Phân lập và xây dựng phương pháp định lượng một số xanthon trong vỏ quả măng cụt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong kinh nghiệm dân gian, măng cụt cũng được sử dụng làm nhiều phương thuốc chữa các bệnh như: tiêu chảy, lỵ vàng da… Luận văn này tập trung vào nghiên cứu chiết tách, nâng cao hàm lượ

9

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau Cùng với sự đa dạng sinh học vốn có, từ xa xưa, người Việt đã biết tận dụng nguồn tài nguyên thực vật để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống như sản xuất nông nghiệp, sử dụng dược liệu để chữa bệnh, khai thác vật liệu xây dựng, chế tác công cụ, đồ mỹ nghệ Trong đó, việc sử dụng các nguồn dược liệu có nguồn gốc thực vật đã được hình thành từ rất sớm, có nền tảng vững chắc và luôn được kế thừa, phát triển

Ngày nay, gắn liền với sự phát triển của khoa học công nghệ, các hợp chất có hoạt tính sinh học quý từ thực vật ngày càng được phát hiện, phân lập và ứng dụng vào các ngành công nghệ dược phẩm, mỹ phẩm Việc nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên này đã và đang trở thành xu hướng mới trong công nghệ y dược nhờ thể hiện được nhiều đặc tính ưu việt như khả năng tác dụng tốt, tính kinh tế và ít gây tác dụng không mong muốn lên người bệnh

Cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) là một giống cây nhiệt đới có nguồn

gốc từ đảo Sunda và Moluccas của Indonesia, được du nhập đến Việt Nam khoảng giữa thế kỷ 18 và được trồng phổ biến tại các tỉnh phía Nam và Tây Nam Bộ Măng cụt từ lâu được mệnh danh là “nữ hoàng cây trái” với giá trị kinh tế cao, được nhiều người dân và du khách ưa thích Trong kinh nghiệm dân gian, măng cụt cũng được

sử dụng làm nhiều phương thuốc chữa các bệnh như: tiêu chảy, lỵ vàng da…

Luận văn này tập trung vào nghiên cứu chiết tách, nâng cao hàm lượng và xây dựng phương pháp định lượng một số hợp chất xanthone trong dịch chiết vỏ quả măng cụt, nhằm tạo các chế phẩm cao chiết măng cụt với hàm lượng xanthone khác nhau, làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo của lớp hợp chất này

10

Mục tiêu của luận văn:

1 Nghiên cứu chiết tách và nâng cao hàm lượng xanthone trong mẫu dịch chiết

vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)

2 Xây dựng được phương pháp định lượng một số xanthone trong dịch chiết vỏ quả măng cụt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

11

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ CÂY MĂNG CU ̣T

1.1 Đă ̣c điểm thư ̣c vâ ̣t của cây măng cụt

Tên khoa học: Garcinia mangostana Linn

Họ thực vật: Chi bứa (Garcinia), Họ bứa (Clussiaceae)

Tên thông dụng: Măng cụt (tên tiếng Anh: Mangosteen)

Tên khác: Sơn trúc tử, giáng châu, mangoustanier, brindonia tallow tree, kokambutter tree, mangoustan cultive, mangoustanier, garcinie mangoustan, mangu

Hı̀nh 1.1 Minh họa đặc điểm thực vật hoa , lá và quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)

Mô tả hình thái thực vật

Cây to, thân gỗ, có nhựa vàng Lá dày cứng, dài 15-25 cm, mọc đối, không lông, mặt dưới có màu nhạt hơn mặt trên Hoa đa tính, thường có hoa cái và hoa lưỡng tính Hoa lưỡng tính có cuống có đốt, 4 lá đài, 4 cánh hoa màu trắng, 16-17 nhị và bầu 5-

12

8 ô Quả tròn mang đài có vỏ quả rất dai, xốp, màu đỏ như rượu vang, chứa 5-8 hạt, quanh hạt có lớp áo hạt trắng, ngọt ngon

Hı̀nh 1.2 Hı̀nh ảnh cây măng cụt

Cây ra hoa tháng 2 đến tháng 5 có quả từ tháng 5 đến tháng 8 Trong điều kiện thuận lợi, cây măng cụt có thể đạt chiều cao trung bı̀nh 9,5 mét và có thể cho đến

2000 quả trong mô ̣t mùa

1.2 Phân bố và thu hoa ̣ch:

Cây có có nguồn gốc từ đảo Sunda và Moluccas của Indonesia, phân bố nhiều khắp Đông Nam Á, miền tây nam Ấn Đô ̣ và mô ̣t số quốc gia nhiê ̣t đới khác như Puerto Rico, Guatemala, Honduras và Florida [28, 57]

Ta ̣i Viê ̣t Nam, măng cu ̣t được trồng phổ biến tại các cù lao ở các tỉnh phía Nam

và Tây Nam Bộ, nhiều nhất là ở Tây Ninh

Quả đươ ̣c thu hoa ̣ch lúc có màu hồng, khi hái cần cẩn thận và tránh sự va chạm mạnh nhằm giảm đến mức thấp nhất sự xây xát Nên dùng dụng cụ có túi vải để hái quả, tránh để rơi tự do trên mặt đất làm dâ ̣p nát vỏ Bảo quản ở dưới 13°C trong túi plastic có đục lỗ sẽ giữ quả đươ ̣c tươi trong 28 ngày [21]

13

Phần thi ̣t quả đươ ̣c sử du ̣ng làm thực phẩm, phần vỏ quả đươ ̣c sử du ̣ng làm dươ ̣c liê ̣u

1.3 Tính vị, tác dụng:

Vị chát, làm săn da; có tác dụng trừ ỉa chảy và lỵ

Bộ phận dùng: Vỏ quả và vỏ cây - Pericarpium et Cortex Garciniae Mangostanae

Công dụng, chỉ định và phối hợp: Vỏ quả được dùng trị ỉa chảy và kiết lỵ Nước sắc vỏ quả cũng được thụt vào âm đạo phụ nữ để rửa trong trường hợp bị bệnh bạch đới, khí hư Vỏ cây thường dùng trị bệnh ỉa chảy [10, 39, 41, 49, 53]

Tri ̣ ı̉a chảy và kiết lỵ

Lấy khoảng mười cái vỏ cho vào một nồi đất, đậy thật kín bằng một tàu lá chuối Sau đó đun sôi cho đến khi nước có màu thật sẫm, uống mỗi ngày 3 – 4 chén Ở vùng nóng người ta còn phối hợp với các vị thuốc khác: vỏ Măng cụt khô 60g, hạt Mùi 5g hạt Thìa là 5g đem sắc trong 1200mL nước Ðun sôi kỹ, còn lại 600mL chiết ra để uống, ngày hai lần, mỗi lần 120mL Có thể gia thêm rượu thuốc phiện

Khử mùi hôi miệng

Trong vỏ trái măng cụt chứa nhiều xanthones Hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm Vì vậy khi ăn hoặc súc miệng bằng nước làm từ vỏ măng cụt sẽ làm giảm mùi hôi miệng Cách dùng: Lấy phần thịt vỏ của một quả măng cụt xay nhuyễn với mật ong và 200 mL nước, lọc bớt xác và uống Để tăng vị thơm ngon, có thể cho thêm đường và đá vì vỏ măng cụt chứa nhiều tannin, vị đắng chát

Trị nám và tàn nhang

Trị mụn

Phơi khô phần vỏ măng cụt nạo được, nghiền nhỏ Khi sử dụng, trộn đều với 4 thìa cafe dầu ô liu rồi thoa hỗn hợp lên mặt khoảng 30 phút, rửa sạch

Hình 1.3 Hình ảnh về sản phẩm thực phẩm chức năng được chế tạo từ vỏ quả măng cụt

1.4 Thành phần hóa ho ̣c có trong các bô ̣ phâ ̣n của cây măng cu ̣t

Theo một báo cáo được công bố vào năm 1958, α-mangostin lần đầu tiên được phân lập từ vỏ quả măng cụt khô vào năm 1855 bởi nhà khoa học người Đức W Schmid Sau đó, các nỗ lực đầu tiên để xác định các cấu trúc của α-mangostin lần lượt được thực hiện bởi một số các nhà hóa học, bao gồm Dragendorff, Murakami,

và Yamashiro, nhưng họ đã không thống nhất được một cấu trúc cuối cùng Cho tới tận năm 1958, cấu trúc chính xác của α-mangostin được mới đề xuất bởi Yates và Stout qua các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và tái tổng hợp [60] Đây là một tinh

15

thể hình phiến nhỏ, màu vàng tươi, ít tan trong nước, tan trong rượu, ether và kiềm Nhiệt độ nóng chảy là 175°C [28]

Tı́nh đến năm 2015, đã có hơn 85 hơ ̣p chất thứ sinh đươ ̣c phân lâ ̣p từ các bộ

phân của cây Măng cu ̣t Trong số đó có 68 hơ ̣p chất thuô ̣c nhóm xanthone (Bảng 1.1),

phổ biến nhất là các hơ ̣p chất α-mangostin (1), β-mangostin (2) và γ-mangostin (3) Ngoài ra, các thành phần khác của cây măng cụt đã được công bố đó là: các flavonoid (72-76), các triterpenoid (77-83), các benzophenone (69-71), một hợp chất biphenyl (84), một hợp chất pyrrole (85), và một benzofuran (86) [7]

Lớp thịt quả ăn được thường chỉ chiếm 1/3 khối lượng quả Theo các kết quả phân tı́ch, trong 100g thịt quả phần ăn được có chứa 79,2g nước, 0,5g chất đạm, một

ít chất béo, 19,8g carbohydrate, 0,3g chất xơ, 11mg Ca, 17mg P, 0,9mg Fe, 4,2µg Vitamin A, 66mg Vitamin C Năng lượng trung bình 340kJ/100g Ngoài ra, vỏ quả rất giàu pectin, catechin, tanin, colophan và chất nhuộm màu đen Vỏ cây cũng chứa nhiều tanin, mangostin và amiliasine [21]

Trong quá trình nghiên cứu khả năng chiết tách các hợp chất phenolic của các dung môi từ vỏ quả măng cụt, các nhà khoa học là Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên [51] đã đưa đến kết luận là dung môi tốt nhất cho việc chiết rút các hợp chất thứ sinh thuộc dạng phenolic từ vỏ quả măng cụt đó là methanol và ethanol và dịch chiết methanol và ethanol từ nguyên liệu vỏ quả măng cụt không chỉ chứa các hợp chất flavonoid mà còn có alkaloid, curmarin, tanin

Trong vỏ quả măng cu ̣t còn có chứa từ 7-13% tanin, tuy nhiên không được sử

du ̣ng để thuộc da Nguyên nhân do: theo yêu cầu của những nhà thuộc da, nguyên liệu để thuộc không được chứa các thành phần không phải tanin chiếm quá 50% hàm lươ ̣ng tanin có trong chất tan Trong khi đó, vỏ quả măng cụt chứa trong phần tan trong nước khoảng 13,61% tanin và 15,49% không phải tanin Ngoài ra, vỏ quả măng

cu ̣t còn chứa các chất nhựa, tinh dầu, chất béo và mô ̣t số hơ ̣p phần khác [10]

31 Cudraxanthone G

O

OH O

OCH3OH

OH

MeO

34

18

O O

41 Mangostenone D

O

OH O

OH OH

42 Garcimangosone C

19

O

O OH

OH OH

43 Mangostinone

O

O OH

OH O

OH HO

44

O

O OH

OH OH

20

O

O OH O

O OH

55

O

O HO

21

O

O MeO

HO

O

OH OH

61

O

O MeO

HO

OH OH

O

62

O

O MeO

OH

66

Bảng 1.2 : Các thành phần khác ngoài xanthone được tı̀m thấy trong cây măng cụt

OGlc

71

OH HO

72 Epicatechin

O

OH OH

OH

O OH

76 procyanidins B2

86

1.5 Mô ̣t số hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c quý của vỏ quả măng cu ̣t

1.5.1 Hoa ̣t tı́nh chống oxy hóa

Năm 1994, Yoshikawa và cộng sự nghiên cứu rằng chiết xuất bằng methanolic

từ vỏ quả măng cụt được các chất α và γ-mangostin có tác dụng chống oxy hóa [61] Năm 1995, Williams đã tìm thấy tác dụng làm giảm quá trình oxy hóa lipoproteins (LDL) trong cơ thể con người bởi α-mangostin Ông cũng phát hiện ra rằng α-mangostin giúp kéo dài khoảng thời gian bị chậm của mối liên hợp dienes và làm giảm sự sản xuất của các phản ứng nguyên chất thiobarbituric và làm giảm liều dùng α-tocopherol gây ra bởi sự oxy hóa LDL [58]

Mặt khác, năm 2002, Leong và Shui đã làm phép so sánh tổng thể khả năng chống oxy hóa của 27 hoa quả hiện có ở thị trường Singapore, bao gồm Măng cụt, sử

26

dụng thí nghiệm ABTS và DPPH đã thể hiện rằng các chiết xuất từ vỏ quả măng cụt đứng thứ 8 trong hiệu quả chống oxy hóa [22]

Năm 2006, Weecharangsan và cộng sự đã nghiên cứu ra rằng sự chống oxy hóa

và đặc tính bảo vệ hệ thần kinh của 4 chiết xuất được lấy từ vỏ quả măng cụt (nước, 50% ethanol, 95% ethanol và ethyl acetate) Các chiết xuất này thể hiện tác động bảo

vệ hoạt động hệ thần kinh được sử dụng với liều 50 µg/mL Chiết xuất bằng 50% ethanol có hoạt động bảo vệ hệ thần kinh cao hơn chiết xuất từ nước [56]

Năm 2007 Chomnawang đã chỉ ra rằng chiết xuất vỏ quả măng cụt bằng ethanolic có khả năng chống oxy hóa rất cao Chiết xuất này cho giá trị IC50 là 6,13 µg/mL.T hêm vào đó, chiết xuất từ vỏ măng cụt làm giảm đáng kể phản ứng oxy hóa

của polymorphonuclear leucocytes (PML) Cùng năm 2007, Haruenkit đã chỉ ra rằng

ở những cá thể chuột thí nghiệm được cho ăn bởi chế độ ăn là 1% cholesterol và thêm 5% vỏ măng cụt ngăn ngừa sự tăng lipids huyết thanh và sự giảm của hoạt động chống oxy hóa so với khi chỉ dùng cholesterol [15]

Gần đây, năm 2008, Trong phòng thí nghiệm, Guzman-Beltran đã phân lập được α-mangostin được chiết xuất từ vỏ quả măng cụt và nước Măng cụt thương mại, có thể làm sạch ROS và ngăn ngừa nhiễm độc thần kinh và sản xuất ROS bởi 3-nitropropionic acid trong nuôi cấy tế bào thần kinh

1.5.2 Hoạt tính chống ung thư

Năm 2002, Ho và các cộng sự thấy rằng garcinone E có tác dụng mạnh gây độc

tế bào trên dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Họ đã nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của 6 xanthone được phân lập từ vỏ quả măng cụt và thấy rằng garcinone

E là độc nhất Vì vậy, garcinone E đã được thử nghiệm so với HCC36, TONG, HA22T, Hep3B, HEpG2 và SK-Hep-1 dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan; 125 NCI-Hut, CH27 LC-1, H2891 và Calu-1 dòng tế bào ung thư phổi và AZ521, NUGC

3, Kato-III và AGS dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày Garcinone E có phổ rất rộng

27

và các tác dụng gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư khác nhau, trừ dòng

tế bào ung thư biểu mô phổi CH27 LC-1, tất cả các dòng tế bào thử nghiệm đã bị tiêu diệt Các giá trị LD50 chống lại các dòng tế bào trên là từ 0,1µM đến 5,4µM Garcinone E có tác dụng chống u theo thứ tự sau: SK-Hep-1> HA22T> HEpG2> Hep3B> HCC36 [16]

Năm 2003, Matsumoto và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 6 xanthone ( α, ß và γ-mangostin, mangostinone, garcinone E và 2-isoprenyl-1, 7-dihydroxy-3-methoxy xanthone) được cô lập từ vỏ quả măng cụt gây sự ức chế tăng trưởng tế bào của tế bào bệnh bạch cầu HL60 trên con người Các kiểm tra tác động gây độc tế bào

72 h sau khi ủ tế bào với xanthone với hàm lượng 5 hoặc 40µM, tất cả các xanthone cho thấy hiệu quả ức chế đáng kể, nhưng α, ß và γ-mangostin đặc biệt hiệu quả từ 10

µM [25]

Năm 2004, Nabandith và các cộng sự đã tiến hành thí nghiệm với liều chỉ định của α-mangostin có trong chế độ ăn có tác dụng ngắn hạn chemopreventive trên tổn thương preneoplastic liên quan tới chất ung thư đại tràng ở chuột được gây ra bởi một mũi tiêm dưới da 1,2-dimethylhydrazine, DMH (40 mg/kg trọng lượng cơ thể, 1 mũi tiêm/tuần, trong 2 tuần) Họ nhận thấy rằng liều lượng α-mangostin trong chế độ ăn uống ức chế đáng kể tới các tác dụng sinh học ngắn hạn của chất sinh ung thư ruột gây ra bởi DMH [30]

Cũng trong năm đó, Moongkarndi và các cộng sự đã thử nghiệm hoạt động chống tăng trưởng của 9 loại thuốc có nguồn gốc thực vật trên dòng tế bào ung thư tuyến vú SKBR3 của con người Các chiết xuất thu được từ vỏ quả măng cụt có hoạt động mạnh nhất với giá trị IC50 là 15,45 ± 0,5 µg/mL [27]

Năm 2005, Matsumoto và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 4 xanthone (α, ß, γ-mangostin và methoxy-ß-mangostin) tới sự tăng trưởng tế bào ung thư ruột DLD-1 trên con người Ngoại trừ methoxy-ß-mangostin, 3 xanthone còn lại ức chế

Cùng năm đó, Suksamrarn và các cộng sự phân lập từ vỏ quả măng cụt được

ba xanthone mới (mangostenones C, D và E) cũng như 16 xanthone đã được biết đến Các đặc tính gây độc tế bào của các xanthone đã được xác định trên ba dòng tế bào ung thư ở người: ung thư da biểu mô miệng (KB), ung thư vú (BC-1), và ung thư tế bào phổi (NCI-H187 [46]

Năm 2007, Nakagawa và các cộng sự đã tiến hành trong ống nghiệm với mangostin để xác định tác dụng gây độc trên các tế bào DLD-1 Họ đã chứng minh rằng số lượng của tế bào sống bị giảm với liều 20 µM mangostin Họ cũng cho thấy

α-sự hiệp đồng gây ức chế tăng trưởng trong các tế bào bằng cách điều trị kết hợp của 2,5 µM mangostin và 2,5 µM 5-fluorouracil (5-FU), một tác nhân hóa trị liệu cho ung thư tuyến đại trực tràng [31]

Tóm lại, kết quả cho thấy α-mangostin, và các chất tương tự sẽ là tiềm năng cho các ứng dụng phòng ngừa và điều trị ung thư

1.5.3 Hoạt tính chống viêm và chống dị ứng

Có bằng chứng về tính chất chống dị ứng và chống viêm của vỏ quả măng cụt trong các mô hình in vitro khác nhau

29

Năm 1979, Shankaranarayan và cộng sự thực hiện tổng hợp các chất dẫn xuất xanthone (3-O-methyl mangostin, 3,6-di-O-methyl mangostin, mangostin triacetate, 1-isomangostin, mangostin-3,6-di-O-(tetra acethyl)-glucoside và mangostin-3,6-di-O-glucoside) từ α-mangostin được sử dụng trong nghiên cứu dược lý Liều lượng dùng theo đường uống và tiêm (50 mg/kg) cho thấy hoạt động chống viêm ở chuột thử nghiệm [44]

Năm 1980, Gopalakrishnan cho thấy rằng α-mangostin ức chế hệ thống phản ứng phản vệ, immunocytoadherence trên chuột, và ức chế các phản ứng sơ cấp và thứ cấp gây ra bệnh viêm khớp ở chuột [14]

Năm 1996, Chairungsrilerd và cộng sự đã chứng minh rằng chiết xuất bằng methanolic từ vỏ quả măng cụt gây ức chế các cơn co thắt động mạch chủ ngực trên thỏ bởi histamin và serotonin Họ cho rằng α và γ-mangostin là tác nhân ức chế histaminergic, serotonergic tương ứng [2]

Năm 2002, Nakatani và cộng sự đã kiểm tra tác dụng của các chiết xuất từ vỏ quả măng cụt (trong ethanol-nước tỉ lệ 40%, 70% và 100% thể tích) Họ phát hiện rằng chiết xuất ethanol 40% gây ức chế sự giải phóng histamine gây ra bởi IgE trong các tế bào RBL-2H3 Tác dụng này là cao hơn so với chiết xuất bởi dung dịch nước

của cây trà ngọt Trung Quốc (Rubus suavissimus), hiện đang được sử dụng làm thuốc

chống dị ứng ở Nhật Bản [32]

Năm 2006, Yamakuni và cộng sự được tìm thấy garcinone B (10 µM) làm giảm 30% sự gia tăng của PGE2 gây ra bởi A23187 trong tế bào u thần kinh đệm C6 trên chuột Garcinone B (20 µM) cũng làm giảm khoảng 30% lypopolisaccharide Những kết quả này cho thấy rằng garcinone B có thể là chất có tính chất dược lý phù hợp để điều trị viêm nội bào [59]

Năm 2008, Chen và cộng sự đã chứng minh rằng α và γ-mangostin ức chế đáng

kể lipopolysaccharide, kích thích sản xuất NO· và làm tăng khả năng gây độc cho tế

30

bào RAW246.7 Giá trị IC50 tương ứng là 12,4 và 10,1 µM cho α và γ-mangostin Mặt khác, α-mangostin và γ-mangostin cũng làm giảm đáng kể việc tạo PGE2 trong lipopolysaccharide hoạt hóa tế bào RAW246.7 với giá trị IC50 tương ứng là 11,08 và 4,5 µM [4]

Tất cả các điều trên cho thấy các xanthone được chiết xuất từ vỏ quả măng cụt

có thể là một nguồn chất có tác dụng chống viêm và chống dị ứng tốt

1.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus

Một số nghiên cứu đã chứng minh tính chất kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus của các xanthone và chiết xuất thu được từ vỏ quả măng cụt

Năm 1983, Sundaram và cộng sự đã nghiên cứu các đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm của α-mangostin và bốn trong số các dẫn xuất của nó Họ nhận thấy rằng

vi khuẩn S aureus, P aeruginosa, Salmonella typhimurium và Bacillus subtilis là rất nhạy cảm với các xanthone trong khi Proteus sp., Klebsiella sp và Escherichia coli

là chỉ nhạy cảm ít Về nấm, Epidermophyton floccosum, Alternaria solani, Mucor sp., Rhizupus sp và Cunninghamella echinulata cũng nhạy cảm với các xanthone trong khi Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Fusarium roseum, Curvularia lunata chỉ nhạy

cảm ít Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của α-mangostin trong khoảng 12,5 và 50 µg/mL đối với vi khuẩn, và từ 1 đến 5 µg/mL cho nấm Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm được xếp theo trình tự sau: α-mangostin> isomangostin> 3-O-methyl mangostin> 3,6-di-O-methyl mangostin Mangostin triacetate không có tác dụng [48]

Năm 1996, Iinuma và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế của các xanthone

được phân lập từ vỏ quả măng cụt, chống lại sự phát triển kháng methicillin của S aureus (MRSA) α- mangostin có tác dụng ức chế mạnh, với giá trị MIC 1,57-12,5

µg/mL [18]

31

Tới năm 1997, Chanarat và cộng sự đã tìm thấy rằng các polysaccharides thu được từ chiết xuất vỏ quả măng cụt có thể kích thích hoạt động của các tế bào thực

bào đa nhân chống lại vi khuẩn Salmonella enteritidis [3]

Tới năm 2003, Suksamrarn và cộng sự đã nghiên cứu tiềm năng chống lao của các xanthone prenylated thu được từ vỏ quả măng cụt Trong số đó, α, và ß-

mangostin và garcinone B cho thấy tác dụng ức chế đối với Mycobacterium tuberculosis mạnh nhất, với MIC là 6,25 µg/mL, trong khi demethylcalabaxanthone

và trapezifolixanthone có giá trị MIC là 12,5 µg/mL và γ-mangostin, garcinone D, mangostanin, mangostenone A và tovophyllin B có giá trị MIC là 25 µg/mL Các kháng thể xanthone với tiềm năng chống lao phổi thấp là mangostenol và mangostanol với giá trị MIC tương ứng là 100 µg/mL và 200 µg/mL [47]

Năm 2005, Chomnawang và cộng sự đánh giá hoạt động kháng khuẩn của 19

cây thuốc từ Thái Lan chống lại Staphylococcus epidermidis và Propionibacterium acnes, là các vi khuẩn hình thành mủ gây ra tình trạng viêm Chỉ có 13 cây thuốc

dược liệu ở Thái Lan có thể ức chế sự tăng trưởng của cả vi khuẩn Trong số này, các chất chiết xuất từ vỏ quả măng cụt cho tác dụng ức chế mạnh nhất, với giá trị MIC 0,039 µg/mL đối với các vi khuẩn [8]

Năm 2007, Rassameemasmaung công bố nước súc miệng nguồn gốc thảo dược có chứa chiết xuất từ vỏ quả măng cụt có một số tác dụng chống lại các hợp chất lưu huỳnh dễ bay hơi, mảng bám và chảy máu nhú, với đối tượng nghiên cứu là

60 người bị viêm nướu nhẹ hoặc vừa phải mãn tính, do đó chiết từ vỏ quả măng cụt

có thể được sử dụng như một chất hỗ trợ trong điều trị bệnh hôi miệng [40]

1.5.6 Hoạt tính chống sốt rét:

Một số xanthone được phân lập từ vỏ quả măng cụt đã cho thấy tác dụng chống

sốt rét trên cơ thể người chống lại các ký sinh trùng Plasmodium falciparum

ß-mangostin và α-ß-mangostin cho giá trị IC50 là 7 và 5,1µM tương ứng, trong khi

32

mangiferina, một xanthone-glucoside, cho giá trị IC50 cao hơn 50µM Mặt khác, năm

2006, Mahabusarakam thực nghiệm thấy rằng α-mangostin cho giá trị IC50 là 17µM

đối với P falciparum [24]

1.5.7 Một số tác dụng sinh học khác

Qua các thí nghiệm của các xanthone đối với các chứng viêm đã cho thấy, cả mangostin và garcinone B còn có tác dụng kháng viêm với cùng một cơ chế tác động Ngoài ra, α-mangostin còn thể hiện tác động đối kháng có cạnh tranh đối với Histamin H1 góp phần làm giảm các cơn đau co thắt động mạch [32]

γ-Thêm nữa, dịch chiết thô từ vỏ quả măng cụt còn thể hiện tác dụng ức chế sự hoạt động của enzym α-amylase, tác dụng này góp phần hiệu quả trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin [45]

1.6 Phương pháp chiết tách xanthone từ vỏ quả măng cụt

Năm 2012, Nuttawan Yoswathana đã thực hiện một loạt các thí nghiệm nhằm tìm ra phương pháp chiết tách xanthione từ vỏ khô của quả măng cụt Ông đã sử dụng phương pháp chiết tách bằng chiết sử dụng sóng siêu âm (Ultrasonuc assisted extraction – UAE) và so sánh với các phương pháp truyền thống là ngâm chiết và chiết soxhlet Các kết quả được trình bày cho thấy phương pháp chiết bằng siêu âm trong 0,5h, so với chiết Soxhlet trong 2h và ngâm chiết trong 2h, hàm lượng xanthone được trích ly tương ứng là 0,1760; 0,1221 và 0,0565 mg/1g vỏ khô [62]

Kết quả thực nghiệm của ông được trình bày trong hình 1.4

33

Hình 1.4 So sánh một số phương pháp chiết xanthone từ vỏ quả măng cụt

Như vậy phương pháp này tỏ ra có nhiều ưu điểm vượt trội như: tiết kiệm thời gian, hiệu quả chiết cao và dễ dàng thực hiện hơn nhiều so với hai phương pháp còn lại

Trước đó vào năm 2011, Zarine và Sanka Kadimi đã thực hiện phương pháp chiết các xanthone từ vỏ măng cụt bằng Carbondioxide siêu tới hạn Điều kiện hoạt động được thực hiện cở các áp suất 20, 25 và 30Mpa tại các nhiệt độ 40, 50 và 60°C Tổng hàm lượng xanthone được chiết xuất tại 30Mpa và 60°C là 7,56% khối lượng [63] Phương pháp này tỏ ra có nhiều ưu điểm là thời gian thực hiện rất nhanh chóng, chiết xuất tách được có hàm lượng cao và được làm giàu ngay trong quá trình chiết Tuy nhiên, quy trình tiến hành lại khá phức tạp, đòi hỏi các thiết bị và công nghệ hiện đại, giá thành cao, lượng mẫu chất thực hiện không nhiều Do vậy, ở thời điểm hiện tại phương pháp UAE vẫn tỏ ra ưu điểm hơn cả

34

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mẫu nghiên cứu

Quả măng cụt (Garcinia mangostana Linn.) được thu mua tại Hà Nô ̣i và Thành

phố Hồ Chí Minh vào tháng 7 năm 2015, tách lấy phần vỏ, rửa sạch, cắt nhỏ thành dạng miếng kích thước 1 – 2cm, phơi khô trong bóng mát từ 3 – 5 ngày Mẫu vỏ quả sau đó được sấy khô và nghiền nhỏ, sử dụng máy nghiền búa với cỡ rây 0,1 mm Thu được mẫu bột mịn, khô

Hình 2.1 Mẫu thực vật được tách vỏ, cắt nhỏ, sấy khô và nghiền thành dạng bột mịn

2.2 Phương pháp chiết tách

Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển

hóa một chất hòa tan trong một pha lỏng (hoặc rắn) vào một pha lỏng khác (không tan lẫn với nó)

Cơ sở của quá trình chiết dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn nhau Sự phân bố khác nhau này dựa trên tính tan khác nhau của chất nghiên cứu trong các pha lỏng

Quá trình chiết tuân theo định luật Nerst:

35

=

Trong đó:

KA : Hằng số phân bố của chất tan trong hai pha lỏng

CA : Nồng độ chất tan trong pha lỏng A

CB : Nồng độ chất tan trong pha lỏng B

Quá trình chiết thực vật

 Lựa chọn dung môi chiết

Thông thường, các chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật có độ phân cực rất khác nhau Tuy vậy, các thành phần tan trong nước (có độ phân cực lớn) thường ít được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết được chọn lựa rất cẩn thận, nó cần có khả năng hòa tan các chất nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ (bằng chưng cất thu hồi dung môi), có tính tương đối trơ (không phản ứng hoặc làm biến đổi chất nghiên cứu), ít độc hại, khó cháy nổ Ngoài ra, các dung môi này cũng cần được làm sạch (bằng chưng cất) trước khi sử dụng trong quá trình chiết nhằm tránh ảnh hưởng của tạp chất đến quá trình chiết

Methanol và Ethanol là các dung môi thường được sử dụng trong quá trình này, chúng có độ phân cực cao hơn các hydrocarbon có nhóm thế Người ta cho rằng, các alcol này có khả năng thẩm thấu tốt hơn qua màng tế bào thực vật, do đó sẽ chiết được tốt hơn các thành phân nằm sâu bên trong tế bào

Mặt khác, chloroform cũng thường được sử dụng, do chúng có độ phân cực thấp hơn, có khả năng hòa tan các chất bên ngoài thành tế bào Sau quá trình chiết, các dung môi được tách và thu hồi bằng thiết bị cất quay chân không ở nhiệt độ từ 30-

36

40°C Một số trường hợp, với các chất nghiên cứu khá bền nhiệt, nhiệt độ cất có thể lên tới 50-60°C

 Quá trình chiết

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

- Quá trình chiết hồi lưu dung môi sử dụng thiết bị chiết Soxhlet

Đây là phương pháp chiết nóng (có gia nhiệt) bằng cách đun hồi lưu dung môi với mẫu rắn trong một thời gian hoặc một số lần chu trình bay hơi – ngưng tụ của dung môi Phương pháp này có ưu điểm là nhanh chóng, tiết kiệm dung môi, có thể chiết nhiều lần hoặc với nhiều dung môi Tuy nhiên, mặt hạn chế lớn nhất của phương pháp này là khối lượng mẫu nghiên cứu nhỏ và thiết bị đắt tiền, dễ vỡ, tiêu tốn nước làm mát và nhiệt năng (hoặc điện năng)

- Quá trình ngâm chiết

Ngâm mẫu rắn vào dung môi được lựa chon trong một thời gian để các chất cần nghiên cứu phân bố từ mẫu rắn vào dung môi rồi đem lọc thu dịch chiết (chiết nguội) Quá trình này được sử dụng rộng rãi do nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian, quá trình chiết có thể được đẩy nhanh bằng kết hợp với gia nhiệt và siêu âm trong bể siêu âm chuyên dụng Hạn chế của phương pháp này là việc sử dụng một lượng tương đối lớn dung môi Tuy vậy, điều này có thể khắc phục được bằng việc thu hồi và tái sinh dung môi bằng các thiết bị chưng cất

2.3 Phương pháp sắc ký cô ̣t (CC)

Khái niệm: Sắc ký là phương pháp tách, phân ly các chất dựa vào ái lực và sự

phân bố khác nhau của chúng với pha tĩnh và pha động

Thông thường, trong phương pháp sắc ký, pha động (chất mang) là các lưu thể (ở thể khí hoặc lỏng), pha tĩnh (chất hấp phụ) ở thể rắn

37

Hỗn hợp chất nghiên cứu được hòa tan trong pha động rồi cho chạy qua pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ tương tác và phan bố qua lại giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan, độ phân cực, ái lực cột ) Các chất khác nhau có ái lực khác nhau với pha tĩnh được nhồi trong cột sắc ký Trong quá trình pha động chuyển dộng dọc theo hệ sắc

ký, liên tục xảy ra quá trình hấp phụ và giải hấp phụ Kết quả là, các chất có ái lực nhỏ với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanh và rời khỏi cột sớm hơn Các chất có ái lực lớn với cột sẽ chuyển động chậm hơn và ra khỏi cột sau

Ngoài ra, người ta có thể tiến hành sắc ký phân đoạn bằng cách đưa hỗn hợp chất nghiên cứu hấp phụ hoàn toàn lên một lượng dư pha tĩnh trên cột Sau đó sử dụng các hệ dung môi với độ phân cực khác nhau để rửa giải từng phần cấu tử có độ phân cực tương ứng Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc làm sạch hỗn hợp có chứa nhiều tạp chất ngoài chất nghiên cứu để thu gom các phân đoạn giàu cấu tử nghiên cứu Đây cũng là nền tảng của phương pháp chiết pha rắn (SPE) hiện đang được sử dụng phổ biến trong hóa phân tích

Phương pháp sắc ký cột dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trên hai pha động và pha tĩnh Ở điều kiện đẳng nhiệt, với quá trình hấp phụ, quá trình tuân theo định luật hấp phụ đơn phân tử Langmuir:

Trong đó:

n : Lượng chất hấp phụ lên pha tĩnh tại thời điểm cân bằng

n∞ : Lượng chất hấp phụ cực đại của pha tĩnh đối với chất nghiên cứu

b : Hằng số hấp phụ

C : Nồng độ của chất nghiên cứu

38

Phương pháp sắc ký cột

Đây là phương pháp phổ biến nhất, chất hấp phụ pha tĩnh là các loại silicagel có kích thước hạt khác nhau ở hai dạng pha thường (cùng tính chất pha động) hoặc pha đảo (khác tính chất pha động, phổ biến hơn) YMC, ODS, Dianion

Chất hấp thụ được nhồi vào cột (thường là cột trơ như thủy tinh) tạo thành cột sắc ký Độ mịn của hạt chất hấp phụ rất quan trọng, nó quyết định số đĩa lý thuyết và qua đó ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của quá trình tách Kích thước hạt càng nhỏ thì bề mặt hấp phụ càng lớn, do đó số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng phân tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên, nếu kích thước hạt quá nhỏ, trở lực của cột tăng cao, tốc

độ dòng chảy giảm, dẫn đến quá trình tốn nhiều thời gian và có thể gây hiện tượng nghẽn cột Hiện nay, để tăng số đĩa lý thuyết và giảm thời gian sắc ký, người ta thường

sử dụng sắc ký cột dưới điều kiện áp suất cao ở đầu cột, thông qua các thiết bị như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC)

Tỷ lệ đường kính (D) và chiều dài (L) của cột, tỷ số L/D phụ thuộc vào bản chất

và hàm lượng chất nghiên cứu cần phân tách

Có hai kỹ thuật thông dụng để đưa chất hấp phụ lên cột:

- Kỹ thuật nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp lên cột khi còn khô,

sau đó dùng tay hoặc vật mềm để gõ nhẹ lên thành cột, nhằm đưa các hạt phân

bố đều trong cột, sau đó dùng dung môi chạy để hoạt hóa cột

- Kỹ thuật nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được ngâm trước bằng dung môi chạy cột

với lượng nhỏ, sau đó được chuyển lên cột tới đủ lượng cần thiết Phương pháp này có ưu điểm là cột được nhồi đều so với kỹ thuật nhồi cột khô

Khi chuẩn bị cột, cần chú ý không để có bọt khí trong cột, gây hiện tượng “chảy rối” làm giảm hiệu quả phân tách Trong quá trình chạy cột, chất hấp phụ luôn được ngập trong dung môi, không được nứt, gãy, rò