Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh DS Nguyễn Thị Kim Oanh Nơi thực hiện: Trung tâm tương đương sinh học -viện kiểm nghiệm thuốc trung ương HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – người thầy tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực – Trường đại học Dược Hà Nội, nhiệt tình bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Nguyễn Thị Kim Oanh – người thầy, người chị giúp đỡ, hướng dẫn truyền cho kinh nghiệm quý báu thời để tơi hồn thành khóa luận Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho trau dồi kiến thức hiểu biết vô quý giá suốt q trình học tập trường Cuối , tơi cảm ơn tồn thể người thân gia đình, bạn bè giúp đỡ, động viên q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2013 Lê Thị Quế Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 HOẠT CHẤT LORATADINE VÀ PSEUDOEPHEDRIN 1.1.1 Hoạt chất Loratadin 1.1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.1.3 Dược động học 1.1.1.4 Tác dụng 1.1.1.5 Chỉ định, liều dùng 1.1.2.2 Tính chất lý hóa 1.1.2.2 Dược động học 1.1.2.3 Tác dụng 1.1.2.4 Chỉ định ,liều dùng 1.1.3 Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin Pseudoephedrin 1.2 VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 1.2.1 Nguyên tắc hoạt động máy phân tích khối phổ 1.2.2 Các phận máy phân tích khối phổ 1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu (inlet) 1.2.2.2 Bộ nguồn ion ( Ion source) 1.2.2.3 Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube) 10 1.2.2.4 Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense) 10 1.2.2.5.Bộ phận phân tích khối (mass analyze) 10 1.2.2.6 Bộ phận phát (detector) 11 1.2.2.7 Hệ thống bơm chân không (high vacuum system) 11 1.2.3 Ưu nhược điểm hệ thống 11 1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) 11 1.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 12 1.3.1 Độ chọn lọc – độ đặc hiệu .12 1.3.2 Giới hạn định lượng (LLOQ) 13 1.3.3 Đường chuẩn khoảng nồng độ tuyến tính 13 1.3.4 Độ .13 1.3.5.Độ xác 13 1.3.6 Hiệu suất chiết .13 1.3.7 Độ ổn định 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ 14 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .15 2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu 15 2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 17 2.4.2.1 Xây dựng điều kiện khối phổ chuẩn nội 17 2.4.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 18 2.4.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 18 2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 19 2.4.3.1 Độ chọn lọc – đặc hiệu 19 2.4.3.3 Xác định giới hạn định lượng 19 2.4.3.4 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 19 2.4.3.5 Hiệu suất chiết 20 2.4.3.6 Độ ổn định 20 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG .20 3.1.1 Xác định điều kiện khối phổ chuẩn nội 21 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 24 3.1.3 Phương pháp xử lý mẫu 26 3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 29 3.2.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc 29 3.2.2 Đường chuẩn khoảng nồng độ tuyến tính 30 3.2.3 Giới hạn định lượng (LLOQ) 31 3.2.4 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 32 3.2.5 Hiệu suất chiết .36 3.2.6 Độ ổn định 38 3.2.7 Bước đầu ứng dụng vào định lượng Loratadin Pseudoephedrin mẫu thực 40 3.3 BÀN LUẬN .42 3.3.1 Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích đồng thời LOR PES huyết tương LC – MS 42 3.3.2 Về xây dựng phương pháp định lượng 43 3.3.3 Về thẩm định phương pháp định lượng xây dựng 45 3.3.4 Về tính khả thi phương pháp ứng dụng phân tích mẫu thực 45 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chất phân tích Nồng độ thực Nồng độ đỉnh Dung dịch Dược động học Ethanol Cơ quan quản lý thực dược phẩm Mỹ Chất chuẩn nội Loratadin Giới hạn định lượng Acetonitril Methanol Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình Khối lượng/ điện tích Ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Mẫu kiểm tra nồng độ cao HQC LC- MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Mẫu kiểm tra nồng độ thấp LQC CP Cthực Cmax DD DĐH EtOH FDA IS LOR LLOQ MeCN MeOH MQC m/z HESI HPLC PA PES QC r RSD% SKĐ STT TB TLTK Tmax tR Hóa chất tinh khiết dùng phân tích (Pure Analysis) Pseudoephedrin Mẫu kiểm tra Hệ số tương quan Độ lệch chuẩn tương đối Sắc ký đồ Số thứ tự Trung bình Tài liệu tham khảo Thời gian đạt nồng độ đỉnh Thời gian lưu Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN Tên Bảng Trang Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES IS MeOH………… 16 Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR PES… 16 Bảng 2.3:Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn…………………………… 17 Bảng 2.4 Cách chuẩn bị mẫu QC…………………………………… 17 Bảng 3.1: Kết độ chọn lọc – đặc hiệu phương pháp………… 30 Bảng 3.2 Kết xác định khoảng nồng độ tuyến tính……………… 31 Bảng 3.3 Kết xác định giới hạn định lượng dưới………………… 33 Bảng 3.4:Kết thẩm định độ , độ xác ngày phương pháp với LOR……………………………………………………… 34 Bảng 3.5:Kết thẩm định độ , độ xác ngày phương pháp với PES……………………………………………………………… 34 Bảng 3.6 : Độ đúng, độ xác khác ngày với LOR………………… 35 Bảng 3.7 : Độ đúng, độ xác khác ngày với PES…………………… 36 Bảng3.8: Hiệu suất chiết IS……………………………………………… 37 Bảng 3.9: Hiệu suất chiết LOR………………………………………… 38 Bảng 3.10: Hiệu suất chiết PES………………………………………… 38 Bảng 3.11: Độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng………… 40 Bảng 3.12: Độ ổn định mẫu sau xử lý……………………………… 41 Bảng 3.13 Nồng độ LOR PES mẫu thực………………… 42 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHĨA LUẬN Tên hình trang Hình 2.1.Các phận máy phân tích khối phổ……………………… Hình 3.1: Tối ưu Cone Voltage ……………………………………… 23 Hình 3.2: Lựa chọn mảnh tối ưu hóa phân mảnh ……………… 24 Hình 3.3 : Sắc ký đồ mẫu chuẩn LOR,PES IS với điều kiện sắc ký xây dựng……………………………………………………………………… 27 Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng chiết lỏng – lỏng hỗn hợp dung mơi Diethyl ether: Chloroforrm (8:2)…………………………… 28 Hình 3.5: Quy trình xử lý mẫu chiết lỏng – lỏng với hệ dung môi Diethyl ether: Chloroform (8: 2)…………………………………………… 29 Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa LOR, PES IS………………… 30 Hình 3.7: Sắc ký đỗ mẫu huyết tương trắng………………………………… 30 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tỉ số diện tích pic LOR/IS nồng độ LOR huyết tương…………………………… 32 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tỉ số diện tích pic PES/IS nồng độ PES huyết tương……………………………………………………… 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó thời điểm 1.5h sau uống thuốc…………………………………………………………………………… 42 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó thời điểm 7h sau uống thuốc…………………………………………………………………………… 43 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm mũi dị ứng bệnh thường gặp bệnh lý đường hô hấp Bệnh phổ biến nước công nghiệp phát triển tình trạng nhiễm mơi trường, nước có khí hậu cận nhiệt đới Việt Nam Đối với bệnh lý việc phối kết hợp hoạt chất mà đặc biệt việc phối hợp Loratadin – thuốc kháng Histamin hệ hai có tác dụng làm giảm triệu chứng viêm mũi dị ứng Pseudoephedrin – thuốc có tác dụng làm giảm xung huyết ngày trở nên hữu ích mang đến hiệu điều trị rõ rệt Hiện thị trường dược phẩm có nhiều sản phẩm bào chế kết hợp hai thành phần hoạt chất dạng đặc biệt : viên nén giải phóng chậm, viên giải phóng có kiểm soát Việc kết hợp giúp làm đơn giản hóa việc dùng thuốc bệnh nhân giảm số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi làm tăng sinh khả dụng thuốc Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu bào chế dạng thuốc viên giải phóng có kiểm sốt hay giải phóng kéo dài chứa đồng thời Loratadin Pseudoephedrin[5], [7] Hiện tại, môn bào chế – trường đại học dược Hà Nội nghiên cứu bào chế viên giải phóng có kiểm sốt với tên Clarinase - VN Tuy nhiên nay, có nghiên cứu định lượng đồng thời hai hoạt chất chế phẩm[6], [9], [10] mà chưa có nghiên cứu phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất dịch sinh học cách sử dụng phương pháp có độ nhậy xác cao LC, GC, LC-MS Để đóng góp phương pháp phân tích có đủ độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác ứng dụng phục vụ cho cơng tác nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học dạng thuốc chứa Loratadin Pseudoephedrin, tiến hành đề tài “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Loratdin Pseudoephedrin huyết tương LC-MS” với mục tiêu sau: Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích đồng thời Loratdin Pseudoephedrin huyết tương LC-MS Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng theo quy định FDA – Mỹ Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 41 Sau 1,5giờ giờ, lấy máu động mạch cổ vào ống chống đông chứa Heparin Ly tâm 3000 vòng/phút x 10 phút, lấy huyết tương bảo quản -32ºC trước phân tích Xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.5, tiến hành sắc ký theo phương pháp xây dựng Quy trình cụ thể trình bày phụ lục 2, kết định lượng thể hình 3.10; 3.11 , bảng 3.13 Bảng 3.13 Nồng độ LOR PES mẫu thực Thời điểm (giờ) LOR Diện tích pic Diện tích Nồng độ pic IS PES Diện tích pic (ng/mL) Nồng độ (ng/mL) 1,5 3643 9,34 27814 181192 282,99 3436 10,515 25950 511334 818,02 Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó thời điểm 1.5h sau uống thuốc 42 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó thời điểm 7h sau uống thuốc Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương chó sau uống thuốc thời điểm khác cho pic có hình dạng cân đối, đáp ứng pic nội chuẩn thời điểm khác ổn định Nồng độ thuốc định lượng hai thời điểm nằm khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp Như vậy, phương pháp định lượng xây dựng phù hợp cho việc phân tích định lượng đồng thời LOR PES huyết tương đối tượng động vật nghiên cứu chó 3.3 BÀN LUẬN 3.3.1 Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích đồng thời LOR PES huyết tương LC – MS LC – MS phương pháp mới, sử dụng để định tính, định lượng chất cách xác nhanh chóng Bên cạnh việc thỏa mãn tiêu chí độ đúng, độ lặp lại…, LC – MS có ưu điểm trội độ nhạy cao so với phương pháp khác Sự kết hợp UPLC MS/MS làm tăng tính ưu việt phương pháp phân tích Nó coi phương pháp phân tích dẫn Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 43 đầu xu hướng phát triển kỹ thuật phân tích ứng dụng tiến khoa học cơng nghệ sở phân tích Hai hoạt chất LOR PES đồng sử dụng nhiều chế phẩm thuốc kết hợp, loại thuốc điều trị viêm mũi dị ứng số bệnh liên quan đến dị ứng khác Tuy nhiên hai dược chất lại khác biệt nhiều tính chất lý hóa dược động học: LOR có thời gian bán thải dài, lại xếp vào nhóm hai hệ thống phân loại sinh dược học (thấm tốt, tan kém), độ tan nước pH nằm dải pH tiêu hóa thấp, cản trở q trình tiêu hóa hấp thu Trong đó, PES lại có độ tan tốt thời gian bán thải ngắn [7] Vì mà chế phẩm kết hợp hai dược chất thường bào chế dạng đặc biệt, nồng độ hai hoạt chất máu sau sử dụng chế phẩm chênh lệch lớn (khoảng 100 lần) Với hoạt chất, có nhiều phương pháp định lượng sử dụng, chẳng hạn với PES người ta sử dụng phương pháp chuẩn độ acid – base môi trường khan quang phổ huỳnh quang, HPLC, với LOR HPLC …Nhưng để định lượng đồng thời hai hoạt chất huyết tương có số phương pháp áp dụng Chính mà việc lựa chọn phương pháp định lượng đồng thời LOR PES UPLC – MS/MS hoàn toàn phù hợp 3.3.2 Về xây dựng phương pháp định lượng  Quy trình xử lý mẫu: Do phương pháp định lượng sử dụng kỹ thuật LC – MS nên cần lượng nhỏ tạp chất có mẫu bị phát gây ảnh hưởng tới quy trình phân tích Hơn mẫu huyết tương có thành phần phức tạp, tỷ lệ tạp chất lớn, nồng độ LOR huyết tương lại thấp nên cần phải tìm đươc phương pháp xử lý mẫu thích hợp Phương pháp xử lý mẫu đề tài chiết lỏng – lỏng hỗn hợp dung môi Diethyl ether: Chloroform (8:2) 44  So với phương pháp chiết pha rắn (SPE), phương pháp mà sử dụng đơn giản nhiều, không cần trang thiết bị phức tạp, sử dụng đến cột chiết pha rắn đắt tiền, tiết kiệm nhiều kinh phí nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học (số lượng mẫu lên tới hàng nghìn)  So với phương pháp tủa protein, mẫu sau chiết phương pháp có độ tinh cao hơn, đường đẹp hiệu suất chiết lớn Phương pháp cho hiệu suất chiết cao hai dược chất (khoảng 105% với LOR 90% với PES) Hơn việc sử dụng hỗn hợp dung môi giúp làm giảm thời gian bay dung môi, rút ngắn thời gian xử lý mẫu Phương pháp sử dụng không làm mẫu bị pha lỗng, mà giúp làm giàu mẫu nhờ q trình điều chỉnh thể tích dung mơi hòa tan cắn  Lựa chọn điều kiện sắc ký khối phổ Pha động sử dụng cho q trình sắc ký chúng tơi hệ MeCN: dd acid formic 0,05% (70:30), gồm dung môi quen thuộc với sở phân tích nào, với tốc độ dòng 200µl/phút mang đến kết tối ưu cho phương pháp phân tích Việc sử dụng chất chuẩn nội DOM cho phân tích đồng thời LOR PES giúp đơn giản hóa quy trình phân tích chúng tơi nhiều so với quy trình phân tích khác (nghiên cứu nhà khoa học Trung Quốc sử dụng hai chất chuẩn nội diazepam cho LOR phenylpropanolamin cho PES [16]), lại đảm bảo hiệu suất chiết chuẩn nội cao gần tương đương với mức trung bình hiệu suất chiết LOR PES (104,31%) Phương pháp định lượng đồng thời LOR PES huyết tương xây dựng có ưu điểm việc sử dụng chế độ SIM với mảnh ion đặc trưng PES, LOR, DOM, không cần phải tách hồn tồn pic chất phân tích sắc ký đồ tổng ion mà đạt độ đúng, xác đặc hiệu Với tổng thời gian phân tích mẫu 2,8 phút, phương pháp rút ngắn nhiều thời gian phân tích so với phương pháp phân tích Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 45 nhà khoa học Trung Quốc: tổng thời gian phân tích mẫu 14 phút sử dụng kỹ thuật LC – MS[16] Đây coi ưu điểm bật phương pháp nghiên cứu thử nghiệm tương đương sinh học điều có ý nghĩa lớn 3.3.3 Về thẩm định phương pháp định lượng xây dựng Đề tài tiến hành thẩm định với nhiều tiêu: độ chọn lọc – đặc hiệu, giới hạn định lượng dưới, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định đáp ứng theo yêu cầu hướng dẫn FDA Với giới hạn phát nhỏ (LLOQ LOR 0.5ng/mL, PES 10ng/ml), rõ ràng phương pháp xây dựng có độ nhạy cao nhiều so với phương pháp khác thực Việt Nam lý tưởng cho phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Phương pháp có khoảng nồng độ tuyến tính rộng từ 0.05 – 50 ng/ml với LOR từ 10 – 1000ng/ml với PES, dự đoán bao phủ toàn khoảng nồng độ thuốc huyết tương cho phép việc triển khai ứng dụng phương pháp phân tích xây dựng vào đánh giá SKD nghiên cứu tương đương sinh học 3.3.4 Về tính khả thi phương pháp ứng dụng phân tích mẫu thực Với kết đạt phân tích mẫu thực, chứng minh phương pháp định lượng xây dựng hoàn toàn khả thi ứng dụng vào định lượng đồng thời LOR PES mẫu dịch sinh học thực Điều cho phép chúng tơi tiếp tục triển khai việc định lượng số lượng lớn mẫu dịch sinh học nhằm phục vụ cho nghiên cứu SKD tương đương sinh học mà trước hết nghiên cứu đánh giá thông số dược động học chó Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua q trình thực nghiệm, chúng tơi đạt kết sau: 46  Đã xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR PES huyết tương kỹ thuật UPLC-MS/MS sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters Xevo TQD, với cột sắc ký Acequity UPLC®BEH, với thời gian phân tích ngắn (2,8 phút),  Quy trình xử lý mẫu đơn giản: Kiềm hóa huyết tương dd NH3 0,1M trước chiết hỗ hợp dung môi Diethyl ether: Cloroform (8:2), lắc, ly tâm, sau khí Nitơ, cắn hòa tan pha động  Điều kiện sắc ký: - Cột: Acquity UPLC- BEH C18 (kích thước 50 x 2,1mm; 1,7µm) - Nhiệt độ cột: 30ºC - Pha động: MeCN : dd acid formic 0,05% tỷ lệ 70:30 - Tốc độ dòng: 200l/ phút  Chuẩn nội: Domperidol  Điều kiện khối phổ: Kiểu khối phổ MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+), phân mảnh ion mẹ thành ion LOR (383,17->259,17) 28V, PES (166,04 >117,06) 18V  Quy trình phân tích thẩm định theo hướng dẫn FDA đáp ứng u cầu :  Phương pháp phân tích có tính chọn lọc đặc hiệu với LOR PES với giá trị m/z LOR : 383,17->259,17, PES: 166,04 ->117,06  Khoảng nồng độ tuyến tính rộng với hệ số tương quan đạt yêu cầu LOR: 0,5-50 ng/mL(r = 0,9998), PES : 10- 1000 ng/mL(r= 0,9983)  Giới hạn định lượng dưới: LOR: 0,5 ng/ml, PES: 10 ng/ml  Độ phương pháp cao với LOR đạt từ 87,5%- 96,2% , với PES: 87,6% - 101,0%  Độ xác đạt yêu cầu với giá trị RSD LOR 6% PES 4%  Hiệu suất chiết hoạt chất ba khoảng nồng độ cao ổn định: IS (DOM): xấp xỉ 104%, LOR: xấp xỉ 105% PES xấp xỉ 90% Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 47  Hoạt chất ổn định điều kiện bảo quản khác nhau: 6h nhiệt độ phòng, sau 6h autosampler Kết thẩm định cho phép kết luận phương pháp định lượng đồng thời LOR PES huyết tương kỹ thuật LC-MS/MS mà xây dựng đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dược chất dịch sinh học Do kết nghiên cứu giải mục tiêu đặt khóa luận  Đã ứng dụng định lượng LOR PES huyết tương chó ( uống viên Clarinase) hai thời điểm, chứng tỏ phương pháp phân tích khả thi phân tích đồng thời LOR PES mẫu dịch sinh học thực 4.2 Kiến nghị  Tiếp tục đánh giá bổ sung tiêu độ ổn định sau ba chu kỳ đông– rã độ ổn định dài ngày  Áp dụng quy trình phân tích cho đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học cho chế phẩm đơn đa thành phần chứa LOR PES TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược lý học II, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Thị Ngọc Điệp(2010), “ Bước đầu nghiên cứu bào chế viên tác dụng kéo dài viên chứa Loratadin Pseudoephedrin”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2005 – 2010 Lê Thị Thu Hiền, Bùi Thu Huê, Đoàn Cao Sơn(2006), “Định lượng đồng thời loratadin pseudoephedrin hydroclorid thuốc viên phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí kiểm nghiệm, số 1.2006 , tập 4, (11), tr 8-11 Đỗ Quang Huy(2012), “Nghiên cứu viên giải phóng có kiểm sốt chứa pseudoephedrine loratadin”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2007 – 2012 Lê Thị Thu Huyền (2011), “Bước đầu nghiên, cứu dược động học Glycin futumin động vật thí nghiệm LC – MS/MS”, Luận văn thạc sĩ dược học Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Hải Bình, Lê Thị Ngọc Điệp, Nguyễn Thanh Hải(2010), “Định lượng đồng thời pseudoephedrin sulfat loratadin phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất”, Tạp chí kiểm nghiệm, số 2.2010 (28), tập 8, tr.13 – 17 10 Lê Minh Trí, Nguyễn Mã Huy Thanh(2003), “ Định lượng đồng thời loratadin pseudoephedrin sulfat chế phẩm viên nén phương pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm”, Tạp chí dược học, số 2.2003, tr.28-30 11 Nguyễn Đình Triệu (2005), Các phương pháp phân tích vật lý hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật,tr – 43 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Tiếng anh 12 AHFS drug information (2010) 13 Food and Drug Administration – United State (2001), Guidance for Industry – Bioanalytical method validation 14 F Zeeshan, KK Peh(2008), “Simultaneous Determination of Loratadine and Pseudoephedrine Using High Performance Liquid Chromatography Method”, 22nd MSPP scientific meeting 2008, Oral 48 15 I Singhvi, Neela Bhatia (2006), “Spectrophotometric and HPLC methods for simultaneous estimation of pseudoephedrine hydrochloride and loratadine from tablets”, Indian journal of phamarceutical sciences, Issue 1( volume 68), pp 72 – 75 16 Jianguo Sun, Guạngi Wang, Wei Wang, Shuai Zhao, Yi Gu, Jinwen Zhang, Mingwen Huang, Fen Shao, Hao Li, Qi Zhang, Haitang Xie (2005), “Simultaneous determination of loratadine and pseudoephedrine sulfat in human plasma by liquid chromatography – electrospray mass spectrometry for pharmacokinetic studies”, Journal of Pharmaceutical ang Biomedical Analysis,volume 39, pp 217 – 224 17 Lingyun Chen, Feng Qin, Yuanyuan Ma, Famei Li (2007), “Quantitative determination of azithromycin in human plasma by ultra performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry and its application in a pharmacokinetic study”, Journal of Chromatography B, Issue (volume 855), pp 255 – 261 18 Sean C Sweetman (2009); Martidal 36th edition, Pharmaceutical Press; UK 19 Singapore Health Sciences Authority (2003), Asean Guidelines for the Conduct of Bioavailability and Bioequivalent Studies, final draf 07/2003 20.The European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation 21 The United states pharmacopeia (2009) 22 Ting Wu, Chao Wang, Xing Wang, Haiqing Xiao, Qiang Ma, Qing Zhang (2008), “Comparison of UPLC and HPLC for Analysis of 12 Phthalates”, Chromatographia,68, pp 803 – 806 23 Waters Corporation (2004), “Ultra performance LC by design”, Waters Corporation USA, 720000880EN:LL &LW-U Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi PHỤ LỤC 2: Quy trình định lượng đồng thời LOR PES mẫu huyết tương Chuẩn bị mẫu 1.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương  Mẫu huyết tương trắng: Huyết tương chó chưa uống thuốc  Mẫu huyết tương thử : Huyết tương chó sau cho chó uống viên Clarinase ® tablet lấy thời điểm khác 1.2 Chuẩn bị mẫu đường chuẩn  Pha dung dịch chuẩn LOR, PES IS ( DOM) MeOH theo bảng sau: Bảng 1a: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES IS MeOH Thành phần( pha lỗng Nồng độ xác theo tỷ lệ thích hợp) khoảng Chuẩn gốc LOR(dd A) LOR cân+ MeOH 250 µg/mL Chuẩn gốc PES(dd B) PES cân + MeOH 250 µg/mL Chuẩn gốc IS (dd C) DOM cân+ MeOH 250 µg/mL Chuẩn trung gian (ddA1) dd A+ MeOH µg/mL Chuẩn trung gian (dd B1) dd B+MeOH 20 µg/mL Chuẩn IS làm việc dd C + MeOH 125 ng/mL Dung dịch  Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa LOR PES chuẩn theo bảng sau: Bảng 1b: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR PES Dung dịch Nồng độ xác Thành phần khoảng Chuẩn làm việc CC1 0,5 mL dd A1+0,5 mL dd LOR PES 50 ng/mL 1000 B1+ huyết tương trắng vừa ng/mL đủ 10 mL Chuẩn làm việc CC2 1mL dd CC1+ huyết ng/mL 100 ng/mL tương trắng vừa đủ 10 mL Từ chuẩn làm việc CC1 CC2 , chuẩn bị dãy mẫu chuẩn sau: Bảng 1c: Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ 0,5 1,0 2,5 10 20 35 50 10 20 50 100 200 400 700 1000 0 0 200 400 700 1000 100 200 500 1000 0 0 900 800 500 800 600 300 LOR (ng/mL) Nồng độ PES (ng/mL) Thể tích dd CC1 (µL) Thể tích dd CC2 (µL) Thể tích huyết tương trắng (µL) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi  Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC) Chuẩn bị mẫu QC tự tạo huyết tương tương tự mẫu chuẩn để có dd C1 nồng độ LOR xác khoảng 50 ng/mL, PES khoảng 1000 ng/mL dd C2 nồng độ LOR ng/mL, PES 100ng/mL Từ chuẩn bị mẫu QC bảng sau: Bảng 1d: Cách chuẩn bị mẫu QC Nồng độ Nồng độ Thể tích dd Thể tích dd Thể tích LOR (ng/mL) PES C1 (µL) C2 (µL) huyết Mẫu QC tương (ng/mL) trắng (µL) LQC 1,5 ng/mL 30 ng/mL 300 700 MQC 25 ng/mL 500 ng/mL 500 500 HQC 40 ng/mL 800 ng/mL 800 200 1.2 Chuẩn bị mẫu thử: Mỗi ống chứa 1000 µL huyết tương thử Xử lý mẫu Các mẫu đường chuẩn mẫu thử xử lý phương pháp chiết lỏng – lỏng theo quy trình xây dựng khóa luận sau Huyết tương 1mL + IS 0.1mL Lắc xoáy 30 giây Hỗn hợp chiết +0.5mL dd NH3 0.1M Lắc xoáy 30 giây Huyết tương kiềm hóa 3.5mL lớp dung mơi +5mLDiethyl ether: chloroform( 8:2).Lắc học 10 phút.Ly tâm 3000v/phút x phút Cơ khí Nitơ Cắn khơ +1mL pha động ,lắc xoáy 60 giây Dung dịch tiêm LCMS/MS Phân tích định lượng 3.1 Dựng đường chuẩn Tiến hành sắc ký mẫu đường chuẩn S1 –S8 với điều kiện  Điều kiện sắc ký:  Cột : Acquity UPLC ® BEH C18 (kích thước 50 x 2,1mm; 1,7µm)  Nhiệt độ cột : 30ºC  Pha động : MeCN : dd acid formic 0,05% tỷ lệ 70:30 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi  Tốc độ dòng : 200µl/ phút  Điều kiện khối phổ Thông số LOR PES Hiệu điện mao quản 4,0KV 4,0KV (Capillary voltage) Hiệu điện Cone 46V 20V (Cone voltage) Tốc độ hóa 600L/Hr 600L/Hr (Desolvation flow) Lưu lượng Cone (Cone 20L/Hr 20L/Hr flow) Nhiệt độ hóa 400 ºC 400 ºC (Desolvation temperature) Ion mẹ (parent ion ) m/z = 383,17 Da m/ z = 166,04Da Thế phân mảnh ion (collision energy) Ion (product ion) 28V 18V m/z=259,17 Da m/z= 117,06 Da IS(DOM) 4,0KV 54V 600L/Hr 20L/Hr 400 ºC m/z=426,17 Da 28V m/z= 175,08 Da Ghi lại sắc đồ tỷ lệ đáp ứng pic LOR/IS , PES/IS nồng độ, xác định tương quan tỷ lệ đáp ứng pic nồng độ LOR, PES có mẫu; vẽ đò thị đường chuẩn , xây dựng phương trình hồi quy xác định hệ số tương quan r Từ phương trình hồi quy xây dựng tính lại nồng độ mẫu 3.2 Định lượng nồng độ LOR PES mẫu thử Sau xây dựng đường chuẩn, tiếp tục tiến hành sắc ký mẫu thử với điều kiện tương tự mẫu đường chuẩn Ghi lại sắc ký đồ đối chiếu với sắc ký đồ mẫu đường chuẩn Ghi lại tỷ lệ đáp ứng pic LOR/IS, PES/IS mẫu thử, từ tính nồng độ LOR IS nhờ đồ thị đường chuẩn phương trình hồi quy xây dựng ... phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn:... sinh khả dụng tương đương sinh học dạng thuốc chứa Loratadin Pseudoephedrin, tiến hành đề tài Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Loratdin Pseudoephedrin huyết tương LC-MS” với... Loratdin Pseudoephedrin huyết tương LC-MS Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng theo quy định FDA – Mỹ 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 HOẠT CHẤT LORATADINE VÀ PSEUDOEPHEDRIN 1.1.1 Hoạt chất Loratadin