Xây dựng phương pháp định lượng vitamin b6 và cystin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ KHẮC HUY XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VITAMIN B6 VÀ CYSTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ KHẮC HUY Mã sinh viên: 1501215 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VITAMIN B6 VÀ CYSTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Vũ Ngân Bình TS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Khóa luận đƣợc hồn thành mơn Hóa phân tích Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, dƣới hƣớng dẫn, tận tình bảo ThS Vũ Ngân Bình TS Đặng Thị Ngọc Lan Lời đầu tiên, xin đƣợc phép gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến ngƣời hƣớng dẫn tơi hồn thành khóa luận này: ThS Vũ Ngân Bình, TS Đặng Thị Ngọc Lan PGS TS Phạm Thị Thanh Hà Các cô tạo điều kiện thuận lợi nhất, ln nhiệt tình giải đáp thắc mắc, ln khích lệ tinh thần, động viên tơi gặp khó khăn, nhƣ gợi ý hƣớng giải vấn đề gặp phải Tiếp theo, xin trân trọng cảm ơn thầy cô mơn Hóa phân tích Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời tạo điều kiện, giúp đỡ động viên tơi hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, ngƣời thân gia đình ln giúp đỡ tơi suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin kính chúc thầy ln có sức khỏe dồi dào, hạnh phúc thành công tƣơng lai Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Đỗ Khắc Huy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu .2 1.1.1 Tổng quan cystin 1.1.2 Tổng quan vitamin B6 .3 1.1.3 Chế phẩm hai thành phần chứa cystin vitamin B6 1.1.4 Một số phƣơng pháp phân tích cystin vitamin B6 .5 1.2 Tổng quan sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc 10 1.2.1 Pha tĩnh 10 1.2.2 Pha động .10 1.2.3 Cơ chế tách 11 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu 13 2.1.1 Mẫu thử 13 2.2.2 Hóa chất 13 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 14 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 14 2.4.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu .15 2.4.3 Khảo sát điều kiện sắc ký .15 2.4.4 Thẩm định quy trình .17 2.4.5 Áp dụng phƣơng pháp 21 2.4.6 Xử lý kết .21 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .22 3.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thử 22 3.1.1 Khảo sát dung môi pha mẫu 22 3.1.2 Khảo sát thể tích dung mơi pha mẫu 23 3.1.3 Khảo sát thời gian siêu âm 24 3.1.4 Khảo sát thời gian lắc xoáy 25 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 27 3.2.2 Khảo sát pha động 27 3.2.1 Lựa chọn bƣớc sóng phát 29 3.4 Phƣơng pháp phân tích cystin vitamin B6 .30 3.5 Thẩm định phƣơng pháp .31 3.5.1 Độ phù hợp hệ thống 31 3.5.2 Độ chọn lọc 31 3.5.3 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 33 3.5.4 Độ xác phƣơng pháp 33 3.5.5 Độ phƣơng pháp 34 3.3 Đánh giá độ ổn định mẫu 36 3.6 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích chế phẩm viên nén bao phim thị trƣờng 37 3.7 Nhận xét bàn luận 38 3.7.1 Nhận xét trình xử lý mẫu 38 3.7.2 Nhận xét xây dựng thẩm định phƣơng pháp .39 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận .42 4.2 Kiến nghị .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .44 PHỤ LỤC PL-1 Danh mục phụ lục PL-1 Phụ lục 1: Sắc kí đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống PL-2 Phụ lục 2: Sắc kí đồ thẩm định độ chọn lọc PL-6 Phụ lục 3: Chồng phổ độ tinh khiết cystin vitamin B6 với pic sắc kí đồ chuẩn PL-10 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril HPLC HILIC NPLC High Performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Hydrophilic Interaction Liquid Sắc ký lỏng tƣơng tác thân Chromatography nƣớc Normal Phase Liquid Sắc ký lỏng pha thuận Chromatography RPLC Reversed Phase Liquid Sắc ký lỏng pha đảo Chromatography PITC Phenylisothiocyanate Phenylisothiocyanat UV Ultraviolet Tử ngoại UV-VIS Ultraviolet – Visible Tử ngoại – khả kiến RSD (%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số phƣơng pháp phân tích cystin vitamin B6 Bảng 2.1 Quy trình pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 19 Bảng 2.2 Quy trình pha mẫu thử thêm chuẩn 21 Bảng 3.1 Kết khảo sát dung môi pha mẫu 23 Bảng 3.2 Kết khảo sát thể tích dung mơi pha mẫu 25 Bảng 3.3 Kết khảo sát thời gian siêu âm 25 Bảng 3.4 Kết khảo sát thời gian lắc xoáy 26 Bảng 3.5 Kết độ phù hợp hệ thống 31 Bảng 3.6 Kết đƣờng chuẩn 33 Bảng 3.7 Kết độ xác phƣơng pháp 34 Bảng 3.8 Kết độ cystin 35 Bảng 3.9 Kết độ vitamin B6 35 Bảng 3.10 Kết định lƣợng cystin chế phẩm Cystine B6 Bailleul 37 Bảng 3.11 Kết định lƣợng vitamin B6 chế phẩm Cystine B6 38 Bailleul DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo cystin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo pyridoxin hydroclorid Hình 2.1 Hình ảnh chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul 13 Hình 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử 27 Hình 3.2 Kết khảo sát thành phần pha động cột silica 28 Hình 3.3 Kết khảo sát nồng độ muối CH3COONH4 29 Hình 3.4 Kết khảo sát tỉ lệ pha động CH3COONH4 50 mM 30 Hình 3.5 Phổ hấp thụ UV cystin vitamin B6 30 Hình 3.6 Kết độ chọn lọc bƣớc sóng 250 nm 32 Hình 3.7 Kết độ chọn lọc bƣớc sóng 286 nm 32 Hình 3.8 Kết đánh giá độ ổn định mẫu 36 Hình 4.1 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn cystin bƣớc sóng 210 nm 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc cơng cụ hữu ích phân tích Từ đời, kĩ thuật nhanh chóng chứng tỏ đƣợc giá trị mình, đặc biệt phân tích chất phân cực nhƣ acid amin Đối với kĩ thuật sắc kí lỏng thơng thƣờng, việc phân tích chất phân cực thƣờng gặp nhiều khó khăn Sắc kí pha thuận có khả lƣu giữ chất phân tích phân cực tƣơng đối tốt, nhƣng dung môi đƣợc sử dụng thƣờng khơng thân thiện với mơi trƣờng khó hịa tan chất phân tích phân cực Sắc kí pha đảo đƣợc sử dụng phổ biến hơn, sử dụng dung mơi thân nƣớc độc hại Tuy vậy, nhƣợc điểm lớn sắc kí pha đảo lƣu giữ chất phân cực, đó, hiệu lực tách chất phân cực thƣờng không cao Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc đƣợc đời với khả cải thiện đƣợc nhƣợc điểm sắc kí lỏng pha thuận pha đảo Kĩ thuật sử dụng pha động phân cực pha tĩnh phân cực, có khả lƣu giữ chất phân tích tốt sắc kí pha đảo, đồng thời, dung môi thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ nƣớc hay acetonitril hịa tan chất phân tích tốt hơn, thân thiện với môi trƣờng Hiện nay, thị trƣờng có nhiều sản phẩm chứa đồng thời acid amin chất phân cực khác Một số chế phẩm chứa cystin vitamin B6 hỗ trợ điều trị cystathionin – niệu tiên phát Có nhiều phƣơng pháp định lƣợng cystin nhƣ vitamin B6 đơn thành phần, nhiên, chƣa có phƣơng pháp định lƣợng đồng thời chất chế phẩm hai thành phần Chính thế, tơi thực đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng vitamin B6 cystin chế phẩm sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc” đối tƣợng cụ thể viên nén chứa thành phần cystin vitamin B6 Với mục tiêu nhƣ sau: - Xây dựng thẩm định phƣơng pháp phân tích cystin vitamin B6 sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc - Ứng dụng phƣơng pháp để định lƣợng cystin vitamin B6 chế phẩm hai thành phần CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Tổng quan cystin Cystin dạng dimer oxy hóa acid amin cystein, đó, phân tử cystein đƣợc liên kết với cầu nối disulfid Đây liên kết phổ biến phân tử protein, có vai trị ổn định cấu trúc chúng [5] Cystin acid amin tự nhiên, phần protein sinh học mô tổ chức: 2,1% não, gan, tim, thận; 22% móng; 19% tóc Nhờ cấu trúc phân tử có cầu nối disulfid (-S-S-), cystin thành phần tổ chức giàu keratin, giúp thúc đẩy q trình tổng hợp keratin tóc móng [4] Cystin có cơng thức cấu tạo nhƣ hình 1.1: Hình 1.1 Công thức cấu tạo cystin Danh pháp: (2R)-2-amino-3-[[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid Tên khác: Cistina Công thức phân tử: C6H12N2O4S2 Phân tử lƣợng: 240,3 g/mol LogP = -5,08, pKa1 = 1, pKa2 = 2,1, pKa3 = 8,02, pKa4 = 8,71 pI = 5,02 [7] Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng, khơng mùi Bảo quản: Ở nhiệt độ phịng [22] * Độ tan: - Trong nƣớc: Cystin tan nƣớc (190 g/L 20oC) [17] tƣơng đƣơng khoảng 0,791 mM - Trong môi trƣờng acid kiềm: Cystin tan tốt môi trƣờng acid kiềm pH < pH > [22] * Độ ổn định cystin dung dịch: CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Nghiên cứu đạt đƣợc mục tiêu đề ra: - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp thẩm định đạt yêu cầu phƣơng pháp phân tích đồng thời cystin vitamin B6 chế phẩm sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc Điều kiện sắc kí xây dựng đƣợc: + Pha tĩnh: Cột Phenomenex Silica 4,6 x 250 mm; 5µm + Pha động: hỗn hợp ACN : amoni acetat 50 mM có pH 5,5 = 65 : 35 (v/v) + Tốc độ dịng: 1,5 mL/phút + Bƣớc sóng phát hiện: 250 nm cystin 286 nm vitamin B6 + Thể tích tiêm mẫu: 50 µL - Ứng dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc, định lƣợng chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul đạt yêu cầu theo dƣợc điểm Mỹ dƣợc điển Việt Nam V Chế phẩm Ceteco cystine B6 đạt yêu cầu hàm lƣợng cystin theo dƣợc điển Mỹ 42 4.2 Kiến nghị Dựa kết nghiên cứu, xin đƣa kiến nghị sau: Khảo sát tính thích hợp áp dụng phƣơng pháp chế phẩm khác thành phần cystin vitamin B6 nhƣng với tỉ lệ hoạt chất khác (hàm lƣợng cystin : pyridoxin hydroclorid = 500:1) để mở rộng phạm vi ứng dụng phƣơng pháp 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Ngân Bình, Lê Đình Hải, Vũ Thị Phƣơng Huế, Nguyễn Đình Tạo, Phạm Thị Thanh Hà (2020), "Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Ảnh Hƣởng Đến Sự Lƣu Giữ Và Hình Dáng Pic Khi Phân Tích Acid Amin Bằng Sắc Ký Lỏng Tƣơng Tác Thân Nƣớc", Nghiên Cứu Dược & Thông Tin Thuốc 2019, 10(4+5+6), tr 27-33 Bộ Y Tế (2018), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, tr 1217-1219 Bộ Y Tế (2017), Dược Điển Việt Nam V, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, tr 812-814 Bộ Y Tế / Cục Quản Lý Dƣợc (2017), "Tờ thông tin sản phẩm chế phẩm viên nang mềm Cystincap" Nguyễn Văn Rƣ, Nguyễn Xuân Thắng (2015), Hóa Sinh Học, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, tr 41 Tiếng Anh Amaro C O., Flores C., Dias M G., Lidon F C (2014), "Pyridoxine Analysis By High Performance Liquid Chromatography And Validation In Fortified Milk Powder", Acta Alimentaria, 43(10), pp 297-305 Anson M L., Edsall J T (1945), Advances In Protein Chemistry, Academic Press Inc., New York., pp 18 Bartzatt R., Gajmer P., Nguyen M H C., Tran A M H (2016), "Detection and Assay of Vitamin B6 (Pyridoxine Hydrochloride) Utilizing Isocratic High Performance Liquid Chromatography", Journal Of Scientific Research & Reports, 12(3), pp 1-12 Buszewski B., Noga S (2012), "Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) - A Powerful Separation Technique", Anal Bioanal Chem, 402, pp 231-247 10 Dinh N P., Jonsson T., Irgum K (2011), "Probing The Interaction Mode In Hydrophilic Interaction Chromatography", Journal of Chromatography A, 1218, pp 5880-5891 44 11 Greco G., Letzel T (2013), "Main Interactions And Influences Of The Chromatographic Parameters In HILIC Separations", Journal of Chromatographic Science, 51, pp 684-693 12 Hochberg M., Melnick D., Oser B L (1944), "On The Stability Of Pyridoxine", The Journal of Biological Chemistry, 155, pp 129-136 13 Inglis A S., McMahon D T W., Roxburgh C M., Takayanagi H (1976), "Single Analysis for Cysteine, Cystine, and Tryptophan in Proteins", Analytical Biochemistry, 72, pp 86-94 14 Kumar P., Rubies A., Companyó R., Centrich F (2012), "Hydrophilic Interaction Chromatography For The Analysis Of Aminoglycosides", Journal Of Separation Science, 35, pp 498-504 15 Li R., Zhang Y., Lee C C, Lu R., Huang Y (2010), "Development And Validation Of A Hydrophilic Interaction Liquid Chromatographic Method For Determination Of Aromatic Amines In Environmental Water", Journal of Chromatography A, 1217, pp 1799-1805 16 Molnár-Perl I., Morvai M (1992), "Cystine and Cysteine Analysis as the Same Phenylthiocarbamyl Derivatives by HPLC in Protein Hydrolyzates", Chromatographia, 34, pp 132-136 17 National Center for Biotechnology Information / PubChem (2004), "L-Cystine, CID: 67678", Retrieved June 20th, 2020, from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/67678 18 Rutherfurd S M., Gilani G S (2009), "Amino Acid Analysis", Current Protocols In Science, 58, pp 11.9.1-11.9.37 19 SeQuant A (2008), Practical Guide to HILIC: A Tutorial and Application Book, Merck SeQuant AB, Umeå, Sweden, pp 1-29 20 Shaw K N F., Lieberman E., Koch R., Donnell G N (1967), "Cystathioninuria", The American Journal of Disease of Children, 113, pp 119128 21 Shinohara K., Kilpatrick M (1934), "The Stability Of Cystine In Acid Solution", The Journal of Biological Chemistry, 105, pp 241-251 22 Sigma-Aldrich (2020), "C8755, Product Information Sheet" 45 23 Thannhauser T W., Sherwood R W., Scheraga H A (1998), "Determination of the Cysteine and Cystine Content of Proteins by Amino Acid Analysis: Application to the Characterization of Disulfide-Coupled Folding Intermediates", Journal of Protein Chemistry, 17, pp 37-43 24 United States Pharmacopeial Convention (2017), USP 40 - NF 35, United States Pharmacopeial, USA, pp 74 25 United States Pharmacopeial Convention (2012), USP 35 - NF 30, United States Pharmacopeial, USA, pp 1264-1265 46 PHỤ LỤC Danh mục phụ lục Phụ lục 1: Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống PL-1 Phụ lục 2: Sắc kí đồ độ chọn lọc PL-6 Phụ lục 3: Chồng phổ độ tinh khiết cystin vitamin B6 .PL-10 PL-1 Phụ lục 1: Sắc kí đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống bƣớc sóng 250 nm Lần Lần Lần PL-2 Lần Lần Lần PL-3 Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống bƣớc sóng 286 nm Lần Lần Lần PL-4 Lần Lần Lần PL-5 Phụ lục 2: Sắc kí đồ thẩm định độ chọn lọc Sắc kí đồ độ chọn lọc bƣớc sóng 250 nm Mẫu trắng Chuẩn cystein Chuẩn đơn cystin PL-6 Chuẩn hỗn hợp cystin vitamin B6 Mẫu thử Mẫu thử thêm chuẩn cystin PL-7 Sắc kí đồ độ chọn lọc bƣớc sóng 286 nm Mẫu trắng Chuẩn đơn vitamin B6 Chuẩn hỗn hợp cystin + vitamin B6 PL-8 Mẫu thử Mẫu thử thêm chuẩn vitamin B6 PL-9 Phụ lục 3: Chồng phổ độ tinh khiết cystin vitamin B6 với pic sắc kí đồ chuẩn Chồng phổ cystin Chồng phổ vitamin B6 PL-10 ... lƣợng vitamin B6 cystin chế phẩm sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc” đối tƣợng cụ thể viên nén chứa thành phần cystin vitamin B6 Với mục tiêu nhƣ sau: - Xây dựng thẩm định phƣơng pháp phân tích cystin. .. phƣơng pháp 34 Bảng 3.8 Kết độ cystin 35 Bảng 3.9 Kết độ vitamin B6 35 Bảng 3.10 Kết định lƣợng cystin chế phẩm Cystine B6 Bailleul 37 Bảng 3.11 Kết định lƣợng vitamin B6 chế phẩm Cystine B6 38... HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ KHẮC HUY Mã sinh viên: 1501215 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VITAMIN B6 VÀ CYSTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng