Đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), thực hiện phương pháp cao đinh lăng lá xẻ sau khi chiết xuất và thủy phân sẽ được tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm xác định hàm lượng acid oleanolic.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC TRONG ĐINH LĂNG LÁ XẺ [POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS.] BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thị Phương Thảo*, Võ Thị Bạch Tuyết*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic Đinh lăng xẻ sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp: Cao Đinh lăng xẻ sau chiết xuất thủy phân tiến hành sắc ký lỏng hiệu cao nhằm xác định hàm lượng acid oleanolic Kết quả: Đã xây dựng hoàn chỉnh thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic thân rễ Đinh lăng HPLC Kết luận: Phương pháp định lượng HPLC xây dựng đáng tin cậy Hàm lượng acid oleanolic thân Đinh lăng xẻ cao (1,5%), hàm lượng rễ thấp (0,063%) Từ khóa: Đinh lăng, saponin, acid oleanolic, HPLC ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OFOLEANOLIC ACID IN POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS - ARALIACEAE) BY HPLC Nguyen Thi Phuong Thao, Vo Thi Bach Tuyet, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 593 - 597 Objectives: Study on a HPLC method for quantitative determination of oleanolic acid in Polyscias fruticosa (stems and leaves, and roots) Methods: Extracts of Polyscias fruticosa were hydrolyzed, purifified prior to quantity determination of oleanolic acid by HPLC Results:: A HPLC method to determine oleanolic acid in Polyscias fruticosa was established Conclusions: The analytical method was proven to be reliable The content of oleanolic acid in stems and leaves, and in roots were determined to be 1,5% and 0,063%, respectively Keywords: Polyscias fruticosa, saponin, oleanolic acid, HPLC phẩm lưu hành đơn giản ĐẶT VẤN ĐỀ Đinh lăng xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms - Araliaceace), gọi Gỏi cá, dược liệu sử dụng rộng rãi với tác dụng bổ, tăng lực, chống mệt mỏi, giúp tăng cường khả lao động hoạt động trí não…(1,3) Đinh lăng xẻ chứa saponin triterpen với aglycon acid oleanolic(4) Tuy nhiên, tiêu chí kiểm nghiệm Đinh lăng chế *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: GS TS Nguyễn Minh Đức Chuyên Đề Dược Khoa Vì mục tiêu đề tài nhằm nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic Đinh lăng xẻ sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)(2) với chất chuẩn acid oleanolic, nhằm góp phần phục vụ cho việc kiểm định Đinh lăng xẻ chế phẩm hiệu ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vn.vnn 593 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu - Rễ Đinh lăng thu hái Phú Yên, thân Đinh lăng thu hái Tây Ninh vào tháng 4/2010 - Acid oleanolic chuẩn (độ tinh khiết 99%) Ban Nghiên cứu Khoa học-Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Phương pháp Máy sắc ký Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC-10AD, detector SPD-M10AVP Cột HPLC pha đảo Prontosil LC8 (150 x 4.6 mm, μm) Quy trình chiết xuất định lượng acid oleanolic Rễ, thân Đinh lăng, rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ, xác định độ ẩm Cân xác khoảng g (thân lá) g (rễ) Chiết kiệt 150 ml methanol với dụng cụ Soxhlet 20 Cô dịch chiết đến cắn, hòa với 30 ml dung dịch HCl 10% cồn Thủy phân hồi lưu nhiệt độ sôi Lắc dịch thủy phân với 200 ml dichloromethan (20 ml x lần + 10 ml x lần + ml x 10 lần) Lắc dịch dichloromethan với 500 ml nước cất (100 ml x lần) Làm khan dịch dichloromethan với muối Na2SO4 khan Cô dịch dichloromethan đến cắn sấy chân không nhiệt độ 50oC thu sapogenin toàn phần (chứa chủ yếu acid oleanolic) Cân xác khoảng mg sapogenin tồn phần (thân lá) 10 mg (rễ), hòa tan methanol HPLC bình định mức ml Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc 0.45 μm, tiến hành sắc ký HPLC, tính hàm lượng acid oleanolic Đinh lăng xẻ Điều kiện tiến hành HPLC định lượng acid oleanolic Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu Pha động: CH3CN- H2O (72:28) Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, μm) Detector SPD phát bước sóng 203 nm Tốc độ dòng 0,768 ml/ phút Thể tích bơm mẫu: 20 μl Hình Sắc đồ HPLC acid oleanolic chuẩn (trái, Rt ~ 6,5) sapogenin toàn phần cao thân Đinh lăng (phải) Thẩm định phương pháp HPLC Xác định tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại phương pháp 594 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ Kết điều chế mẫu để định lượng hoạt chất Đinh lăng HPLC Bảng Kết điều chế mẫu để định lượng hoạt chất Đinh lăng HPLC Tên mẫu Độ ẩm dược liệu Thân 8,65% Lượng dược liệu ban đầu (g) 2,0004 Lượng dược liêu Lượng cắn khô (g) sapogenin (mg) 1,8274 136,9 Định lượng acid oleanolic thân Đinh lăng Đường chuẩn HPLC định lượng acid oleanolic thân Đinh lăng Tiến hành xác định diện tích đỉnh acid oleanolic mẫu chuẩn có nồng độ từ 24 đến 300 μg/ml ta thu kết sau: Diện tích đỉnh 4500000 4000000 y = 13855x + 21100 3500000 R = 0.9998 3000000 2500000 Lượng cắn pha mẫu định lượng (mg) 3,49 Bảng Các thông số sắc ký ứng với đỉnh acid oleanolic Số lần bơm TB SD RSD% Thời Diện tích Hệ số Độ phân Số đĩa lý gian lưu đỉnh bất đối giải thuyết 6.507 2354748 0.88 1.6 1604 6.461 2378642 0.86 1.55 1628 6.425 2315583 0.83 1.54 1611 6.44 2398933 0.86 1.62 1592 6.471 2439432 0.86 1.58 1546 6.548 2433719 0.87 1.59 1562 6.475333 2386843 0.86 1.58 1590.5 0.045364 47506.76 0.016733 0.030332 30.99516 0.700562 1.99036 1.945721 1.919715 1.948768 2000000 RSD% thời gian lưu 0.7% (