Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng từng đồng phân Atenolol của một chế phẩm trên thị trường (Mẫu M2).
Làm 3 lần tính kết quả trung bình. Kết quả thu được như sau:
Bảng 8: Kết quả định lượng mẫu M2 STT Khối lương cân (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng (mg/viên) Tổng hàm lượng (mg/viên) S(-) R(+) S(-) R(+) 1 0,1083 208,0 209,8 25,9 ± 0,30 25,8 ± 0,25 51,7 2 0,1097 210,5 211,7 3 0,1078 205,8 208,2 Trung bình 0,1086 208,5 210,5 Chuẩn 25,5 mg 205,1 207,4
Hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn: % Atenolol racemic = , ×
100% = 103,4 %.
BÀN LUẬN
So với HPLC, CE có nhược điểm là độ nhạy thấp hơn do sử dụng detector phát hiện chất phân tích trên quãng đường ngắn hơn và lượng mẫu tiêm ít hơn. Tuy nhiên, CE đang được nghiên cứu và ứng dụng ngày càng nhiều trong phân tích các đồng phân đối quang do có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với HPLC như: hiệu lực tách cao hơn, tốn ít dung môi hóa chất, tác nhân chọn lọc đối quang. Đặc biệt là CE không cần phải sử dụng cột tách đối quang đắt tiền bởi đơn giản chỉ cần cho thêm tác nhân chọn lọc đối quang vào dung dịch đệm. Khả năng thay đổi linh hoạt loại và nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang, thể tích mẫu nhỏ cho phép sử dụng các thuốc thử đắt tiền, do đó mà dễ dàng trong quá trình sàng lọc tác nhân chọn lọc đối quang, điều kiện điện di, phát triển và tối ưu hóa phương pháp [9].
Atenolol có một carbon bất đối trong phân tử tồn tại dưới hai dạng đồng phân S-(-), và đồng phân R-(+). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong hai đồng phân thì đồng phân S-(-) đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng dược lí của Atenolol và độc tính của nó thì lại ít hơn so với đồng phân R-(+). Do đó trong thực tế đòi hỏi phải sản xuất và đưa vào sử dụng dạng đơn đồng phân S-(-).
Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013) [7] đã nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di và đưa ra điều kiện như sau:
Cột mao quản silica nung chảy: chiều dài tổng 58,5 cm (chiều dài hiệu dụng 50 cm), đường kính trong 75 μm.
Dung dịch điện ly nền: Tris 50 mM, CM-β-CD 8 mM, pH 4,0.
Nhiệt độ: 200C.
Hiệu điện thế: 16 kV
Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.
Bước sóng phát hiện: 194 nm
Nồng độ chất phân tích: 100 ppm (kl/tt) Atenolol racemic.
Để xác định thứ tự rửa giải, nhóm tác giả tiến hành điện di hai dung dịch: Atenolol racemic chuẩn 100 pppm và S-(-)-Atenolol chuẩn 50 ppm với điều kiện
điện di trên thì thấy rằng thời gian di chuyển của đơn đồng phân S-(-)-Atenolol phù hợp với thời gian di chuyển của pic thứ nhất của hỗn hợp racemic.
Sau đó tiến hành điện di dung dịch Atenolol racemic chuẩn 100 ppm thêm S-(-)-Atenolol chuẩn 100 ppm tương đương với mẫu tiêm có tỉ lệ R(+) /S(-) = 1/3 cũng với điều kiện như trên thì thấy diện tích của pic thứ nhất lớn hơn của pic thứ hai khoảng 3 lần.
Do đó có thể kết luận được thứ tự rửa giải của hai đồng phân: đồng phân S-(- )-Atenolol được rửa giải ra trước, tức thời gian di chuyển ngắn hơn đồng phân R- (+)-Atenolol.
Điều đó có thể được giải thích bằng cơ chế tạo phức lồng giữa hai đồng phân của Atenolol với CM-β-CD.
Hình 13: Vị trí tương tác liên kết hydro[22].
Đồng phân R-(+) có 3 vị trí có tương tác liên kết hydro với CM-β-CD (vị trí 1,2 và 3), trong khi đó đồng phân S-(-) chỉ có một vị trí có tương tác liên kết hydro (vị trí 3). Do đó ái lực của đồng phân R-(+) với CM-β-CD lớn hơn của đồng phân S-(-) dẫn đến phức lồng của đồng phân R-(+) bền hơn. Và cuối cùng dẫn đến linh độ điện di của đồng phân R-(+) thấp hơn và được rửa giải ra sau đồng phân S-(-) [22].
Nghiên cứu của chúng tôi kế thừa nghiên cứu trên và tiếp tục hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol.
Vị trí 1 Vị trí 2
Vị trí 3
Sau khi nghiên cứu và làm thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản.
Phương pháp đã được thẩm định trên các chỉ tiêu sau:
Độ phù hợp hệ thống: diện tích pic của hai đồng phân S(-), R(+) Atenolol có độ lệch chuẩn tương đối đều nhỏ hơn 2% (tương ứng là 1,92% và 1,62%) nên phương pháp đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống về diện tích pic. Tuy nhiên độ lệch chuẩn tương đối của thời gian di chuyển của hai đồng phân S(-), R(+) Atenolol đều lớn hơn 2% (tương ứng là 3,04% và 3,17%)
Diện tích pic của mỗi đồng phân S(-), R(+) Atenolol có quan hệ tuyến tính đồng biến với nồng độ của mỗi đồng phân trong khoảng 25-75 ppm, với hệ số tương quan r xấp xỉ 1 (tương ứng là 0,9995 và 0,9990).
Độ đặc hiệu cao: Điện di đồ của mẫu placebo không xuất hiện pic tại vị trí tương ứng với pic của hai đồng phân trên điện di đồ của cả mẫu thử và mẫu chuẩn.
Độ lặp lại cao: Độ lệch chuẩn tương đối khi định lượng 6 mẫu song song có khối lượng cân chế phẩm khác nhau tương ứng với mỗi đồng phân S(- ), R(+) Atenolol là 1,69% và 1,50%, đều nhỏ hơn 2%.
Độ đúng: Tỷ lệ phần trăm tìm lại ở cả hai mức thêm chuẩn đều có những giá trị nằm ngoài khoảng quy định 98-102% nên phương pháp chưa đạt yêu cầu về độ đúng.
Quy trình tiến hành đơn giản, tốn ít hóa chất và dung môi, ít độc hại.
Như vậy phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol mà chúng tôi xây dựng đạt các tiêu chuẩn của một phương pháp định lượng, có thể áp dụng để định lượng các đồng phân đối quang của Atenolol trong chế phẩm.
Chúng tôi đã ứng dụng phương pháp này vào định lượng một chế phẩm trên thị trường (Mẫu M2) thì hàm lượng của Atenolol racemic so với hàm lượng ghi trên nhãn là 103,4%, đạt yêu cầu về hàm lượng theo Dược điển Việt Nam IV.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản như sau:
Kiểu điện di: Điện di mao quản vùng (CZE).
Cột mao quản: Cột Agilent HPCE có chiều dài hiệu dụng 56cm, đường kính trong 50μm.
Hiệu điện thế: 25kV
Nhiệt độ: 25oC.
Bước sóng phát hiện: 194nm
Dung dịch điện ly nền: Tris 50mM, điều chỉnh tới pH 4,0 bằng acid H3PO4 đặc, chứa CM-β-CD 8mM.
Tiêm mẫu: 50mbar × 3s.
Trước khi sử dụng lần đầu tiên, cột mao quản mới được rửa sạch với methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút.
Hàng ngày, vào thời điểm đầu ngày các mao quản được rửa sạch bằng dung dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nước 5 phút, và với dung dịch điện ly nền (BGE) 15 phút.
Giữa mỗi lần chạy, chương trình luyện cột (preconditioning) được thực hiện với nước 5 phút, dung dịch NaOH 0,1 M 4 phút, nước 2 phút, và BGE 4 phút.
Thời điểm cuối ngày, mao quản được rửa với dung dịch NaOH 0,1 M 30 phút, nước 30 phút, sau đó thổi khí 2 phút.
Với điều kiện điện di như trên, phương pháp xây dựng đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại. Khoảng nồng độ tuyến tính với mỗi đơn đồng phân là từ 25 ppm – 75 ppm.
Kết quả định lượng chế phẩm trên thị trường Mẫu M2 đạt yêu cầu định lượng theo Dược điển Việt Nam IV.
KIẾN NGHỊ
Sau khi thực hiện đề tài này, chúng tôi có một số đề xuất như sau:
Tiếp tục hoàn thiện phương pháp định lượng các đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản.
Sau khi hoàn thiện phương pháp, ứng dụng phương pháp vào kiểm nghiệm thuốc, đánh giá thử độ hòa tan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, 72-73
2. Bộ Y tế (2009), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 160-162.
3. Bộ Y tế (2007), Hóa dược tập 1, Nhà xuất bản Y học, 156- 277.
4. Bộ Y tế (2007), Hóa dược tập 2, Nhà xuất bản Y học, 100.
5. Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ tập 1, Nhà xuất bản Y học, 66.
6. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất bản Y học, 225-247.
7. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, Nguyễn Thị
Kiều Anh (2013), “Bước đầu nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của
atenolol bằng phương pháp điện di mao quản”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc,
11(42), 14-19.
8. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Kiều Anh
(2013), “Nghiên cứu tách các đồng phân quang học của Atenolol bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang”, Tạp chí Nghiên cứu dược và
Thông tin thuốc, 6, 218-224.
9. Benno A (1997), Chiral separations using capillary electrophoresis,
Technische Universiteit Eindhoven.
10.Blanco M., Valverde I (2003), “Choice of chiral selector for enantioseparation
by capillaryelectrophoresis”, Trends in Analytical Chemistry, 22(7+8), 428-439.
11.Eaga M.C, Somagoni M.J, Maddi R.S, Reddy S, Yamsani M.R (2010), “New
chiral reverse phase HPLC method for determination of atenolol enantiomers in
pharmaceutical formulations”, International Journal of Pharmaceutical
Sciences Review and Research, 4(1), 22-26.
12.Fanali S (1996), “Identification of chiral drug isomers by capillary
13.Fanali S (2000), “Enantioselective determination by capillary electrophoresis
with cyclodextrins as chiral selectors”, Journal of Chromatography A, 875, 89–
122.
14.Gubitz G, Schmid M (1997), “Chiral separation principles in capillary
electrophoresis”, Journal of Chromatography A, 792, 179–225.
15.INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY, (1997)
Analytical chiral separation methods, Pure and Applied Chemistry, 69,1469-
1474.
16.Jie Zhou, Hanchun Yao, Hong Shao, Yinghui Li, Zhenzhong Zhang (2012),
“Enantioseparation of β-agonists with Carboxymethyl-β-Cyclodextrin by CE”,
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 35, 50–58.
17.Leena S (2007), “Capillary Electrophoresis in Pharmaceutical Analysis: A
Survey on Recent Applications”, Journal of Chromatographic Science, 45,
559-577.
18.Santoro M.I, Cho H.S (2000), “Enantiomeric separation and quantitative
determination of atenolol in tablets by chiral high-performance liquid
chromatography”, Drug development industrial pharmacy, 26(10), 1107-1110.
19.Shigeru Terabe, Koji Otsuka, Hiroyuki Nishi (1994), “Separation of
enantiomers by capillary electrophoretic techniques”, Journal of
Chromatography A, 666, 295–319.
20.Stoschitzky K, Eggingere G, Zernig G, Klein W, Lindner W (1993),
“Stereoselective features of (R)- and (S)-Atenolol: Clinical pharmacological,
pharmacokinetic, and radioligand binding studies”, Chirality, 5, 15-19.
21.Stoschitzky K, Lindner W, Zernig G (1998), “Racemic beta-blockers–fixed
combinations of different drugs”, Journal of Clinical and Basic Cardiology, 1
22.Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang, Zhenyu Zhu, Yifeng Chai (2012), “Molecular Modeling Study of Chiral Separation and
Recognition Mechanism of β-Adrenergic Antagonists by Capillary
Electrophoresis”, International Journal of Molecular Sciences, 13, 710-725.
PHỤ LỤC Điện di đồ khảo sát độ phù hợp hệ thống m in 5 10 15 20 25 30 35 m AU -10 0 10 20 30 40 Are a: 1 84.3 45 33.146 Are a: 1 93.7 26 35.357 m in 5 10 15 20 25 30 35 m AU -10 0 10 20 30
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000132.D)
Are a: 1 83.8 22 33.854 Are a: 1 87.9 35 35.958
m in 5 10 15 20 25 30 m AU -10 0 10 20 30 40 50
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000143.D)
Are a: 1 85.7 78 31.706 Are a: 1 89.9 7 33.542 m in 5 10 15 20 25 30 35 m AU -20 -10 0 10 20 30 40
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000141.D)
Are a: 1 92.7 41 33.214 Are a: 1 94.2 12 35.618 m in 5 10 15 20 25 30 35 m AU -20 0 20 40 60 80 100 120
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000142.D)
Are a: 1 87.4 86 31.638 A rea: 198 .66 33.710