâ tan duçfc chât càn phân tich, + Bên vüng theo thdi gian, + Cô dô tinh khiét cao, + Phâi nhanh dat câc cân bâng trong quâ trînh sâc kÿ, + Phù hçfp câc loai detetor dùng dé phât hiên câc chât phân tich, + Cô tînh kinh té và không quâ hiém. - Câc yéu tô chmh càn chu ÿ trong lua chon pha dông: + Bân chât, thành phân cüa dung môi lua chon làm pha dông, + Toc dô dông pha dông, + pH cüa pha dông(dâc biêt chu ÿ à sâc kÿ trao doi ion và sac kÿ cap ion). 13 1.2.6. Phuong phâp dinh lutfng và tmh két quâ trong HPLC. Tât câ câc phuong phâp dinh luçfng bang sàc kÿ dèu dira trên nguyên tâc là: Nong dô cûa chât tÿ lê vôi chiêu cao hoac diên tich pic cüa nô. Dânh giâ theo diên tich pic: Diên tich pic cüa 1 chât tirong üng vôi tong ltfçfng chât dô. Dânh giâ theo chiêu cao pic: khi pic cô dang không doi thi chiêu cao pic là 1 dai ltfçmg tÿ lê vôi diên tich pic và nô cüng cô thé dùng dë dinh luang chât phân tich Cô 4 phuong phâp dinh lirçmg duoc sur dung trong sac kÿ: * Phuong phâp ngoai chuân * Phuong phâp nôi chuân * Phuong phâp thêm * Phuong phâp phân trâm diên tich pic (hoac phân tram chiêu cao pic). - Câch tmh két quâ trong phuong phâp HPLC * Phuong phâp ngoai chuân: Là phuong phâp dua trên co sa so sânh mâu chuân và mâu thur trong cùng diêu kiên. Két quâ cüa chât chua biét duoc tmh toân so vôi mâu chuân dâ biet truôc nong dô hoàc suy ra tir duông chuân. * Phuong phâp nôi chuân: Là phuong phâp cho thêm vào câ mâu thü và mâu chuân mot luong chât không doi, mà trong cùng diêu kiên sàc kÿ nô cô thoi gian luu gân vôi thcfi gian luu cüa chât cân phân tich trong mâu thü. Nô duoc tâch hoàn toàn và cô nong dô gân bàng nong dô cûa chât cân phân tich và cô câu truc hoâ hoc tirong tu. * Phuong phâp thêm chuân: Chü yéu duoc sü dung trong kÿ thuât HPLC khi cô vân dê ânh hucfng cûa chât phu nhu tâ duoc. Dung dich mâu thir duoc thêm mot luong nhât dinh chât chuân. Câc pic thu duoc cüa câ hai dung 14 dich mâu thü và mâu thü thêm chu an phâi duoc tién hành trong cùng môt dieu kiên sàc kÿ. Két quâ duçfc tmh toân dua vào su chênh lêch nông dô( luçfng chât chuân thêm vào) và dô tâng cûa diên tfch hoâc chièu cao cüa pic. * Phuong phâp tmh theo phân trâm diên tfch pic (hoâc phân tràm chiêu cao pic): Nông dô cüa mâu thü duoc tmh toân dua trên diên tfch pic ( hoâc chiêu cao pic) tmh theo tî le phân trâm diên tfch pfc ( hoâc chiêu cao pic) chât thü trên tong toàn bô diên tfch pic trên sâc dô. Trong phuong phâp HPLC, phuong phâp này chî dung khi cô su dâp üng cüa detector trên tât câ câc chât là nhu nhau, néu không nhu nhau khi dô vôi môi chât cân cô hê so hiêu chînh. 1.3. Mot so dac trung thong kê dë xû lÿ và dânh giâ két quâ. Câc thong so thuc nghiêm duçfc xü lÿ bang phuong phâp thông kê thông qua câc dac trung sau: - Giâ tri trung binh: - Dô lêch chuân: “ 1 n x = -V x , n M SD =' - Dô lêch chuân tuong doi : /=1 n- 1 RSD = en x x 100 (%) Trong dô Xj là giâ tri do mâu thü i và x là giâ tri trung binh cüa câc làn phân tfch. 15 PHÂN H. NGUYÊN LIÊU, THIÊT BI, PHÜONG PHÂP VÀ KÊT QUÂ NGHIÊN CtJtJ 2.1 Nguyên lieu và thiet bi 2.1.1 Doi tiïtfng nghiên cuti - Süra bot XO (HSD 24/10/2007, hàng Namyang Hàn Quoc). 2.1.2 Thiét bi dung eu - Hê thong sâc kÿ long cao âp Finnigan voti detector PDA. - Côt chay pha dâo: côt RP |18^5|am, 250 x 4,6 mm), Supelco; côt Inertsil ODS- 3 (5 |am, 250 x 4,0 mm), Japan; côt Symmetry: Shield RP |l8 j5 jum, 150 x 4,6 mm), Waters. - Côt chiét pha ran SPE - Cân phân tich Frecisa. - Tü sây Sellab. - May cât quay chân không. ' ' - Phêu chiét. - Binh dinh miîc chmh xâc 50ml. - Ông dong 20ml, 50 ml. - Pipet chmh xâc 1ml, 2ml, 5ml, 10ml. - Coc cô mô và câc dung eu thuÿ tinh khâc. - Mây do quang Shimadzu. 2.1.3 Hoâ chât, dung môi, thuoc thür - VitaminD2 chât chuân hàm ltfçmg 99,56% ( Supelco) - n- hexan hoâc ete dâu hoâ PA (Merck) - Ete etylic PA (Merck) - Methanol HPLC (Merck) - THF HPLC - Ethanol HPLC (Merck) 16 - ACN (HPLC) ( Merck) - Ethanol (Trung Qudc) - Nirôc cât - NaCl tinh khiét - KOH (Trung Quoc) - Acid ascobic ( Trung Quoc) 2.2 Phuong phâp nghiên ctifu 2.2.1 Chuân bi dung dich chuân goc và chuân làm viêc cüa vitaminD2 - Chuân nong dô lOOOppm: Hoà tan chuân vitamin D2 vào trong dung môi ethanol. Khâo sât tim buôc sông À max. Do dô hâ'p thu lôn nhât à buôc sông 265 nm. Tmh nong dô thuc cüa dung dich chuân vôi hê sô hâp thu phân tü là s = 18843 vôi vitamin D2. C = Abs xlOOOO/s (|ag/mL) / Trong dô: C là nông dô cüa dung dich vitamin D2 Abs là dô hâp thu cüa vitamin D2 à buôc sông 265 nm. - Pha câc dung dich chuân làm viêc vôi nông dô tù 0,01 dên 0,2, mcg/ml tù dung dich gôc trong methanol. 2.2.2 Du dinh mot so diêu kiên chay sac kÿ * Pha dông: Du dinh pha dông là câc pha phân eue vôi hôn hçfp dung môi theo câc tÿ lê thay doi. - Hôn hop MeOH : H20 , - Acetonnitrile : MeOH, - MeOH: THF: H20 * Côt tâch: Du dinh khâo sât trên câc loai côt sau: -Côt pha dâo RP 18,5(im, 250 x 4,6 mm cüa Supelco, -Côt inertsil ODS -3, 5fim, 250 x4,0 mm cüa Japan, -Côt SymmetryÔShield RP18, 5|im, 150x4,6mm cüa Waters * Luu luçmg dông: Khâo sât luu luong dông tù 0,5-1,5 ml/phüt. * Buôc sông: Detector UV ô buôc sông 265nm, buôc sông 280 và buôc sông 254 nm 2.2.3 Tham dinh phuong phâp - Giôi han phât hiên (LOD): Là nông dô nhô nhât cûa chât phân tfch trong mâu thû cô thë phât hiên duoc nhung không nhât thiét dë cô thë dinh luçmg duoc. *Câch xâc dinh: Tuÿ thuôc vào phuong phâp phân tfch và diêu kiên thf nghiêm ta cô thë lua chon câch tmh sau. + Giôi han phât hiên duoc xâc dinh bang phuong phâp phân tfch mâu thü cô chât phân tfch dâ biét nông dô và xâc dinh nông dô tôi thiëu mà tai dô cô thë doc duoc dâp irng cüa chât phân tfch. Phuong phâp này âp dung cho phuong phâp phân tfch không dung eu và câ phuong phâp dung eu. + Giôi han phât hiên duoc xâc dinh bang nông dô cüa chât phân tfch mà tai dô chiêu cao cüa pic bang ba làn chiêu cao cüa nhiêu duông nên. Phuong phâp này âp dung cho phuong phâp phân tfch công eu. + Giôi han phât hiên duçfc tmh bàng giâ tri trung binh mâu tràng công vôi ba làn dô lêch chuân cüa mâu tràng. LOD = YB+ 3Sb Trong dô YBgiâ tri trung binh cüa mâu tràng. SBDô lêch chuân cüa két quâ phân tfch mâu tràng. + Dua vào dô lêch chuân cüa dâp üng, LOD cô thë tmh nhu sau LOD = SD x 3,3/a Trong dô SD dô lêch chuân cüa dâp ûng. a là dô dôc cûa duông chuân. Dô doc cô thë tmh dua vào duefng chuân cüa chât phân tfch - Giôi han dinh luçfng(LOQ): Là luong nhô nhât cüa chât phân tfch trong mâu thü dë cô thë dinh luong duçfc vôd dô dung và dô chmh xâc thfch hçfp. 18 * Câch xâc dinh: Tuÿ thuôc vào phuang phâp phân tich và diêu kiên thf nghiêm ta cô thé lua chon câch tmh sau. + Giôi han dinh luçmg cô thé xâc dinh bâng phân tich mâu thir cô chât phân tich dâ biét nông dô và xâc dinh nông dô toi thiéu mà tai dô cô thé dinh lirçmg duçfc chât càn phân tich vôi dô dung và dô chmh xâc cô thé châp nhân dirac. Phucmg phâp này âp dung cho phép phân tich không dung eu và phân tich dung eu. + Dua vào tÿ le dâp irng so vôi nhiêu, giôi han dinh luçmg duçfc xâc dinh bang nông dô mà tai dô chiêu cao cüa dâp lîng bang 10 làn chiêu cao cüa nhiêu. + Giôi han dinh luçmg duçfc tmh bàng giâ tri trung binh mâu trâng công vôi muefi làn dô lêch chuàn cüa mâu trâng. LOQ = YB+ 10SB Trong dô YBgiâ tri trung bînh cüa mâu trâng. SBDô lêch chuàn cüa kêt quâ phân tich mâu trâng. + Dua vào dô lêch chuan cüa dâp ring, LOQ cô thé tînh nhu sau LOQ = SD x 10 /a Trong dô SD dô lêch chuàn cüa dâp üng. a là dô doc cüa duefng chuàn. Dô doc cô thé tînh dua vào duông chuàn cüa chât phân tich - Khoâng tuyê'n tmh. Là khoâng câch giüa nông dô trên và nông dô duôi cüa chât phân tich mà dâp ûng cüa nô tÿ lê vôi nong dô. * Câch xâc dinh: Khoâng xâc dinh duçfc lây tù nghiên cûu cüa dô tuyén tmh. Xây dung khoâng xâc dinh nham khang dinh quy trinh phân tich cô dô tuyén tmh, dô chmh xâc, dô dung châp nhân duçfc khi âp dung dinh luçmg mâu thü vôi hàm luçmg nam trong khoâng eue dai và eue tiéu cüa khoâng xâc dinh. 19 - Dô tuyén tmh: Dô tuyén tmh cüa mot quy trinh phân tich diên tâ két quâ phân tich thu duoc tÿ lê vôi nong dô ( trong khoâng nhât dinh) cüa chât phân tich trong mâu thu. Dô tuyén tmh biëu thi qua hê so hôi quy r. * Câch xâc dinh : Sau khi pha loâng dung dich chuân gôc thành câc dung dich làm viêc ( ft nhât 5 nông dô) tién hành phân tich nhu phuong phâp yêu câu de xâc dinh câc dai luong cân thiêt nhu diên tich, chiêu cao hay dô hâp thu ... Sau dô xây dung dô thi liên quan giûa nông dô chât phân tich vôi mot trong nhûng dai luong trên. Qua duông chuân dô cho ta phuong trinh hôi quy tuyén tmh, hê sô hôi quy tuyén tmh. Y = ax+ b Yêu càu r > 0,9990 - Dô lêch chuân và hê sô bién thiên. Dô lêch chuân (dô làp lai) diên tâ dô chrnh xâc cüa mot quy trinh phân tich trong cùng diêu kiên thi nghiêm. Dë thuc hiên xâc dinh dô lêch chuân, hê sô bién thiên tién hành phân tich lap lai 5-10 làn trong cùng diêu kiên vôi môi mâu thü nghiêm. - Hê sô thu hôi (Dô dung). Dô dung cüa mot quy trinh phân tich biëu diên sai lêch giùa giâ tri tim thây vôi giâ tri thuc hoàc giâ tri doi chiéu duoc châp nhân. - Dë xâc dinh dô thu hôi chüng tôi tién hành phân tich trên mâu và mâu nap chuân ( luong chuân thêm vào sao cho nông dô cuôi sau khi chiét mâu xong nâm trong khoâng tuyén tmh). 2.3. Két quâ nghiên cufu 2.3.1. Nguyên lÿ xür lÿ mâu Mâu duoc xà phông hoâ trong môi truông KOH / Etanol, Vitamin D duoc chiét ra tù dich không duoc xà phông hoâ bôi dung môi n-hexan hay ete dâu hoâ. Dich chiét duoc làm sach và bom vào hê thông HPLC vôi detector PDA à buôc sông 265nm. 20 Pham vi âp dung: Quy trinh này âp dung duoc cho câc loai thuc phâm nhu süa và sân phâm tir sûa, bôt dinh duông... * Tién hành: quy trinh xû lÿ mâu theo hinh 4. 21 Hinh 4: Sa do chiét vitamin D2 trong siïa 22 2.3.2. Xâc dinh dieu kiên chay sâc kÿ pha dâo. * Côt sâc kÿ: Dua vào tmh chât hai^chât càn phân tich và diêu kiên hiên cô chüng tôi dùng sâc kÿ phân bô pha dâo. Két quâ khâo sât trên câc côt sac kÿ trong 2.2.2, côt inertsil ODS3 cho pic cân xüng nhât trên sac dô (hinh 3,4). « ___r/ ‘DA-265nrp S g^aminDi r _ JsJame Sâc r\f mAU 40 f 15 30 Minutes Hinh 5. Sac do chuân D2 0,041ppm chay trên côt RP18 5(j.m, 4,6 x 150mm pha dông ACN: MeOH= 50:50 D Tiép tue khâo sât vôi câc loai süa khâc dë cô thë dua ra mot quy trinh chung cho quâ trinh dinh luong vitamin D2 trong tât câ câc câc loai süa. 35 TÀILIÊU THAM KHÂO TIÊNG VIÊT 1. Tràn Tu An, Thâi Nguyên Hùng Thu(2006), Hoâ Phân tich II, Trucfng Dai hoc Duoc Hà Nôi, tr. 135-137, 173- 201. 2. Bô y té(2002), Duçfc thu quô'c gia Viêt Nam, NXB Y hoc, tr. 985- 989 3. Tràn Dire Hâu, Nguyên Dînh Hiën, Thâi Duy Thîn( 2004), Hoâ Duçfc, Truông Dai hoc Duçfc Hà Nôi, tâp I, Tr. 308-313 4. Dô Lan Phucfng( 2005): Khoâ luân tôt nghiêp dai hoc: “ Xây dung phuang phâp dinh luçfng amoxicillin và kali clavulanat trong huyê't tuang” 5. Pham Vân S6, Bùi Thi Nhu Thuân( 1978), Kiêm nghiêm luong thuc thuc phâm, Nhà xuât bân Khoa Hoc và Kÿ Thuât Hà Nôi. 6. Mai Tât Tô, Vü Thi Trâm, Dào Thi Vui( 2004), Duçfc ly hoc, Trucfng dai hoc Duçfc Hà Nôi, tâp 2, tr. 292-295 TIÊNG ANH 7. AOAC, (1997) Sixteenth édition,3rd révision. 8. Bellester, I.; Cortes, E.; Moya, M.; Campello M.J.,( 1987), “ Improved Methodfor Quantifuin Vitamin D in Proprietary Infants’ Formulas and in Breast Milk”; Clin. Chem. 33/6 p. 796-799. 9. Brubacher, G.; Muller-Mulot W.; (1985), Methods for the détermination of vitamins infood, Elsevier applied science publishers London and New york 10. Hill. Jerry L.; Travis, Benjamin D.; Mahmoud, Mohamed I.; Brooks, James R.; Schenz, Timothy W.; Bewille, Normanella T.;(1995), “Method for improving Vitamin D stability in liquid nutritional products”. 11. Jette jakobsen, Ina Clausen, Torben Leth, lars Ovesen, (2004) Journal offood composition and analysis 17, p.777-787 12. Jette jakobsen, Ina Clausen, Torben Leth, lars Ovesen, (2003) Journal offood composition and analysis 16, p. 575-585 13. Léo M.L.Nollet nàm (1992), Food analysis by HPLC, p276-329. 14. Pirjo H.Mattila, Vieno I. Piironen... (1996) New analytical aspects of vitamin D infood. Food chemistry, Elesvier Science Ltd., p. 95-99 15. Food chemical Vol.57, No.l. 95-99, 1996 in Great Britain [...]... 100|al vitamin D2 0,55ppm Rụi tiộn hnh chiột mõu nhu 2.3.1 Kột quõ chay sõc k duoc trinh by bõng duụi Bõng 4 Kột quõ chay HPLC cỹa mõu sỹa XO Mõu sụ Khụi luong cõn(g) Diờn tfch pfc 1 2,5671g 424153 2 2,4975g+ 100|nl vitamin D2 0,55ppm 1097108 3 2,6175g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm 1143276 4 2,5478g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm 1131457 5 2,5045g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm 1137146 6 2,7568g+ lOOjal vitamin D2. .. Trong dụ y l diờn tich pic cỹa vitamin D2 x l nụng dụ cỹa vitamin D2 28 Hờ so tuong quan: r = 1,00 Duụng chuõn tuong quan giỹa diờn tich pic v nụng dụ chuõn vitamin D2 5000000 n 4000000 -g 3000000 g 2000000 - Duong chuan Vitamin D2 y = 13127770.46x + 34583.82 R2 = 1.00 Q 1000000 0 4e 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nong do (ppm) Hinh 15 Dudng chuõn dinh litỗfng cỹa Vitamin D2 Khoõng tuyộn tmh xõc dinh duoc cỹa vitamin. .. duoc hm luong vitamin D2 trong lg sỹa XO theo cụng thuc: S t -34583,82 ằ - x V ( u g / g ) 13127770,46.mcan V^ 6 6J x = _ E ỗ Trong dụ: Xl khụl luong cỹa vitamin D2 trong lg sỹa (|ag/g) Spic l diờn tich pic do duoc mcan l khoi luong mõu sỹa XO cõn dem di xỹ l (g) V l thở tich dinh mire sau khi xỹ l mõu Dụ thu hụi: H% = (X,ong X100% ^chucm Trong dụ: Xtong: Hm luỗfng vitamin D2 trong mõu thờm... cỹa vitaminD2 - Chuõn nong dụ lOOOppm: Ho tan chuõn vitamin D2 vo trong dung mụi ethanol Khõo sõt tim buục sụng max Do dụ hõ'p thu lụn nhõt buục sụng 265 nm Tmh nong dụ thuc cỹa dung dich chuõn vụi hờ sụ hõp thu phõn tỹ l s = 18843 vụi vitamin D2 C = Abs xlOOOO/s (|ag/mL) / Trong dụ: C l nụng dụ cỹa dung dich vitamin D2 Abs l dụ hõp thu cỹa vitamin D2 buục sụng 265 nm - Pha cõc dung dich chuõn lm... nụng dụ 0,02ppm jj- 4 0 40 t 20 t 10 2 0 30 Hinh 12 Sac ky do cỷa chuan vitamin D2 cụ nong dụ 0,041ppm 27 mAU mAU 40 1 00 mAU 1 00 M inutes Hlnh 13 Sac ky õụ cỹa chuõn vitamin D2 cụ nụng õụ 0,165ppm ... 100|nl vitamin D2 0,55ppm 1097108 2,6175g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm 1143276 2,5478g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm 1131457 2,5045g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm 1137146 2,7568g+ lOOjal vitamin D2 0,55ppm... phuong phõp vụi vitamin D2 l 2ppb 29 b Gioi han dinh luofng cỷa vitamin D2 l: LOQ = 3,3 x LOD = 6,6ppb Võy giụi han phõt hiờn cỷa vitamin D2 l ppb gioi han dinh luong cỹa vitamin D2 l 6,6 ppb 2.3.5... hờ sụ hõp thu phõn tỹ l s = 18843 vụi vitamin D2 C = Abs xlOOOO/s (|ag/mL) / Trong dụ: C l nụng dụ cỹa dung dich vitamin D2 Abs l dụ hõp thu cỹa vitamin D2 buục sụng 265 nm - Pha cõc dung dich