Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương bằng HPLC

Tuy nhiên cho đến nay, mới chỉ có các nghiên cứu định lượng đồng thời hai hoạt chất trên trong chế phẩm[6], [9], [10] mà vẫn chưa có nghiên cứu nào về phương pháp định lượng đồng thời ha

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Nơi thực hiện:

Trung tâm tương đương sinh học -viện kiểm

nghiệm thuốc trung ương

HÀ N ỘI - 2013

L ỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá tương đương sinh h ọc – Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Dược lực – Trường đại học Dược Hà Nội, đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới DS Nguyễn Thị Kim Oanh –

người thầy, người chị đã giúp đỡ, hướng dẫn và truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong thời để tôi hoàn thành khóa luận

Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các thầy cô giáo của trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được trau dồi những kiến thức

và hiểu biết vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng , tôi cảm ơn toàn thể những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Lê Th ị Quế

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 HOẠT CHẤT LORATADINE VÀ PSEUDOEPHEDRIN 2

1.1.1 Hoạt chất Loratadin 2

1.1.1.1 Công thức cấu tạo 2

1.1.1.2 Tính chất lý hóa 2

1.1.1.3 Dược động học 2

1.1.1.4 Tác dụng 3

1.1.1.5 Chỉ định, liều dùng 4

1.1.2.2 Tính chất lý hóa 4

1.1.2.2 Dược động học 5

1.1.2.3 Tác dụng 5

1.1.2.4 Chỉ định ,liều dùng 6

1.1.3 Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin 6

1.2 VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 8

1.2.1 Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ 8

1.2.2 Các bộ phận của máy phân tích khối phổ 9

1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu (inlet) 9

1.2.2.2 Bộ nguồn ion ( Ion source) 9

1.2.2.3 Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube) 10

1.2.2.4 Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense) 10

1.2.2.5.Bộ phận phân tích khối (mass analyze) 10

1.2.2.6 Bộ phận phát hiện (detector) 11

1.2.2.7 Hệ thống bơm chân không (high vacuum system) 11

1.2.3 Ưu nhược điểm của hệ thống 11

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) 11

1.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 12

1.3.1 Độ chọn lọc – độ đặc hiệu 12

1.3.2 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 13

1.3.3 Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính 13

1.3.4 Độ đúng 13

1.3.5.Độ chính xác 13

1.3.6 Hiệu suất chiết 13

1.3.7 Độ ổn định 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ 14

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu 15

2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 17

2.4.2.1 Xây dựng điều kiện khối phổ và chuẩn nội 17

2.4.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 18

2.4.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 18

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 19

2.4.3.1 Độ chọn lọc – đặc hiệu 19

2.4.3.3 Xác định giới hạn định lượng dưới 19

2.4.3.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày 19

2.4.3.5 Hiệu suất chiết 20

2.4.3.6 Độ ổn định 20

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 20

3.1.1 Xác định điều kiện khối phổ và chuẩn nội 21

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 24

3.1.3 Phương pháp xử lý mẫu 26

3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 29

3.2.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc 29

3.2.2 Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính 30

3.2.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 31

3.2.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày 32

3.2.5 Hiệu suất chiết 36

3.2.6 Độ ổn định 38

3.2.7 Bước đầu ứng dụng vào định lượng Loratadin và Pseudoephedrin trên mẫu thực 40

3.3 BÀN LUẬN 42

3.3.1 Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích đồng thời LOR và PES trong huyết tương bằng LC – MS 42

3.3.2 Về xây dựng phương pháp định lượng 43

3.3.3 Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng 45

3.3.4 Về tính khả thi của phương pháp khi ứng dụng trên phân tích mẫu thực 45

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 47

Ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt

Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

PA Hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (Pure Analysis)

DANH M ỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES và IS trong MeOH………… 16

Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR và PES… 16 Bảng 2.3:Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn……… 17

Bảng 2.4 Cách chuẩn bị mẫu QC……… 17

Bảng 3.1: Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp………… 30

Bảng 3.2 Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính……… 31

Bảng 3.3 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới……… 33

Bảng 3.4:Kết quả thẩm định độ đúng , độ chính xác trong ngày của phương pháp với LOR……… 34

Bảng 3.5:Kết quả thẩm định độ đúng , độ chính xác trong ngày của phương pháp với PES……… 34

Bảng 3.6 : Độ đúng, độ chính xác khác ngày với LOR……… 35

Bảng 3.7 : Độ đúng, độ chính xác khác ngày với PES……… 36

Bảng3.8: Hiệu suất chiết của IS……… 37

Bảng 3.9: Hiệu suất chiết của LOR……… 38

Bảng 3.10: Hiệu suất chiết của PES……… 38

Bảng 3.11: Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng………… 40

Bảng 3.12: Độ ổn định của mẫu sau xử lý……… 41

Bảng 3.13 Nồng độ LOR và PES trong các mẫu thực……… 42

DANH M ỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN

Hình 2.1.Các bộ phận của máy phân tích khối phổ………

9 Hình 3.1: Tối ưu Cone Voltage ……… 23 Hình 3.2: Lựa chọn mảnh con và tối ưu hóa thế phân mảnh ……… 24 Hình 3.3 : Sắc ký đồ mẫu chuẩn LOR,PES và IS với điều kiện sắc ký đã xây

dựng……… 27 Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng khi chiết lỏng – lỏng bằng hỗn hợp

dung môi Diethyl ether: Chloroforrm (8:2)……… 28 Hình 3.5: Quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng với hệ dung môi

Diethyl ether: Chloroform (8: 2)……… 29 Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa LOR, PES và IS……… 30 Hình 3.7: Sắc ký đỗ mẫu huyết tương trắng……… 30 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic LOR/IS và

nồng độ LOR trong huyết tương……… 32 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic PES/IS và nồng

độ PES trong huyết tương……… 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 1.5h sau khi uống

thuốc……… 42 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 7h sau khi uống

thuốc……… 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm mũi dị ứng là bệnh thường gặp trong các bệnh lý của đường hô hấp trên

Bệnh phổ biến ở các nước công nghiệp đang phát triển do tình trạng ô nhiễm môi trường, nhất là tại những nước có khí hậu cận nhiệt đới như Việt Nam Đối với bệnh lý trên việc phối kết hợp các hoạt chất mà đặc biệt là việc phối hợp Loratadin – một thuốc kháng Histamin thế hệ hai có tác dụng làm giảm các triệu chứng của viêm mũi dị ứng

và Pseudoephedrin – một thuốc có tác dụng làm giảm xung huyết đã ngày càng trở nên

hữu ích và mang đến hiệu quả điều trị rõ rệt Hiện nay trên thị trường dược phẩm đã có

rất nhiều các sản phẩm bào chế kết hợp hai thành phần hoạt chất trên ở dạng đặc biệt : viên nén giải phóng chậm, viên giải phóng có kiểm soát Việc kết hợp này đã giúp làm đơn giản hóa việc dùng thuốc của bệnh nhân do giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác

dụng bất lợi và do đó làm tăng sinh khả dụng của thuốc

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu bào chế các dạng thuốc viên giải phóng có

kiểm soát hay giải phóng kéo dài chứa đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin[5], [7]

Hiện tại, bộ môn bào chế – trường đại học dược Hà Nội cũng đang nghiên cứu bào chế viên giải phóng có kiểm soát với tên Clarinase - VN Tuy nhiên cho đến nay, mới chỉ

có các nghiên cứu định lượng đồng thời hai hoạt chất trên trong chế phẩm[6], [9], [10]

mà vẫn chưa có nghiên cứu nào về phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất trên trong dịch sinh học bằng cách sử dụng các phương pháp có độ nhậy và chính xác cao như LC, GC, LC-MS Để đóng góp một phương pháp phân tích có đủ độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác ứng dụng phục vụ cho công tác nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của các dạng thuốc chứa Loratadin và Pseudoephedrin, chúng tôi

tiến hành đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Loratdin và Pseudoephedrin trong huy ết tương bằng LC-MS” với các mục tiêu

sau:

1 Kh ảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích đồng thời Loratdin và Pseudoephedrin

2 Th ẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng được theo quy định của FDA –

 Độ tan : Thực tế không tan trong nước, tan trong các dung môi aceton,

chloroform, methanol, toluen ở bất kỳ tỷ lệ nào

1.1.1 3 Dược động học [1], [3],[12], [18]

 Hấp thu

 Loratadin hấp thu nhanh sau khi uống Với liều uống 10mg, nồng độ đỉnh

trong huyết tương trung bình của Loratadin và chất chuyển hóa có hoạt tính của nó

(descarboethoxyloratadin) tương ứng là 4 ng/ml và 4,7 ng/ml đạt được sau 1,5 và

3,7 giờ

 Sau khi uống loratadin, tác dụng kháng histamin của thuốc xuất hiện trong

vòng 1 - 4 giờ, đạt tối đa sau 8 - 12 giờ, và kéo dài hơn 24 giờ Nồng độ của

Loratadin và Descarboethoxyloratadin đạt trạng thái ổn định ở phần lớn người bệnh vào khoảng ngày thứ năm dùng thuốc

 Nồng độ thuốc trong huyết tương dao động từ 2,5 – 100 ng/ml (với liều đơn 10mg)

 Phân bố

 97%- 99% loratadin và 73-77% chất chuyển hóa liên kết với protein huyết tương

 Thể tích phân bố của thuốc là 80 - 120 lít/kg

 Thuốc không qua được hàng rào máu não nhưng vào được sữa mẹ

 Chuyển hóa

 Loratadin chuyển hóa nhiều khi qua gan lần đầu bởi hệ enzym microsom cytocrom P450; Loratadin chủ yếu chuyển hóa thành Descarboethoxyloratadin, là chất chuyển hóa có tác dụng dược lý

 Ðộ thanh thải của thuốc là 57 - 142 ml/phút/kg

1.1.1.4 T ác dụng [1], [3],[12], [18]

 Loratadin là thuốc kháng histamin 3 vòng có tác dụng kéo dài đối kháng chọn lọc trên thụ thể H1 ngoại biên và không có tác dụng làm dịu trên thần kinh trung ương

 Loratadin thuộc nhóm thuốc đối kháng thụ thể H1 thế hệ thứ hai (không an thần)

 Loratadin có tác dụng làm nhẹ bớt triệu chứng của viêm mũi và viêm kết mạc dị ứng do giải phóng histamin Loratadin còn có tác dụng chống ngứa và nổi mày đay liên quan đến histamin

 Có thể kết hợp Loratadin với Pseudoephedrin để làm nhẹ bớt triệu chứng ngạt mũi trong điều trị viêm mũi dị ứng có kèm ngạt mũi

Người lớn, người cao tuổi và trẻ em từ 12 tuổi trở lên:

Dùng một viên nén 10 mg Loratadin hoặc 10 ml (1 mg/ml) siro Loratadin, dùng một lần/ngày hoặc dùng một viên nén Claritin - D (Loratadin 10 mg với Pseudoephedrin sulfat 240 mg)

 Lý tính :

 Dạng bột hoặc tinh thể màu trắng

 Nhiệt độ nóng chảy :117ºC – 118 ºC ( dạng muối sulfat 174- 179 ºC)

 Độ tan : 7mg/L, dạng muối tan tự do trong nước và Ethanol

1.1.2.2 Dược động học [7], [12], [18], [21]

 Hấp thu

Hấp thu dễ dàng và hầu như hoàn toàn từ đường tiêu hóa Liều uống 60-120mg psedoephedrin.HCl đạt Cmax trong huyết tương 180-300ng/ml hoặc 397ng/ml – 422ng/ml tương ứng đạt được trong khoảng thời gian 1,39 – 2h hoặc 1,84 – 1,97h

Hấp thu từ dạng giải phóng có kiểm soát chậm hơn Thức ăn làm chậm quá trình

hấp thu, dạng giải phóng có kiểm soát không bị ảnh hưởng

 Phân bố

Thể tích phân bố ở trạng thái ổn định 2,4 – 2,6 L/kg (với liều 30 – 60mg uống ở

trẻ em 6 – 12 tuổi), Pseudoephedrin được cho là có khả năng đi qua nhau thai Nó

có khả năng vào sữa mẹ (khoảng 0,5% liều uống sau 24h)

 Chuyển hóa

Chuyển hóa không hoàn toàn (<1%) ở gan bằng phản ứng khử Methyl cho chất chuyển hóa không hoạt tính

 Thải trừ

Thuốc và chất chuyển hóa (khoảng 55-96%) được bài tiết qua nước tiểu với tốc

độ không đổi pH nước tiểu ảnh hưởng tới thải trừ, nhanh khi có tính acid và chậm khi có tính kiềm Với pH 5, thời gian bán thải là 3- 6h, với pH 8 là 9- 16h

1.1.2.3 Tác d ụng [7], [12], [18], [21]

Pseudoephedrin là thuốc cường giao cảm chiết xuất từ cây thuộc chi ma hoàng Tác động trực tiếp lên thụ thể α adrenergic và β adrenergic (ở mức độ yếu hơn) Và tương tự Ephedrin, nó cũng tác động gián tiếp bằng cách giải phóng Norephedrine Pseudoephedrin tác động trực tiếp lên thụ thể α adrenergic làm co mạch niêm mạc mũi, kết quả là làm giảm tiết dịch nhày mũi, giảm xung huyết, phù nề và nghẹt mũi Tác động giao cảm của Pseudoephedrin cũng có thể xảy ra ở các đường khác

của đường hô hấp (ví dụ ống Eustachian) Pseudoephedrin cũng làm giãn cơ trơn

Liều dùng thông thường của pseudoephedrine cho người lớn và trẻ em từ 12 tuổi

trở lên là 60 mg mỗi 4 - 6 giờ với tối đa 240 mg mỗi ngày

Với dạng giải phóng kéo dài dùng liều 120 mg mỗi 12h hoặc 240 mg cho 24h (dạng viên lõi 180 mg và 60 mg giải phóng ngay bao ngoài)

 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào định lượng đồng thời LOR và PES trong dịch sinh học, tuy nhiên đã có một số nghiên cứu định lượng hai hoạt

chất trên trong chế phẩm:

 Tác giả Lê Thị Thu Hiền, Bùi Thu Huê, Đoàn Cao Sơn đã nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin hydroclorid trong thuốc viên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy khoảng nồng độ tuyến tính của LOR là 10 - 50 µg/mL (r = 0,9998), của PES là 120- 1800 µg/mL (r =

0,9990); độ đúng của phương pháp cho LOR và PES lần lượt là 100,4% và 99,5% với giá trị RSD tương ứng là 0,72% và 0,77% [6]

 Tác giả Nguyễn Minh Trí và Nguyễn Mã Huy Thanh đã định lượng đồng thời hai hoạt chất Loratadin và Pseudoephedrin sulfat trong chế phẩm viên nén bằng phương pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm Kết quả cho khoảng tuyến tính 0,015 – 0,035 mg/mL với LOR và 0,025 – 0,84 mg/mL với PES, độ đúng và độ chính xác tương ứng cho hai chất lần lượt là 99,46% (RSD = 0,72%) và 100,6% (RSD = 0,58%) [10]

 Tác giả Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Hải Bình, Lê Thị Ngọc Điệp, Nguyễn Thanh Hải cũng đã nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin

bằng phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất Kết quả cho thấy đây là phương pháp đơn giản, có độ chính xác đạt yêu cầu, tiến hành nhanh và tiết kiệm thời gian

có thể sử dụng định lượng nhanh hàm lượng PES và LOR trong các chế phẩm bào

chế kết hợp bằng các máy đo quang thông dụng [9]

 Các nghiên cứu nước ngoài

 Các nghiên c ứu định lượng đồng thời LOR và PES trong dịch sinh học:

 Nghiên cứu “xác định đồng thời Loratadin và Pseudoephedrine sulfat trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - kỹ thuật phun điện tử”

do các nhà hoa học thuộc đại học dược Trung Quốc tiến hành đánh giá sinh khả

dụng của Loratadin và Pseudoephedrin từ viên giải phóng có kiểm soát

Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lượng gồm :

- Chiết hoạt chất từ huyết tương người bằng ethyl ether

- Cột sắc ký : ODS Shimazu (5µm ; 2,1 x 150mm)

- Pha động : Acetnitril- nước (80:20) chứa 0,1% acid acetic băng

- Tốc độ dòng : 0,2mL/phút

- Thể tích bơm mẫu : 5µL

- Chuẩn nội : diazepam cho LOR và phenylpropanolamin cho PES

- Kiểu khối phổ : MS/MS, nguồn ion hóa HESI(+)

- Kết quả : Khoảng nồng độ tuyến tính : 5 - 1000 ng/mL với PES và 0,05 – 10 ng/mL với LOR Giới hạn định lượng : 10 pg/mL với LOR và 50 pg/mL với

PES [16]

 Các nghiên c ứu định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc:

 Một nghiên cứu taị đại học Dược hoàng gia Malaysia đã định lượng đồng

thời Loratadin và Pseudoephedrine hydrochlorid trong chế phẩm viên nén bằng phương pháp HPLC detector UV- VIS

Các điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký : Luna (5µm; 4,6 x 150mm)

- Pha động : Dung dịch amonium dihydro orthophosphat 30mM : acetonitrile (4:6, tt/tt)

- Tốc độ dòng: 1mL/phút.Thể tích tiêmm mẫu: 20 µL Bước sóng phát hiện: 265nm

- Kết quả: Khoảng nồng độ tuyến tính: 5 - 200 µg/mL với PES và 0,25 – 10 µg/mL với LOR) [14]

 Tại Ấn Độ, các nhà khoa học đã đồng thời tiến hành nhiều phương pháp khác nhau để định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc

- Thứ nhất là phương pháp đo quang ở nhiều bước sóng, với 2 bước sóng cực đại là 257 và 283nm

- Thứ hai là phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất, đo độ hấp thụ tại hai bước sóng là 308,6 và 263 nm

- Thứ ba là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng :

+Cột sắc ký : ODS (5µm; 4,6 x 150mm)

+ Pha động : dd amoni acetat (3,85g/l): Methanol (20:80) pH 7,5

+ Chuẩn nội : nimesulid

Kết quả: Phương pháp thứ nhất cho kết quả khá nhanh, ở phương pháp thứ hai

đã loại bỏ hoàn toàn được ảnh hưởng của các thành phân tá dược và tạp khác, phương pháp thứ ba khá nhanh (thời gian phân tích một mẫu khoảng 15 phút), cho

kết quả chính xác [15]

Khối phổ ( masspectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, sau đó được gia tốc và tách riêng

nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Quá trình này diễn ra trong thiết

bị chân không với áp suất của hệ dao động trong khoảng 10-8

– 10-6 Pa Tín hiệu

tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành khối phổ

Hình 2.1.Các b ộ phận của máy phân tích khối phổ

1.2.2.1 B ộ phận nạp mẫu (Inlet)

Có vai trò nạp mẫu vào máy, ở đây mẫu được nạp gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu

ra của bộ phận sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ

1.2.2.2 B ộ nguồn ion ( Ion source)

Vai trò là ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi

Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau, hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa

bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI)

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI :

Các phân tử chất phân tích cùng dòng pha động sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được đưa vào một ống mao quản cao thế 2-5 KV và phun vào nguồn ion hóa dưới dạng sương mù Do tác động của điện thế cao mà bề mặt các hạt sương mù được tạo thành bị nhiễm điện, đồng thời dưới tác động của luồng khí nitơ nóng, xảy ra hiện tượng bay hơi dung môi làm cho các hạt sương mù bé dần cho đến khi bị phân tách

và giải phóng các ion mang điện Phần lớn các tiểu phân dung môi, tiểu phân không mang điện hoặc mang điện trái dấu với ion chất phân tích sẽ bị bơm hút ra ngoài Ion chất phân tích và một phần các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ đi vào bộ phận

vận chuyển ion nhờ chênh lệch áp suất

1.2.2.3 B ộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube)

Bộ phận vận chuyển ion có cấu tạo như một ống thép chịu nhiệt, tại đây các ion dung môi còn sót lại sẽ tiếp tục bị bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao

1.2.2.4 B ộ phận thấu kính hội tụ (tube lense)

Cấu tạo gồm hai thanh kim loại ghép với nhau thành một cặp điện cực Khi áp điện thế vào, các ion phân tích và các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ được tập trung lại thành dòng ion di chuyển với tốc độ cao vào trong bộ phận phân tích khối

1.2.2.5.B ộ phận phân tích khối (mass analyze)

Có nhiệm vụ tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của điện từ trường để đi tới detector

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng bộ phân tích tứ cực chập ba (Triplequadrupoles analyser)

Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau, các tứ cực được cấu tạo bởi

bốn thanh kim loại ghép với nhau tạo thành hai cặp điện cực, trong đó Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích

- Tại Q1: Tách các ion, lựa chọn ion chất phân tích ( ion mẹ - parent ion) để đi vào Q2

- Tại Q2: Với áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm với các phân tử khí trơ có mặt như nitơ, heli, argon đã được cung cấp động năng Nhờ va chạm này, năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng của chúng, phân mảnh tạo

ra các ion con Các mảnh ion con được tạo thành có số khối khác nhau sẽ tiếp tục đi vào Q3

- Tại Q3: Hệ thống điều chỉnh để ưu tiên cho loại ion con đặc trưng của chất phân tích đi qua và di chuyển đến detector

Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần – MS/MS (nhận diện chất phân tích thông qua số khối của ion mẹ và mảnh ion con)

1.2.2.6 B ộ phận phát hiện (detector)

Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến từ bộ phận phân tích khối thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

1.2.2.7 H ệ thống bơm chân không (high vacuum system)

Hệ thống bơm chân không hoạt động nhằm duy trì môi trường chân không ở nguồn ion hóa và toàn bộ hệ thống phân tích khối Áp suất bên trong hệ thống duy trì trong khoảng 10-8 – 10-6 Pa

 Ưu điểm

Kỹ thuật LC- MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, có thể dùng để phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp Do đó kỹ thuật này ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch sinh học cho các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học

 Nhược điểm

Đòi hỏi hóa chất có độ tinh khiết cao, dụng cụ đảm bảo sạch Thiết bị có cấu tạo

phức tạp, giá thành cao Người sử dụng máy có trình độ chuyên môn cao

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) [17], [22], [23]

UPLC là phương pháp được phát triển từ HPLC, nguyên tắc hoạt động và các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký của UPLC hoàn toàn tương tự với HPLC, tuy nhiên UPLC có cải tiến về phần cứng cũng như về phần hóa học để tăng về hiệu năng thiết bị Máy UPLC thực chất là một máy sắc ký lỏng chạy tại áp suất siêu cao (từ 9000 psi đến 15000 psi), sử dụng cột sắc ký đường kính nhỏ (thông thường

< 2,1 mm); kích thước tiểu phân pha tĩnh nhỏ (<2,2 µm), số đĩa lý thuyết lớn, chiều cao đĩa lý thuyết nhỏ Ngoài ra phần cứng liên quan như phần bơm mẫu, phần thu

nhận dữ liệu (detetor) và xử lý số liệu cũng được cải tiến để đồng bộ trong toàn hệ

thống UPLC có khả năng đồng thời tăng tốc độ phân tích (lên khoảng 9 lần), tăng

độ nhạy (lên khoảng 2 lần) và độ phân giải (lên khoảng 3 lần) so với khi phân tích

trên HPLC Hiện nay trên thế giới đang coi UPLC là đỉnh cao của thiết bị LC và là đầu vào tiêu chuẩn của hệ thống khối phổ

So với HPLC, UPLC có một số ưu điểm sau:

- Tốc độ phân tích nhanh;

- Kết quả phân tích đáng tin cậy hơn do độ nhạy và độ phân giải tốt hơn;

- Tiêu tốn ít dung môi hơn;

- Chi phí nhân công ít hơn;

Độ chọn lọc- đặc hiệu là khả năng phân biệt các chất có trong mẫu thử khi tách

và định lượng hai thành phần trở lên trong một hỗn hợp chất.Theo FDA, phương pháp phân tích được coi là chọn lọc – đặc hiệu đối với chất phân tích (CP) và chuẩn

nội (IS) khi trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (có nồng độ chất CP tương ứng với nồng

độ thấp nhất của đường chuẩn ), các pic của CP và IS phải được nhận diện rõ ràng

và có hình dạng cân đối Ngoài ra còn yêu cầu đáp ứng pic của mẫu trắng so với

mẫu chuẩn tại thời gian lưu của CP không vượt quá 20%, tại thời gian lưu của IS không vượt quá 5%

1.3.2 Gi ới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Theo quy định của FDA, mẫu chuẩn có nồng độ CP tương ứng với nồng độ thấp

nhất của đường chuẩn được coi là LLOQ khi pic của CP được nhận diện rõ ràng, hình dạng cân đối và có đáp ứng ít nhất bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại thời gian lưu của CP, độ đúng đạt 80 -120% so với nồng độ thực và độ chính xác có giá

trị RSD ≤ 20%

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ CP trong đó có sự tương quan tuyến tính

giữa nồng độ CP và tỷ lệ đáp ứng pic CP/IS

Theo FDA, đường chuẩn phải bao gồm 6 - 8 điểm bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính, hệ số tương quan lớn hơn 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao

gồm cả điểm có nồng độ thấp nhất và điểm có nồng độ cao nhất phải có độ đúng

nằm trong khoảng từ 85% đến 115% với giá trị RSD ≤ 15%, riêng điểm thấp nhất

của đường chuẩn cho phép có độ đúng nằm trong khoảng từ 80% đến 120% với giá

trị RSD ≤ 20%

1.3 4 Độ đúng

Độ đúng là chỉ tiêu phản ánh sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực

hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận

Độ đúng được tính bằng phần trăm giữa giá trị thu được và giá trị thực.Độ đúng

phải đạt từ 85% đến 115%

1.3 5.Độ chính xác

Độ chính xác là chỉ tiêu phản ánh mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép

đo từ nhiều lần lấy mẫu phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ

Độ chính xác được thể hiện ở giá trị RSD, yêu cầu RSD phải không lớn hơn 15%

1.3.6 Hi ệu suất chiết

Hiệu suất chiết là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của CP và IS sau quá trình chiết tách xử lý mẫu

Theo FDA, hiệu suất chiết của CP và IS không được quá cao ( dưới 110%), không quá thấp (trên 30%) và ổn định (hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ không được khác nhau quá 15%)

1.3.7 Độ ổn định

Theo FDA, các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện phân tích nếu giá trị nồng

độ của mẫu ổn định sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và các giá trị RSD giữa các lần phân tích không quá 15%

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Chất chuẩn

Loratadin – chuẩn phòng thí nghiệm, hàm lượng 99,24%, độ ẩm 0,02%

Pseudoephedrin – chuẩn phòng thí nghiệm, hàm lượng 100%, độ ẩm 0,01%

 Chất chuẩn nội:

Diazepam – chuẩn phòng thí nghiệm;

Domperidol – chuẩn phòng thí nghiệm

 Dung môi, hóa chất:

Methanol (MeOH), Acetonitril (MeCN ) – Merk, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC/MS

Các dung môi hóa chất khác như : Cloroform, Diethylether, Dicloromethan, các dd: Amoni acetat, Acid acetic, Acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích (p.a)

 Huyết tương trắng : được lấy từ chó khỏe mạnh và chưa dùng thuốc

 Thiết bị dụng cụ:

Tất cả các thiết bị dụng cụ đều được chuẩn hóa theo quy định ISO/ IEC 17025

-2005

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters Xevo TQD – Waters (Mỹ);

- Cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1mg) – Sartorious (Đức);

- Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K – Sartorious (Đức);

- Thiết bị bay hơi dung môi Reatic – Thermo III – Thermo scientific (Mỹ);

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP-236 – Velp (Ý);

- Micropipet Eppendorf loại 10- 100, 100- 1000µL – Eppendorf (Đức);

- Bình định mức, pipet thủy tinh classA , Prolabo – Pháp

 Trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

 Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương trắng của chó không có LOR và PES

 Mẫu tự tạo: là các mẫu huyết tương trắng của chó có LOR và PES ở nồng độ thích hợp

 Trong ứng dụng định lượng trên mẫu thực:

 Viên Clarinase ® tablet (Shering – Plough Labo N.V);

 Mẫu thử: là các mẫu huyết tương chó sau khi cho uống viên Clarinase

 Súc vật: Chó khỏe mạnh, giống đực, cân nặng 9-10kg, được chăm sóc và lấy máu tại bộ môn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội

 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR và PES bằng kỹ thuật MS/MS: Lựa chọn phương pháp chiết tách LOR và PES từ huyết tương chó, lựa

LC-chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội và điều kiện khối phổ

 Thẩm định phương pháp phân tích : Thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu -

chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng – độ chính xác,hiệu suất chiết, độ ổn định

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Chuẩn bị các mẫu chuẩn

 Chuẩn bị các mẫu chuẩn LOR, PES và IS trong MeOH theo bảng sau:

Dung dịch Thành phần( pha loãng theo

tỷ lệ thích hợp)

Nồng độ chính xác khoảng

Chuẩn gốc LOR(dd A) LOR cân+ MeOH 250 µg/mL

Chuẩn gốc PES(dd B) PES cân + MeOH 250 µg/mL

Chuẩn gốc IS (dd C) DOM cân+ MeOH 250 µg/mL

Chuẩn trung gian (ddA1) dd A+ MeOH 1 µg/mL

Chuẩn trung gian (dd B1) dd B+MeOH 20 µg/mL

Chuẩn IS làm việc dd C + MeOH 125 ng/mL

Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa LOR và PES chuẩn theo bảng sau:

Dung dịch Thành phần Nồng độ chính xác khoảng

Chuẩn làm việc CC1 0,5 mL dd A1+0,5 mL dd

B1+ huyết tương trắng vừa

Từ các chuẩn làm việc CC1 và CC2 , chuẩn bị dãy mẫu chuẩn như sau:

 Chuẩn bị các mẫu kiểm tra (QC)

Chuẩn bị các mẫu QC tự tạo trong huyết tương tương tự như các mẫu chuẩn trên

để có được dd C1 nồng độ LOR chính xác khoảng 50 ng/mL, PES khoảng 1000 ng/mL và dd C2 nồng độ LOR 5 ng/mL, PES 100ng/mL Từ đây chuẩn bị các mẫu

Thể tích dd C1 (µL)

Thể tích dd C2 (µL)

Thể tích huyết tương trắng (µL)

Sử dụng hệ thống LC/MS loại Triple Quandrupole với nguồn ion hóa kiểu HESI, tiến hành thực nghiệm theo các nội dung sau:

2.4.2.1 Xây d ựng điều kiện khối phổ và chuẩn nội

 Xây dựng điều kiện khối phổ:

- Xác định ion mẹ đặc trưng đối với LOR và PES

- Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất;

- Xác định mảnh ion con của LOR và PES có cường độ tín hiệu cao và ổn định;

- Tối ưu điều kiện phân mảnh ion mẹ thành ion con để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất

 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội :

Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của chất phân tích tiến hành khảo sát trên Diazepam và Domperidol để lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp Chuẩn

nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có hiệu suất chiết gần tương đương với

chất phân tích

2.4.2.2 Kh ảo sát điều kiện sắc ký

Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của LOR, PES, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký

- Trên cột Acquity UPLC ® BEH C18 (kích thước 50 x 2,1 mm; 1,7 µm);

- Trên các pha động gồm MeCN phối hợp dd amoni acetat hoặc dd acid acetic, MeCN phối hợp dd acid formic theo các tỷ lệ với nồng độ dd acid formic khác nhau;

- Khảo sát với các giá trị tốc độ dòng thay đổi từ 100- 500 µL/phút

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng đồng thời LOR và PES trong huyết tương trên hệ thống UPLC- MS/MS

2.4.2.3 Kh ảo sát quy trình xử lý mẫu

Dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương, tính chất lý hóa

của chất chuẩn và chuẩn nội cùng với điều kiện thực tế, tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu:

 Tủa protein với tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ MeOH và MeCN Chiết lỏng – lỏng sử dụng các dung môi Dicloromethan, Diethyl ether, Cloroform

và hỗn hợp dung môi Diethyl ether – Cloroform được kiềm hóa và không kiềm hóa

bằng dd Amoniac 0,1M

 Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, tiến hành nhanh, kinh tế và vẫn đảm bảo chiết tách được LOR, PES và IS với tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu và ổn định

2.4.3 Th ẩm định phương pháp phân tích

2.4.3.1 Độ chọn lọc – đặc hiệu

Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa LOR

và PES ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ) Ghi lại

sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu

của LOR, PES và IS

2.4.3.3 Xác định giới hạn định lượng dưới

Tiến hành phân tích 06 mẫu trắng, 06 mẫu chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ LOR: 0,5 ng/mL, PES: 10 ng/mL) Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ

lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn, tính nồng độ LOR và PES có trong mẫu

dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày Tính độ đúng của các mẫu chuẩn

bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ

thực

2.4.3.2 Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính

Tiến hành chuẩn bị và phân tích 8 mẫu chuẩn của LOR và PES trong huyết tương có nồng độ bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính dự kiến (các mẫu S1- S8) Ghi

lại sắc đồ và tỷ lệ đáp ứng pic LOR/IS, PES/IS tại các nồng độ tương ứng, xác định tương quan giữa tỷ lệ đáp ứng pic và nồng độ LOR, PES có trong mẫu; xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r Từ phương trình hồi quy đã xây dựng tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng của mỗi nồng độ

2.4.3 4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

 Độ đúng, độ chính xác trong ngày

Tiến hành phân tích trong cùng một ngày trên 03 lô mẫu LQC, MQC, HQC Mỗi lô

mẫu gồm 06 mẫu độc lập, tính toán nồng độ tìm lại của các mẫu QC theo đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ % giữa

nồng độ định lượng được so với nồng độ thực trong mẫu Độ chính xác được biểu

thị bằng giá trị RSD giữa nồng độ định lượng được của các lần phân tích trên cùng

lô mẫu

 Độ đúng, độ chính xác khác ngày

Tiến hành tương tự độ đúng độ chính xác trong ngày, tính RSD của các kết quả định lượng được của mỗi nồng độ trong ít nhất 02 ngày khác nhau

2.4.3.5 Hi ệu suất chiết

Tiến hành phân tích các lô mẫu LQC, MQC, HQC Mỗi lô mẫu gồm ít nhất 05

mẫu độc lập cùng nồng độ Song song tiến hành định lượng các mẫu chuẩn pha trong pha động, không qua xử lý chiết tách, có nồng độ tương ứng với các mẫu QC

đã qua xử lý chiết tách

Xác định tỷ lệ thu hồi của LOR, PES và IS bằng cách so sánh đáp ứng pic của

mẫu QC đã qua chiết tách với các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua chiết tách

2.4.3 6 Độ ổn định

 Độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

Tiến hành phân tích các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô mẫu gồm

06 mẫu độc lập So sánh nồng độ tìm lại của mẫu được xử lý và phân tích ngay sau khi rã đông với mẫu tương ứng được xử lý và phân tích sau khoảng thời gian nhất định (6h) ở nhiệt độ phòng

 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (độ ổn định trong auto sampler)

Chuẩn bị các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô mẫu gồm 06 mẫu độc

lập, tiến hành chiết tách và bảo quản các mẫu sau khi chuẩn bị trong auto sampler trong khoảng thời gian nhất định Tiến hành phân tích và so sánh nồng độ LOR, PES trong các mẫu được phân tích ngay sau khi chiết tách với nồng độ của cùng các

mẫu đó sau khi bảo quản trong auto sampler

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.1 Xác định điều kiện khối phổ và chuẩn nội

 Xác định điều kiện khối phổ

Pha dung dịch chuẩn LOR và PES với nồng độ 1µg/mL trong MeOH Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa cùng với dòng pha động sắc ký qua bộ trộn hình chữ T Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ một lần và quét toàn phổ để tìm ion có cường độ tín hiệu cao nhất, tương ứng chính là ion mẹ

của chất phân tích từ đó xác định được mảnh ion mẹ của LOR: 383,17; PES: 166,04; DOM: 426,17

Sau khi xác định được ion mẹ, tiến hành điều chỉnh để tối ưu điều kiện nguồn ion hóa mà quan trọng nhất là hai thông sốhiệu điện thế mao quản (capillary voltage)

và hiệu điện thế cone (cone voltage ) để cường độ ion mẹ lớn và ổn định nhất Kết

quả đã lựa chọn được giá trị tối ưu là: capillary voltage: 4,0KV ; cone voltage: 46V (với LOR), 20V (với PES) và 54V (với DOM)

Cone Voltage Optimization (m/z 383.17) (A)

(B)

Cone Voltage Optimization (m/z 426.17) (C)

Hình 3.1: T ối ưu Cone Voltage cho : (A) - Loratadin; (B) - Pseudoephedrin; (C) -

Domperidol

Để chọn được mảnh ion con phù hợp cho chất phân tích, khi thực hiện kỹ thuật phân tích khối phổ hai lần, chúng tôi đã thay đổi các mức thế phân mảnh khác nhau

từ 2- 80V từ đó tìm được mảnh ion con có cường độ tín hiệu cao và ổn định nhất

với mức thế phân mảnh tương ứng Kết quả với PES, ở mức thế phân mảnh 18V cho mảnh ion con m/z = 117,06 với cường độ tín hiệu lớn và ổn định nhất, với LOR giá trị này là 28 V tương ứng ion con m/z = 259,17 và với DOM là 28V, ion con m/z = 175,08

(A)

(B)

(C)

Hình 3.2: L ựa chọn mảnh con và tối ưu hóa thế phân mảnh cho: (A) - Loratadin;

(B)- Pseudoephedrin; (C) – Domperidom

Sau khi đã xác định được các điều kiện ở bộ phận nạp mẫu và ion hóa để có

được dòng ion phân mảnh lớn và ổn định, sử dụng tiếp chế độ Automatic Tune để máy tự điều chỉnh các thông số còn lại trong thiết bị

 Lựa chọn chuẩn nội

Tuy cấu trúc, tính chất và nồng độ trong chế phẩm của hai chất phân tích (LOR

và PES) khác nhau khá nhiều nhưng để quá trình phân tích đơn giản hơn, chúng tôi quyết định sẽ lựa chọn một chất làm chuẩn nội chung cho cả LOR và PES Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát hai chất chuẩn nội là Diazepam (DP) và Domperidol (DOM)

Khi sử dụng các mức thế phân mảnh khác nhau, cả DP và DOM đều tạo ra các

mảnh phổ con bền vững, ổn định Tuy nhiên ở cùng nồng độ 500 ng/ml, cường độ