Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐÌNH TẠO XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐÌNH TẠO MÃ SINH VIÊN: 1501441 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Vũ Ngân Bình Nơi thực : Bộ mơn Hóa phân tích độc chất HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Vũ Ngân Bình Để hồn thành đề tài, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu đến từ thầy cơ, bạn bè gia đình Khi khóa luận hồn thiện, tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến họ Lời đầu tiên, với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, Th.S Vũ Ngân Bình – Giảng viên mơn Hóa phân tích độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình để giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu, thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, anh/chị kĩ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi q trình tơi thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân gia đình ln tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu Cuối cùng, kính chúc thầy chúc bạn mạnh khỏe, hạnh phúc, may mắn mỉm cười sống Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Đình Tạo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan acid amin 1.2 Tổng quan sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2.1 Pha tĩnh 1.2.2 Pha động 1.2.3 Các chế tách HILIC 1.3 Sơ lược phương pháp định lượng acid amin CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Chất đối chiếu 2.1.2 Chế phẩm 2.1.3 Hóa chất 2.2 Thiết bị, dụng cụ 2.3 Nội dung nghiên cứu 10 2.4 Phương pháp nghiên cứu 10 2.4.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 10 2.4.2 Quy trình chuẩn bị dung mơi pha động 11 2.4.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu khả tách acid amin phân tích HILIC 12 2.4.3.1 Pha tĩnh 12 2.4.3.2 Pha động 12 2.4.4 Xây dựng phương pháp định lượng số acid amin chế phẩm 12 2.4.4.1 Khảo sát bước sóng định lượng 12 2.4.4.2 Khảo sát pha tĩnh 12 2.4.4.3 Khảo sát pha động 12 2.4.5 Thẩm định phương pháp phân tích 13 2.4.5.1 Độ phù hợp hệ thống 13 2.4.5.2 Độ chọn lọc 13 2.4.5.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 14 2.4.5.4 Độ xác phương pháp 14 2.4.5.5 Độ 14 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu khả tách acid amin 16 3.1.1 Ảnh hưởng pha tĩnh 16 3.1.2 Ảnh hưởng pha động 16 3.1.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ ACN 16 3.1.2.2 Ảnh hưởng chất acid/muối 18 3.1.2.3 Ảnh hưởng nồng độ acid/muối 19 3.2 Xây dựng phương pháp định lượng số acid amin chế phẩm 20 3.2.1 Xử lý mẫu 20 3.2.2 Khảo sát bước sóng định lượng 20 3.2.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký 21 3.3 Thẩm định phương pháp 23 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 23 3.3.2 Độ chọn lọc 24 3.3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 24 3.3.4 Độ xác phương pháp 26 3.3.5 Độ 26 3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm thị trường 27 3.5 Bàn luận 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 4.1 Kết luận 30 4.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ACN ADN AQC DABS-Cl DMF ESI FOMC GC HILIC HPLC MS NBD-Cl NP-LC OPA PHE PITC RP-LC RSD THF TRP TYR UPLC UV Tiếng Anh Tiếng Việt Acetonitril Deoxyribonucleic acid 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamate Dimethylaminoazobenzensulfonyl chlorid Dimethylformamide Electrospray ionisation 9-fluorenylmethyl chloroformate Gas Chromatography Hydrophilic interaction chromatography High performance liquid chromatography Mass spectrometry 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Normal phase liquid chromatography ortho-phthalaldehyde Phenylalanine Phenylisothiocyanate Reverse phase liquid chromatography Relative standard deviation Tetrahydrofuran Tryptophan Tyrosine Ultra performance liquid chromatography Ultra violet Acetonitril Acid deoxyribonucleic 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamat Dimethylaminoazobenzensulfonyl chlorid Dimethylformamid Bộ ion hóa tia điện từ 9-fluorenylmethyl chloroformat Sắc ký khí Sắc ký lỏng tương tác thân nước Sắc ký lỏng hiệu cao Khối phổ 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Sắc ký lỏng pha thuận Aldehyd (o) – phthalic phenylalanin Phenylisothiocyanat Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn tương đối Tetrahydrofuran Tryptophan Tyrosin Sắc ký lỏng siêu hiệu Bức xạ tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tên gọi, tên viết tắt, pI acid amin [3] Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích acid amin Bảng 2.1 Cách pha dung dịch đường chuẩn 11 Bảng 2.2 Cách pha dung dịch thử thêm chuẩn 11 Bảng 2.3 Các pha động khảo sát 13 Bảng 3.1 Ảnh hưởng bàn chất muối/acid pha động lên hệ số cân xứng pic 18 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả tách số acid amin 20 Bảng 3.3 Chương trình gradient 22 Bảng 3.4 Kết độ phù hợp hệ thống 23 Bảng 3.5 Kết khảo sát đường chuẩn 25 Bảng 3.6 Kết độ xác phương pháp 26 Bảng 3.7 Kết độ phương pháp 27 Bảng 3.8 Kết định lượng chế phẩm 28 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức tổng qt acid amin Hình 3.1 Sắc ký đồ cột amid cột silica 16 Hình 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ ACN lên thời gian lưu tyrosin 17 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ ACN lên khả tách số acid amin 18 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối lên thời gian lưu chất phân tích 19 Hình 3.5 Phổ hấp thụ Trp Tyr 20 Hình 3.7 Sắc ký đồ điều kiện khảo sát 22 Hình 3.8 Sắc ký đồ độ chọn lọc 24 Hình 3.9 Đường chuẩn Trp Tyr 25 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, kỹ thuật sắc ký lỏng kỹ thuật quan trọng phổ biến nhiều lĩnh vực đa dạng: kiểm nghiệm, an tồn thực phẩm, xét nghiệm hóa sinh, vi sinh, môi trường Kỹ thuật sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) nhánh sắc ký lỏng,, khác với kiểu sắc ký truyền thống quen thuộc sắc ký lỏng phân bố pha thuận (NP-LC) hay sắc ký lỏng phân bố pha đảo (RP-LC) Kỹ thuật sử dụng pha tĩnh pha động phân cực thể nhiều ưu điểm so với kiểu sắc ký truyền thống với đối tượng phân tích chất phân cực Tuy nhiên, HILIC lại có chế tách phức tạp, đòi hỏi nhiều nghiên cứu để hỏi rõ chế tách yếu tố ảnh hưởng lên kỹ thuật Mặc dù vậy, nghiên cứu HILIC Việt Nam hạn chế Trên thị trường có nhiều chế phẩm chứa acid amin với mục đích khác nhau: cung cấp thành phần cấu trúc protein cho người suy dinh dưỡng, suy thận; giải độc gan (chứa methionin), cải thiện giấc ngủ (tryptophan)… Các chế phẩm chứa acid amin thường chế phẩm đa acid amin, việc định lượng acid amin gặp nhiều khó khăn Các phương pháp phổ biến để phân tích acid amin sử dụng phương pháp dẫn xuất hóa để làm tăng khả lưu giữ, khả tách cột pha đảo tăng độ hấp thụ UV-VIS acid amin [2, 5] , nhiên việc dẫn xuất hóa phức tạp tốn nhiều thời gian Bên cạnh có nghiên cứu ứng dụng HILIC để phân tích acid amin trực tiếp, khơng cần dẫn xuất hóa [19] Acid amin, với chất phân cực có phân tử lượng nhỏ, đối tượng phân tích phù hợp với HILIC Do việc nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng lên HILIC, từ ứng dụng HILIC để phân tích trực tiếp acid amin khơng qua dẫn xuất hóa có ý nghĩa thực tiễn Với mong muốn hiểu rõ kỹ thuật HILIC, cung cấp thêm góc nhìn kỹ thuật ứng dụng kỹ thuật thực tế, tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng số acid amin sắc ký lỏng tương tác thân nước” đối tượng cụ thể chế phẩm tiêm truyền đa acid amin với mục tiêu sau: - Khảo sát số ảnh hưởng pha tĩnh pha động lên thời gian lưu khả tách số acid amin HILIC - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng số acid amin chế phẩm HILIC Ứng dụng phương pháp xây dựng cho chế phẩm thị trường CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan acid amin Acid amin thành phần cấu tạo nên protein Chúng phân tử chứa nhóm chức amin (-NH2) carboxyl (-COOH), nhóm R khác với acid amin Có 20 loại acid amin cấu tạo nên chuỗi protein thể mã hóa ADN tất chúng α-amino acid (nhóm chức -NH2 -COOH gắn với C vị trí α) Cơng thức tổng qt acid amin hình 1.1 Hình 1.1 Cơng thức tổng qt acid amin Nhóm R có vai trị quan trọng tính chất lý hóa acid amin (quyết định khả hịa tan, tính phân cực, tính oxy hóa,…).Dựa theo nhóm R phân 20 acid amin thành nhóm: -Nhóm có tính acid: Acid aspatic, Acid glutamic -Nhóm có tính base: Lysin, Asparagin, Histidin -Nhóm acid amin thơm: Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin -Nhóm acid amin cịn lại Mỗi acid amin có giá trị pH cụ thể mà acid amin tồn dung dịch dạng ion lưỡng cực, giá trị pH gọi pH đẳng điện (pI) Tại giá trị pI nó, acid amin trung hịa điện, tổng điện tích dương tổng điện tích âm Chúng phân thành loại dựa khả tổng hợp thể: Acid amin thiết yếu (cơ thể không tự tổng hợp được), Acid amin không thiết yếu (cơ thể có khả tự tổng hợp được) [3]  Nhóm acid amin thiết yếu (các acid amin thể người tự sinh tổng hợp): Met, Val, Trp, Ile, Phe, Thr, Leu, Lys (đối với trẻ em có thêm Arg, His)  Nhóm acid amin không thiết yếu: Gly, Ala, Ser, Tyr, Cys, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, His, Pro Phụ lục Sắc ký đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống PL-8 PL-9 Phụ lục Report thẩm định đường chuẩn khoảng xác định PL-10 PL-11 PL-12 PL-13 PL-14 Phụ lục Bài báo khoa học công bố PL-15 PL-16 PL-17 PL-18 PL-19 PL-20 PL-21 PL-22 ... khả tách số acid amin HILIC - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng số acid amin chế phẩm HILIC Ứng dụng phương pháp xây dựng cho chế phẩm thị trường CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan acid amin. .. tiến hành đề tài ? ?Xây dựng phương pháp định lượng số acid amin sắc ký lỏng tương tác thân nước? ?? đối tượng cụ thể chế phẩm tiêm truyền đa acid amin với mục tiêu sau: - Khảo sát số ảnh hưởng pha... amino) - Mở rộng đối tượng khảo sát acid amin có khả lưu giữ tốt - Xây dựng phương pháp định lượng acid amin cột amid - Áp dụng phương pháp định lượng xây dựng chế phẩm khác chứa nhiều acid amin