Một số nghiên cứu định lượng đồng phân quang học của Atenolol bằng HPLC như sau:
Nghiên cứu của Santoro M.I, Cho H.S (2000) [18], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:
Cột: Chiralcel OD (250 x 4,6 mm; 10 μm).
Pha động: Hexan - ethanol - diethylamine = 75: 25: 0,1 (tt/tt/tt).
Tốc độ dòng: 0,7 ml/ phút.
Bước sóng phát hiện: 276 nm.
Nghiên cứu của Eaga M.C (2010) [11], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:
Cột: Chiralcel AGP (150 x 4,0 mm; 5 μm).
Pha động: Dung dịch đệm Natri phosphat 10 mM (pH 7,0) - methanol = 95: 5 (tt/tt).
Tốc độ dòng: 0,9 ml/ phút.
Bước sóng phát hiện: 225 nm.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 10-100 μg/ml.
CE cũng được ứng dụng trong phân tích đồng phân đối quang của Atenolol.
Nghiên cứu của Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang, Zhenyu Zhu, Yifeng Chai [22] sau khi khảo sat và lựa chọn, đưa ra điều kiện điện di như sau:
Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40 cm, đường kính trong 50 μm.
Tiêm mẫu: 50 mbar × 3s.
Hiệu điện thế: 24 kV.
Bước sóng phát hiện : 214 nm.
Nhiệt độ mao quản: 20oC.
Dung dịch điện ly nền (BGE): Tris 50mM và CM-β-CD 8 mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric tới pH 4,0.
Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan trong dung dịch đệm Tris 50 mM ở nồng độ 10 mM. Dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với đệm Tris tới nồng độ 0,2 mM. Tất cả các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,22 μm.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chế phẩm viên nén có chứa Atenolol 50 mg (Atenolol dạng hỗn hợp racemic):
Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, số lô:040913, hạn dùng:10/09/2018, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA- VN, chứa 50mg Atenolol.(Mẫu M1)
Viên nén Tenormin 50 mg, SĐK: VN-1585-06, số lô: JA462, hạn dùng: 06/06/2016, nhà sản xuất: Astra Zeneca, Anh, chứa 50mg Atenolol.(Mẫu
M2)
2.1.2. Dung môi và hóa chất 2.1.2.1. Chất chuẩn 2.1.2.1. Chất chuẩn
Chất chuẩn quốc gia của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương – Bộ Y tế: Atenolol 200mg/lọ; 100,17% C14H22N2O3 (khan); độ ẩm: 0,11%; SKS: 0102093.
2.1.2.2. Các hóa chất khác
Hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích của Merck, Đức.
Natri hydroxyd
Tris(hydroxyl- methyl)amino methan (Tris)
Acid phosphoric đậm đặc.
Methanol.
Acid hydrocloric 0,1M
Muối Natri Carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD): đạt tiêu chuẩn phân tích của Sigma-Aldrich, Mỹ.
Nước cất 2 lần được khử ion.
Mẫu placebo.
2.1.3. Trang thiết bị
Máy điện di mao quản Agilent, model: G1600AX, số seri: DE1603499, của Agilent, Mỹ.
Máy đo pH (744 pH meter), của Metrohm, Thụy Sỹ.
Cân phân tích Mettler Toledo AL2004, seri: 1228350002, d= 0,0001g, sản xuất tại Thụy Sỹ.
Máy siêu âm Ultrasonic LC 30, hãng cung cấp: Elma.
Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh.
Hệ thống lọc nước siêu sạch, Đức.
Màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc 0,2 μm của Sartorius, Đức.
Bộ lọ nhựa đựng mẫu và nắp đậy.
Các dụng cụ chính xác: các pipet chính xác với thể tích khác nhau, bình định mức với thể tích khác nhau.
Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, giấy lọc, phễu thủy tinh…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản
Lựa chọn cột mao quản.
Lựa chọn hiệu điện thế.
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản
Độ phù hợp hệ thống.
Khoảng nồng độ tuyến tính.
Độ đặc hiệu.
Độ lặp lại.
2.2.3. Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol trên thị trường thị trường
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc việc
Dung dịch đệm Tris 50mM: cân khoảng 1,5 g Tris vào cốc có mỏ, hòa tan bằng nước, chuyển vào bình định mức 250 ml, bổ sung nước tới vạch, lắc đều.
Dung dịch điện ly nền Tris 50 mM chứa CM-β-CD 8mM, pH 4,0: pha dung dịch đệm Tris 50 mM, điều chỉnh bằng acid phosphoric đặc tới pH 4,0. Cân chính xác khoảng 0,0616 g CM-β-CD cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung đệm Tris 50 mM, pH 4,0 tới vạch, lắc đều.
Dung dịch NaOH 1 M: cân khoảng 4 g NaOH cho vào cốc có mỏ 100ml, hòa tan bằng nước, thêm nước tới vạch.
Dung dịch NaOH 0,1 M: cân khoảng 0,4 g NaOH cho vào cốc có mỏ 100 ml, hòa tan bằng nước, thêm nước tới vạch.
Dung dịch chuẩn gốc Atenolol 1000 ppm: cân chính xác khoảng 25 mg Atenolol khan vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris 50 mM, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung đệm vừa đủ. Bảo quản ở 4oC, tránh ánh sáng. Các dung dich phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung dịch đệm Tris 50 mM đến nồng độ yêu cầu.
Với mỗi chế phẩm viên nén chứa Atenolol 50mg: cân chính xác 20 viên tính khối lượng trung bình viên, nghiền mịn. Cân chính xác lượng bột viên tương ứng với 25 mg Atenolol cho vào bình định mức 25 ml, cho khoảng 20 ml đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung đệm vừa đủ, lọc thu lấy dịch lọc. Hút 500 μl dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc đều.
Dung dịch placebo: cân khoảng 0,1 g placebo cho vào bình định mức 25 ml, cho khoảng 20 ml đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung đệm vừa đủ,
lọc thu lấy dịch lọc. Hút 500 μl dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc đều.
Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,2 μm trước khi điện di.
2.3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di
Tạ Mạnh Hùng [7] đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình điện di gồm: thành phần dung dịch điện di, loại tác nhân chọn lọc đối quang, pH dung dịch đệm, hiệu điện thế và nồng độ Atenolol trong mẫu phân tích. Dựa vào kết quả của đề tài này, chúng tôi đưa ra điều kiện điện di như sau:
Phương pháp được tiến hành trên hệ thống điện di mao quản với detector mảng diod.
Nhiệt độ mao quản 250C, tiêm mẫu 50mbar x 3s, bước sóng phát hiện 194 nm.
Nồng độ Atenolol racemic trong mẫu phân tích khoảng 100ppm (tương ứng với khoảng 50ppm mỗi đơn đồng phân).
Dung dịch điện ly nền: Đệm Tris 50mM, pH 4,0 chứa CM-β-CD 8mM.
Trước khi sử dụng lần đầu tiên, cột mao quản mới được rửa sạch với methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút.
Hàng ngày, vào thời điểm đầu ngày các mao quản được rửa sạch bằng dung dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nước 5 phút, và với dung dịch điện ly nền (BGE) 15 phút.
Giữa mỗi lần chạy, chương trình luyện cột (preconditioning) được thực hiện với nước trong 5 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 4 phút, nước 2 phút, và BGE 4 phút.
Thời điểm cuối ngày, mao quản được rửa với dung dịch NaOH 0,1 M trong 30 phút, nước 30 phút, sau đó thổi khí 2 phút.
Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn Atenolol racemic 100 ppm với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau với chiều dài hiệu dụng và đường kính trong khác nhau.
2.3.2.2. Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản
Vì trong đề tài này sau khi lựa chọn được cột mao quản chúng tôi phải tiến hành khảo sát lại hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản.
Thay đổi hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 25 kV (∆E= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn hiệu điện thế phù hợp.
2.3.3.Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát, lựa chọn được cột mao quản, hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản, tiến hành thẩm định để đảm bảo phương pháp xây dựng được là phù hợp. Các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng của phương pháp.
2.3.4. Ứng dụng định lượng Atenolol trong các chế phẩm trên thị trường
Tiến hành điện di các mẫu chuẩn Atenolol racemic và mẫu thử. Dựa vào diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hàm lượng Atenolol racemic của mẫu chuẩn để xác định hàm lượng từng đồng phân Atenolol trong mẫu thử.
Hàm lượng Atenolol, C14H22N2O3, phải đạt được từ 90,0 đến 110,0% so với lượng ghi trên nhãn.
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu
Tính toán, xử lý và thống kê số liệu trên phần mềm Microsoft Excel 2007.
2.3.5.1. Công thức tính toán các giá trị thống kê
Giá trị trung bình: X =1 n× X Phương sai: S = ∑ X − X n − 1 Độ lệch chuẩn:
S = ∑ X − X n − 1
Độ lệch chuẩn tương đối:
RSD (%) =S X× 100% Trong đó: n: số phép thử. Xi: giá trị của phép thử thứ i. 2.3.5.2. Công thức tính kết quả
Hàm lượng của mỗi đồng phân trong một viên (mg/viên):
HL =1
2×
Sthử× mchuẩn× Cchuẩn× (1 − %H2O)
Schuẩn× mthử × m
Khối lượng thu hồi của mỗi đồng phân (mg):
m =1
2×
Sthử× mchuẩn× Cchuẩn × (1 − %H2O)
S ẩ − mthử×HL
m
Tỉ lệ phần trăm tìm lại của mỗi đồng phân (%):
% ℎ =
ê
× 100%
Trong đó:
Sthử: diện tích pic của mỗi đồng phân trong mẫu thử Schuẩn: diện tích pic của mỗi đồng phân trong mẫu chuẩn mchuẩn: khối lượng Atenolol racemic chuẩn
mthử: khối lượng bột viên.
mth: khối lượng thu hồi của mỗi đồng phân.
mthêm: khối lượng chuẩn thêm của mỗi đồng phân.
: Hàm lượng trung bình của mỗi đồng phân trong một viên. Cchuẩn: hàm lượng Atenolol racemic khan trong chất chuẩn (100,17%) %H2O: hàm ẩm của chất chuẩn (0,11%).
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 3.1.1. Lựa chọn cột mao quản
Tiến hành điện di dung dịch Atenolol racemic chuẩn 100 ppm với điều kiện điện di đã lựa chọn, sử dụng các cột mao quản sau:
Chiều dài hiệu dụng (cm)
Đường kính trong (μm)
Mao quản 1 40,5 75
Mao quản 2 56 50
Giá trị hiệu điện thế và cường độ dòng thực của máy điện di mao quản khi tiến hành điện di ở thế 25 kV được thể hiện ở hình 4 và hình 5.
(a)
(b)
Hình 4: Giá trị thực của hiệu điện thế (a) Mao quản 1; (b) Mao quản 2.
m in 5 10 15 20 kV 2 4 6 8 10 12
HPCE1 V, Voltage (ATENOLOL\130518000055.D)
m in 2 4 6 8 10 12 kV 0 5 10 15 20 25
(a)
(b)
Hình 5:Giá trị thực của cường độ dòng điện: (a) Mao quản 1; (b) Mao quản 2. Nhận xét:
Tín hiệu của cường độ dòng điện ở cả hai mao quản tương đối ổn định xung quanh giá trị 50 μA.
Giá trị thực của hiệu điện thế ở mao quản 1 dao động lớn mà không đạt được giá trị đặt 25 kV. Còn ở mao quản 2 thì ổn định, đạt được giá trị thế đặt 25 kV.
Như vậy, chúng tôi lựa chọn sử dụng mao quản 2: chiều dài hiệu dụng 56 cm, đường kính trong 50 μm.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của điện thế áp vào hai đầu mao quản.
m in 5 10 15 20 uA 10 20 30 40 50
HPCE1 C, Current (ATENOLOL\130518000055.D)
m in 2 4 6 8 10 12 uA 0 10 20 30 40
Chúng tôi tiến hành khảo sát các hiệu điện thế 15kV, 20kV, 25kV với điều kiện điện di đã lựa chọn, sử dụng mao quản 2, thu được các điện di đồ sau (Hình 6).
(a)
(b)
(c)
Hình 6: Điện di đồ ở 3 hiệu điện thế (a) 15kV; (b) 20 kV; (c) 25 kV m in 5 10 15 20 25 30 35 m AU -10 0 10 20 30
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000132.D)
Are a: 1 83.8 22 33.854 Are a: 1 87.9 35 35.958
Nhận xét:
Với cả ba giá trị hiệu điện thế thì các đồng phân đều được tách ra tốt.
Ở hiệu điện thế 15kV thời gian di chuyển trên 40 phút, ở hiệu điện thế 20 kV thời gian di chuyển gần 40 phút dẫn đến kéo dài thời gian phân tích.
Trong khi đó ở hiệu điện thế 25 kV thời gian di chuyển khoảng 33 phút, thời gian phân tích ngắn hơn.
Do đó chúng tôi lựa chọn hiêu điện thế 25 kV để thực hiện đề tài này.
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.2.1. Độ phù hợp hệ thống 3.2.1. Độ phù hợp hệ thống
Đánh giá độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc, thiết bị, cách tiến hành phân tích, mẫu thử…
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn atenolol racemic 100ppm trong cùng điều kiện điện di.
Kết quả độ phù hợp hệ thống được thể hiện trong bảng 2:
Bảng 2: Độ phù hợp hệ thống STT S-(-)-Atenolol R-(+)-Atenolol tm (phút) Diện tích pic (mAU.s) tm (phút) Diện tích pic (mAU.s) 1 33,146 184,3 35,357 193,7 2 33,854 183,8 35,958 187,9 3 32,763 183,0 35,167 189,5 4 33,214 192,7 35,618 194,2 5 31,706 185,8 33,542 190,0 6 31,638 187,5 33,710 195,7 Trung bình 32,720 186,2 34,892 191,8 RSD (%) 2,70 1,92 2,92 1,62 Nhận xét:
RSD đối với thời gian di chuyển của hai đồng phân S-(-)-Atenolol và R-(+)- Atenolol lần lượt là 2,70 % và 2,92 %, đều lớn hơn 2%.
RSD đối với diện tích pic của hai đồng phân S-(-)-Atenolol và R-(+)- Atenolol lần lượt là 1,92% và 1,62%, đều nhỏ hơn 2% nên phương pháp đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống đối với diện tích pic.
3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính
Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, cần xác định khoảng nồng độ mà ở đó có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích.
Tiến hành điện di dãy dung dịch chuẩn Atenolol racemic có nồng độ từ 50 ppm đến 150 ppm. Dãy dung dịch chuẩn Atenolol được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc Atenolol 1000 ppm bằng dung dịch đệm Tris 50mM như bảng 3:
Bảng 3: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Atenolol racemic STT Nồng độ (ppm) Hệ số hiệuchỉnh (k) Chuẩn gốc (μl) Đệm Tris (ml) 1 50 0,972 250 Vừa đủ 5ml 2 75 375 3 100 500 4 125 625 5 150 750
Tiến hành phân tích bằng chương trình điện di đã xây dựng, kết quả được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
STT Nồng độ đơn đồng phân (ppm)
Diện tích pic (mAU.s) S-(-)-Atenolol R-(+)-Atenolol 1 25,0 107,5 106,9 2 37,5 147,5 146,9 3 50,0 182,0 184,5 4 62,5 216,5 216,4 5 75,0 252,4 254,0
Kết quả sự phụ thuộc của diện tích pic của S-(-) Atenolol và R-(+) Atenolol vào nồng độ của mỗi đồng phân Atenolol được thể hiện trong hai hình 7 và 8 dưới đây:
Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của S-(-)-Atenolol theo nồng độ S-(-)-Atenolol y = 2,870x + 37,66 r² = 0,999 0 50 100 150 200 250 300 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Spic (m AU.s) C (ppm)
Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của R-(+)-Atenolol theo nồng độ R-(+)-Atenolol
Nhận xét:
Diện tích pic của S-(-)-Atenolol tương quan với nồng độ S-(-)-Atenolol theo phương trình y = 2,870x + 37,66 với hệ số tương quan r = 0,9995. Do đó trong khoảng nồng độ 25-75 ppm, diện tích pic của S-(-)-Atenolol có quan hệ tuyến tính với nồng độ S-(-)-Atenolol.
Diện tích pic của R-(+)-Atenolol tương quan với nồng độ Atenolol racemic theo phương trình y = 2,909x + 36,26 với hệ số r = 0,9990. Do đó trong khoảng nồng độ 25-75 ppm, diện tích pic của R-(+)-Atenolol có quan hệ tuyến tính với nồng độ S-(-)-Atenolol.
3.2.3. Độ đặc hiệu
Độ dặc hiệu của phương pháp phân tích là khả năng phương pháp đó có thể xác định được một cách chính xác, đặc hiệu chất cần phân tích, không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác trong mẫu thử.