Báo cáo nghiên cứu khoa học: "XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIGMASTEROL TRONG CÂY RÁY (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO" pot

43 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 63, 2010 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIGMASTEROL TRONG CÂY RÁY (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế Đặng Thị Ngọc Hoa Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế TÓM TẮT Quy trình chiết xuất stigmasterol toàn phần từ bột dược liệu ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) trên soxhlet trong 5 giờ trong dung môi chloroform được thực hiện và kiểm soát bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng khi triển khai trên hệ dung môi n-hexan/ethyl axetat (8:2), xác định vết bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. Hàm lượng stigmasterol được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ nhạy cao, trên cột C8 với nhiệt độ cột 30 0 C ± 1, hệ dung môi pha động là acetonitril/đệm phosphate (93:7) pH 4,8 với tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiên 20µl, bước sóng phát hiện tại 195nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2%. Khoảng tuyến tính của nồng độ stigmasterol được khảo sát từ 10–300ppm (r = 0,9995). Phương pháp được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của stigmasterol từ bột ráy đạt 95,2%, giới hạn định lượng là 10ppm. I. Đặt vấn đề Cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) hay còn gọi là môn bạc hà, ráy bạc hà, bạc hà; đôi khi còn gọi là ráy dại, dã vu. Thân rễ ráy được dùng làm thuốc trong phạm vi kinh nghiệm nhân dân, chủ yếu chữa bệnh ngoài da như mề đay đơn ngứa, lỡ khó chữa, sần da chảy nước (nấu nước tắm rửa), xát vào nơi bị lá han gây ngứa tấy; nhiều nơi dùng với tác dụng giảm đau do vẹo cổ, đau xương khớp, điều trị gan nhiễm mỡ [1], [3]. Phytosterol là một trong những thành phần hóa học của cây ráy có hoạt tính sinh học và hàm lượng cao. Stigmasterol là một trong những thành phần chính của phytosterol, có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu, kháng viêm, dùng trong tổng hợp progesterone, và là tiền chất của vititam D3 [3], [4], [6]. Hiện nay, xu hướng và yêu cầu tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu theo WHO nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng là phải xây dựng được quy trình xác định hàm lượng hoạt chất hoặc chất đặc trưng chiếm tỷ lệ lớn trong dược liệu [2], [7]. Vì vậy, 44 trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu kết quả nghiên cứu phương pháp định lượng stigmasterol trong cây ráy bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Thực nghiệm nghiên cứu 2.1. Xử lý mẫu nghiên cứu Thân rễ ráy (Alocasia odora (Roxb.) thu hái vào tháng 12 năm 2009, gọt bỏ vỏ, rửa sạch bằng nước, thái từng lát mỏng 2-5mm, sấy âm can, đặt trong tủ sấy đến khô, nghiền mịn, thu được bột ráy, bảo quản trong bình nhựa kín. Chuẩn stigmasterol 95% của Sigma-aldrich (No: 027K5302), bản Silica gel F 254 (Merck), máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000-PAD detector, cột Sulpenco C8 và C18 (150 x 4,6mm, 5µm) và các dung môi hoá chất tinh khiết (PA và HPLC). 2.2. Khảo sát hệ dung môi triển khai sắc kí lớp mỏng định tính stigmasterol Dung dịch thử: bột ráy khuấy từ trong 2 giờ với CHCl 3 /MeOH = 2:1(v/v), lọc qua giấy lọc. Dịch chiết được thủy phân bằng HCl 1M/MeOH trong 45 phút ở 80 0 C, sau đó trung hòa bằng KOH 20%/MeOH đến pH > 7, chiết trong ete dầu hoả và loại nước bằng Na 2 SO 4 khan, cô dịch ete thu được cắn. Hòa tan cắn trong 1ml CHCl 3 để chấm sắc ký. Dung dịch chuẩn: cân 11.4mg stigmasterol hòa tan trong 1ml CHCl 3 Triển khai trên bản Silica gel F 254 với các hệ dung môi khác nhau: n-hexan/ethyl acetate (9:1), n-hexan/ethyl acetate (8:2), n-hexan/ethyl acetate (7:3), CHCl 3 /MeOH (98:2) và CHCl 3 /CH 3 COCH 3 (8:2) để chọn hệ pha động thích hợp nhất [2]. Phát hiện peak phytosterol bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. 2.3.Xây dựng quy trình chiết stigmasterol toàn phần bằng phương pháp chiết Soxhlet Cân 5g bột ráy, ngâm lạnh 12 giờ với các hệ dung môi chiết CHCl 3 /MeOH (1:1), (2:1) và CHCl 3 100%, chiết Soxhlet với cùng hệ dung môi ngâm lạnh trong 3 giờ, ở 65 0 C để chọn hệ dung môi thích hợp nhất cho việc khảo sát thời gian chiết kiệt stigmasterol tại 3, 4 và 5h để chọn thời gian chiết tối ưu [6]. Hiệu quả chiết xuất được đánh giá bằng tín hiệu peak stigmasterol trên TLC với thuốc thử Liebermann-Burchard sau khi dịch chiết được thủy phân bằng HCl 1M/MeOH trong 45 phút ở 80 0 C. 2.4. Xây dựng phương pháp định lượng stigmasterol trên HPLC Khảo sát các điều kiện cột sắc ký pha đảo (C8 và C18), các hệ dung môi triển khai acetonitril (ACN): đệm phosphate 0,025M với các tỷ lệ khác nhau (90:10, 93:7, 95:5), tại các pH đệm khác nhau (5,3; 5,8; 6,5; 4,8) và thay đổi tốc độ dòng khác nhau (1,0; 1,2; 1,5ml/phút) trên máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000-PAD detector [6]. 45 Dung dịch thử: cắn thu được sau khi thuỷ phân được hòa tan trong 2ml MeOH. Dung dịch chuẩn: hòa tan 20mg stigmasterol trong 100ml MeOH. Các dịch được lắc siêu âm 5 phút để hoà tan, sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào máy. Quy trình phân tích HPLC được xây dựng, tối ưu hoá các thông số tỷ lệ pha động, pH, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện và thẩm định tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng (tỷ lệ phục hồi) và giới hạn định lượng (LOQ). 3. Kết quả và bàn luận Kết quả khảo sát các hệ dung môi triển khai trên TLC (Hình 1) cho thấy trong các hệ dung môi pha động khảo sát, hệ n-hexan/ethyl axetat (8:2) cho peak stigmasterol tách rõ ràng với các vết kề cận, có hệ số phân bố R f =0,64 nằm trong khoảng thích hợp (0,3 – 0,7). Peak stigmasterol cho màu xanh lục đặc trưng của nhóm phytosterol với thuốc thử Liebermann-Burchard. Hình 1. Các hệ dung môi triển khai trên TLC với thuốc thử Liebermann-Burchard (a) CHCl 3 /CH 3 COCH 3 (8:2), (b) CHCl 3 /MeOH (98:2), (c) n-hexan/ethyl acetate (9:1), (d) n- hexan/ethyl acetate (8:2) và (e) n-hexan/ethyl acetate (7:3) Kết quả khảo sát các dung môi chiết xuất stigmasterol toàn phần trong bột ráy bằng chiết Soxhlet cho thấy sau 3h chiết xuất, dịch chiết CHCl 3 thu được hàm lượng hoạt chất nhiều nhất, thể hiện bằng cường độ peak stigmasterol đậm hơn so với tín hiệu peak của dịch CHCl 3 /MeOH (1:1) và (2:1) trong cùng điều kiện chiết xuất. Thời gian chiết kiệt tối ưu nhất khi dùng CHCl 3 là 6h, thể hiện bằng việc không thể phát hiện vết của stigmasterol trên bả dược liệu thu được. Quá trình khảo sát các thông số, điều kiện sắc ký thích hợp cho quá trình định lượng stigmasterol bằng HPLC được thể hiện trong Hình 2. Khi triển khai phân tích phytosterol trên HPLC với pha động là ACN/đệm phosphate 0,025M (95:5), pH=5,8 [6], tốc độ dòng 1,2ml/phút, chúng tôi thấy với cột C8 ở nhiệt độ 30 0 C ± 1 cho sự phân giải giữa các peak hoạt chất của nhóm phytosterol tốt hơn so với cột C18 trong cùng điều kiện. 46 Hình 2. Sắc ký đồ mẫu stigmasterol (a) và mẫu dịch chiết thuỷ phân trên cột C8, nhiệt độ cột 30 0 C± 1, pha động ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7), pH=4,8, tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiêm 20μl, λmax=195nm. Khi thay đổi tỷ lệ của ACN trong pha động từ 95% đến 93%, sự phân giải của peak stigmasterol so với hai peak hai bên cải thiện rất rõ, tuy nhiên khi hạ tỷ lệ ACN xuống 90%, peak stigmasterol bị dính vào peak ra trước đó. Do vậy, chúng tôi chọn tỷ lệ ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7) là thích hợp nhất để khảo sát pH thích hợp. Khi thay đổi lần lượt các pH 4,8; 5,3; 5,8; 6,5, kết quả phân tích cho thấy khi hạ pH pha động ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7) xuống thì khả năng tách của peak stigmasterol so với các peak hai bên rất cải thiện, tại pH=4,8 cho khả năng tách peak stigmasterol tốt nhất, peak sắc nhọn và đối xứng, các chân peak hầu như không dính vào chân peak trước và sau nó. Khi thay đổi tốc độ dòng từ 1,0; 1,2; 1,5ml/phút trên hệ pha động ACN/đệm phosphat = 93:7, pH 4,8. Kết quả cho thấy tại tốc độ dòng 1ml/phút, chân peak stigmasterol tách rời hoàn toàn khỏi chân peak ra liền trước nó, trong khi với tốc độ dòng lớn hơn (1,2 và 1,5ml/phút), dù thời gian phân tích có ngắn lại, nhưng độ phân giải lại giảm. Cũng qua khảo sát các bước sóng phát hiện trên Detector PAD, chúng tôi nhận thấy tại bước sóng 195nm cho tín hiệu peak là cao nhất, phù hợp với sự phát hiện các hoạt chất nhóm phytosterol. 3.1. Thẩm định phương pháp HPLC - Tính tương thích hệ thống Bảng 1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký Lần đo Thời gian lưu (phút) Hệ số phân giải (1) Số đĩa lý thuyết Hệ số bất đối xứng Diện tích peak 1 14,71 1,57 10712 1,10 10573308 2 14,64 1,55 10701 1,13 10568175 3 14,62 1,56 10671 1,11 10584571 47 4 14,63 1,56 10718 1,09 10581461 5 14,64 1,55 10679 1,10 10582939 6 14,59 1,57 10726 1,09 10578733 Mean 14,64 1,56 10701 1,10 10578198 RSD (%) 0,26 0,57 0,2 1,36 0,06 (1) : hệ số phân giải giữa peak stigmasterol với peak trước nó. Tính tương thích của hệ thống sắc ký được xác định bởi tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trên một mẫu thử, với các điều kiện chạy sắc ký đã chọn ở trên. Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống được trình bày tại Bảng 1. Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là tương thích cho việc phân tích định lượng stigmasterol trong bột dược liệu ráy (RSD ≤ 2%). - Tính đặc hiệu Dựa vào thời gian lưu và hình dáng sắc nhọn, đối xứng của peak stigmasterol thu được khi phân tích mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn (hình 3), kết hợp so sánh phổ UV của peak mẫu thử so với phổ stigmasterol chuẩn thu được khi quét phổ trên detector PDA từ 190 – 400nm (Hình 4) cho thấy peak stigmasterol trong dung dịch thử có thời gian lưu (14.64 phút) và phổ UV tương ứng với peak stigmasterol chuẩn. Phương pháp phân tích sắc ký trên cho tính đặc hiệu cao. Hình 3. Sắc ký đồ mẫu dịch chiết thuỷ phân (a) và dịch chiết thuỷ phân thêm chuẩn (b) Hình 4. Phổ đồ UV mẫu stigmasterol chuẩn (a) và mẫu dịch chiết thuỷ phân (b) 48 - Tính tuyến tính Kết quả sự khảo sát độ tuyến tính của nồng độ dung dịch stigmasterol chuẩn theo diện tích peak thu được tại bước sóng 195nm (Hình 5) cho thấy khoảng nồng độ tuyến tính là (10 - 300ppm), với phương trình hồi quy có dạng y = 46914x + 128511, hệ số R = 0,9995, cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất với diện tích peak đáp ứng. Hình 5. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ stigmasterol (ppm) tương ứng diện tích peak đo được tại 195nm với R = 0,9995 - Độ chính xác Độ chính xác được khảo sát bằng sự lặp lại hàm lượng stigmasterol xác định trên 6 mẫu thử với lượng cân và điều kiện sắc ký đã chọn, kết quả được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Khảo sát độ chính xác của phương pháp Mẫu đo Lượng bột (g) Hàm lượng (%) 1 5,0039 0,0089 2 5,0053 0,0089 3 5,0017 0,0087 4 5,0008 0,0085 5 5,0042 0,0089 6 5,0056 0,0089 Trung bình 5,00358 0,0089 RSD(%) 1,85 Hàm lượng stigmasterol tự do toàn phần có trong thân rễ ráy là 0,009%, phù hợp với các giá trị tham khảo [5], [6] với độ lệch chuẩn tương đối RSD là 1,85%. Phương pháp có độ chính xác tốt. 49 - Độ đúng Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ phục hồi khi thêm một lượng chuẩn chính xác vào 6 mẫu bột ráy, tiến hành phân tích hàm lượng stigmasterol tổng của 6 mẫu dược liệu thêm chuẩn đó với điều kiện chạy sắc ký đã chọn, kết quả được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3. Khảo sát độ đúng của phương pháp Mẫu đo Lượng bột (g) Lượng S (*) chuẩn thêm vào (ppm) Tổng lượng S (*) tìm được (ppm) Độ thu hồi Rev(%) 1 5,0039 50 154 95,4 2 5,0053 50 154 94,9 3 5,0017 50 150 94,8 4 5,0008 50 149 94,7 5 5,0042 50 154 95,7 6 5,0056 50 154 95,3 Trung bình 95,2 RSD(%) 1,63 S (*) : stigmasterol Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng cao (tỷ lệ phục hồi 95,2%) với RSD là 1,63%, phù hợp với yêu cầu chung về đánh giá độ đúng trong phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất trong dược liệu bằng HPLC [7], [8]. - Giới hạn định lượng (LOQ) Nguyên tắc xác định giới hạn định lượng trong HPLC là pha loãng dần dung dịch chuẩn đến nồng độ thấp nhất và tiến hành sắc ký. LOQ được xác định tại nồng độ mà ở đó chiều cao của peak hoạt chất gấp 10 lần so với độ nhiễu đường nền và có độ chính xác được chấp nhận [8]. Kết quả LOQ của stigmasterol là 10ppm. 4. Kết luận Chúng tôi đã xây dựng được quy trình chiết xuất stigmasterol toàn phần (dạng tự do và kết hợp) bằng chiết Soxhlet sau 5h với chloroform, hiệu xuất chiết được kiểm soát bằng phát hiện vết stigmasterol trong dịch chiết thuỷ phân trên TLC với hệ dung môi triển khai là n-hexan/ethyl axetat (8:2), phát hiện bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. Quy trình định lượng stigmasterol trong dịch chiết thuỷ phân được thực hiện bằng HPLC trên cột C8, nhiệt độ cột 30 0 C ± 1, pha động ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7), pH 4,8, tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiêm 20μl, λ max =195nm. Phương pháp phân tích cho tính tương thích hệ thống cao (RSD < 2%) và được đánh giá thẩm định tốt, tính đặc hiệu, độ tuyến tính (10 - 300ppm), độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu với giới hạn phát hiện là 10ppm. Hàm lượng stigmasterol trong bột dược liệu ráy khô là 0,0089%. Do đó, phương pháp này có thể áp dụng để đánh giá chất lượng của cây ráy nói riêng và các dược liệu chứa phytosterol nói chung. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học và TW, 2007. [2]. Bộ Y tế, Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền, Tạp chí Dược học, số 5, (1996), 3. [3]. Lê Ngọc Kính, Nghiên cứu thành phần hoá học của củ ráy ở thành phố Huế, NXB Y học Thực hành, Bộ Y tế, số 521, 2005. [4]. Lê Ngọc Kính, Tác dụng hạ cholesterol trong huyết thanh thỏ của dịch chiết từ thân rễ cây ráy,Tạp chí Dược học, số 374, (2007), 11. [5]. Lê Thị Bích Hiền, Xây dựng quy trình chiết xuất phytosterol từ thân rễ cây ráy (Alocasia Odora Roxb.), Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Y Dược Huế, 2010. [6]. Ellen Odeen Thesis, Investigation of phytosterols in Alocasia Odora Roxb. by reversed phase HPLC, A study made in Hue City, Vietnam, (2009), 23. [7]. World Health Organisation, General guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine, 1998. [8]. Ludwing huber, Validation of Analytical Methods, Review and Strategy, (2001), 13. EFFICIENT EXTRACTION AND DETERMINATION OF FERULIC ACID IN Alocasia Odora (Roxb.) C. Koch BY HPLC Tran Huu Dung College of Medicine and pharmacy, Hue University Dang Thi Ngoc Hoa College of sciences, Hue University SUMMARY A procedure to extract virtually total stigmasterol from Alocasia odora (Roxb.) C. Koch powder on Soxhlet extraction in 5h by chloroform was carried out and controlled by TLC identification with a mobile phase of n-hexan/ethyl acetate (8:2), detected by Liebermann- Burchard reagent. The amount of stigmasterol was determined by a fast and sensitive high performance liquid chromatography (HPLC) assay on a C8 column (300C ± 1) using mobile phase of 93:7 (v/v) acetonitril/phosphate buffer pH 4.8 at mobility of 1ml/min, injection of 20µl with detection at 195nm. The method was validated highly with all RSDs less than 2%. The linearity of stigmasterol concentration is in the range of 10–300 ppm and found to be linear (r = 0,9995). The method proved to be sufficiently precise and accurate with the mean percent recovery of stigmasterol from powder being 95,2%, LOQ of HPLC assay is 10ppm. . TẠP CHÍ KHOA H C, Đại h c Huế, Số 63, 2010 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIGMASTEROL TRONG C Y RÁY (Alocasia odora (Roxb. ) C. Koch) BẰNG S C KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. phương pháp định lượng stigmasterol trong c y ráy bằng s c ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Th c nghiệm nghiên c u 2.1. Xử lý mẫu nghiên c u Thân rễ ráy (Alocasia odora (Roxb. ) thu hái vào tháng. acetate (8: 2) và (e) n-hexan/ethyl acetate (7: 3) Kết quả khảo sát c c dung môi chiết xuất stigmasterol toàn phần trong bột ráy bằng chiết Soxhlet cho thấy sau 3h chiết xuất, dịch chiết CHCl 3