Xây dựng phương pháp định tính định lượng đồng thời methylisothiazolinon và methylchloroisothiazolinon trong mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN TRUNG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METHYLISOTHIAZOLINON VÀ METHYLCHLOROISOTHIAZOLINON TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN TRUNG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METHYLISOTHIAZOLINON VÀ METHYLCHLOROISOTHIAZOLINON TRONG MỸ PHẨM ĐỀ CƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ 60720410 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hƣờng Hoa HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt khoảng thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cô giáo, chuyên gia nhiều lĩnh vực, anh chị kỹ thuật viên, đồng nghiệp, bạn bè, gia đình Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Lê Thị Hường Hoa, Trưởng Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng sau đại học, thầy cô môn Phân tích – Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội Các anh, chị Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, Ban giám hiệu, đồng nghiệp Trường Cao đẳng Y tế Hà Tĩnh, người giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập sống Một lần xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Hà Tĩnh, ngày 28 tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Văn Trung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Chất Bảo quản 1.1.1 Các yêu cầu chất bảo quản 1.1.2 Chất bảo quản mỹ phẩm 1.2 Các chất bảo quản nghiên cứu đề tài 1.2.1 Methylisothiazolinon (MIT): 1.2.1.1.Công thức phân tử 1.2.1.2.Tính chất vật lý 1.2.1.3.Ứng dụng 1.2.1.4.Cơ chế tác dụng 1.2.1.5.Ảnh hưởng đến người sử dụng 1.2.2 Methylcholoisothiazolinon (MCT) 1.2.2.1 Công thức hóa học 1.2.2.2 Tính chất vật lý 1.2.2.3 Ứng dụng chế tác dụng 1.2.2.4.Ảnh hưởng đến người sử dụng 1.2.3.Hỗn hợp Methylchloroisothiazolinone : methylisothiazolinone 3:1 1.2.3.1 Công thức hỗn hợp 1.2.3.2 Tính chất vật lý hỗn hợp 1.2.3.3 Những ưu điểm hỗn hợp MCT/MIT 3:1 so với dùng đơn độc MIT MCT 1.2.3.4 Ảnh hưởng đến người sử dụng 10 1.3 Những quy định MIT MCT sử dụng mỹ phẩm, công nghiệp nông nghiệp 10 1.3.1 Trên giới 10 1.3.2 Quy định mỹ phẩm có chứa MCT MIT Việt Nam 11 1.4 Một số phƣơng pháp định tính, định lƣợng MIT MCT 11 1.4.1 Phương pháp GCMS 12 1.4.2 Phương pháp HPLC 12 1.4.3 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 14 1.4.3.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng 14 1.4.3.2 Một số thông số đặc trưng 17 1.4.3.3 Ứng dụng 21 1.5 Xử lý mẫu mỹ phẩm 21 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Hóa chất, dung môi 23 2.3 Phƣơng tiện, thiết bị nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích: 24 2.4.1.1 Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 24 2.4.1.2 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký 24 2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.2.1 Tính thích hợp hệ thống 25 2.4.2.2 Độ đặc hiệu 25 2.4.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 26 2.4.2.4 Độ 27 2.4.2.5 Độ xác 28 2.4.2.6.Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 29 2.4.3 Áp dụng số chế phẩm dạng kem, sữa tắm thị trường 30 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích 31 3.1.1 Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 31 3.1.1.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 31 3.1.1.2 Phương pháp xử lý mẫu 32 3.1.2 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký 35 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc ký 35 3.1.2.2 Lựa chọn bước sóng phân tích 35 3.1.2.3 Xác định thành phần pha động 36 3.1.2.4 Xác định tỷ lệ pha động 37 3.1.2.5 Khảo sát thể tích tiêm mẫu 38 3.1.2.6 Khảo sát tốc độ dòng 38 3.2 Thẩm định phƣơng pháp 39 3.2.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống 39 3.2.2 Độ đặc hiệu 40 3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 42 3.2.4 Độ xác phương pháp 45 3.2.5 Độ 47 3.2.6 Gới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 50 3.3 Áp dụng kiểm tra mẫu mỹ phẩm 51 Chƣơng BÀN LUẬN 53 4.1 Về chất bảo quản Methylisothiazolinon Methylcloroisothiazolinon 53 4.2 Về phƣơng pháp nghiên cứu 53 4.2.1 Về phương pháp xử lý mẫu 53 4.2.3 Về xây dựng quy trình phân tích 54 4.2.4 Về thẩm định phương pháp 55 4.3 Về kiểm tra mẫu mỹ phẩm 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 PHỤ LỤC Danh mục từ viết tắt AOAC: Association of Official Analytical Chemists : Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức ASEAN: Association of Southeast Asian Nations : Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á BP: British Pharmacopoeia : Dược điển Anh DAD: Detector Diod Array: Detector mảng diod EI : Electron Ionization :Ion hóa electron EPA: Environmental Protection Agency: Tổ chức bảo vệ môi sinh FAK : enzym Focal adhesion kinase ICH : International Conference on Harmonisation Hội nghị hòa hợp quốc tế HPLC : High Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu cao LOD: Giới hạn phát LOQ: Giới hạn định lượng MCT: Methylchloroisothiazolinon MIT: Methylisothiazolinon Ppm : parts per million: Phần triệu Ppb : parts per billion :Phần tỷ USP: United StatesPharmacopeial : Dược điển Mỹ SCCS : Scientific Committee on Consumer Safety: Hiệp hội khoa học an toàn người tiêu dùng UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu siêu cao UV: Ultraviolet: Tử ngoại Danh mục bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các hóa chất dung môi sử dụng trình thí nghiệm 25 Bảng 2.2 Giới hạn chấp nhận độ phương pháp theo AOAC 29 Bảng 2.3 Giới hạn chấp nhận độ xác phương pháp theo AOAC 30 Bảng 3.1 Độ ổn định dung dịch chuẩn MIT MCT 34 Bảng 3.2 Độ thích hợp hệ thống sắc ký với mẫu dầu gội đầu 41 Bảng 3.3 Độ thích hợp hệ thống sắc ký khăn ướt, nước giữ ẩm 42 Bảng 3.4 Kết xác định khoảng nồng độ tuyến tính MIT MCT đối 45 với mẫu dầu gội đầu Bảng 3.5 Kết xác định khoảng nồng độ tuyến tính MIT MCT đối 46 với mẫu nước giữ ẩm, khăn giấy Bảng 3.6 Độ xác phương pháp mẫu dầu gội đầu 47 Bảng 3.7 Độ xác phương pháp mẫu khăn ướt 48 Bảng 3.8 Độ xác phương pháp mẫu nước giữ ẩm 48 Bảng 3.9 Độ MIT mẫu dầu gội đầu 49 Bảng 3.10 Độ MCT mẫu dầu gội đầu 50 Bảng 3.11 Độ MIT mẫu khăn ướt 50 Bảng 3.12 Độ MCT mẫu khăn ướt 51 Bảng 3.13 Độ MIT mẫu nước giữ ẩm 51 Bảng 3.14 Độ MCT mẫu nước giữ ẩm 52 Bảng 3.15 Kết khảo sát MIT, MCT số mẫu mỹ phẩm thị 54 trường Bảng 4.1 Gới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 58 Danh mục hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn pha Acetonitril 33 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn pha Methanol 34 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn với pha động Acetonitril- nước 38 Hình Sắc ký đồ dung dịch chuẩn với pha động methanol- nước 39 Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với MIT MCT dầu gội đầu 43 Hình 3.6 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với MIT MCT khăn ướt 43 Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với MIT MCT nước giữ ẩm 44 Hình 3.8 Kết xác định khoảng nồng độ tuyến tính MIT MCT đối 45 với mẫu dầu gội đầu Hình 3.9 Kết xác định khoảng nồng độ tuyến tính MIT MCT mẫu nước giữ ẩm, khăn giấy 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhu cầu làm đẹp người có từ lâu Ngày nay, xã hội phát triển, kinh tế phát triển, nhu cầu làm đẹp ngày tăng cao Ở Việt Nam, năm gần đây, sản phẩm làm đẹp ngày phong phú Các sản phẩm làm đẹp gọi chung mỹ phẩm Chất lượng mỹ phẩm vấn đề cần phải quan tâm mỹ phẩm tiếp xúc trực tiếp với thể, qui định thời gian liều lượng sử dụng ảnh hưởng đến sức khỏe vẻ đẹp thể Trong phân loại sản phẩm, hàng hóa theo tính an toàn, mỹ phẩm thuộc nhóm - cần có quản lý nhà nước tính an toàn sản phẩm Mặt khác, kinh tế Việt Nam nằm tiến trình hội nhập toàn cầu hóa Năm 2003, Chính phủ Việt Nam ký kết “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm”[3][9].Ngày 07/11/2006, Việt Nam thức trở thành thành viên thứ 150 tổ chức thương mại giới Chúng ta phải tuân thủ qui định, ràng buộc để có hòa hợp, công nhận lẫn phát triển Quản lý chất lượng hàng hóa nói chung chất lượng mỹ phẩm nói riêng cho phù hợp nhu cầu tất yếu cấp bách Trong mỹ phẩm thành phần có tác dụng có nhiều thành phần khác chất màu, chất bảo quản dùng để tránh nấm mốc, nhiễm khuẩn… Methylisothiazolinon (MIT) Methylcholoroisothiazolinon(MCT) hai chất sử dụng nhiều làm chất bảo quản công nghiệp nông nghiệp đặc biệt mỹ phẩm tan tốt nước, có khả diệtkhuẩn Tuy nhiên, trình sử dụng có nhiều lo ngại tác dụng có hại MIT MCT đến sức khỏe người sử dụng đặc biệt phản ứng dị ứng Trước vấn đề đó, nhiều nghiên cứu ảnh hưởng MIT MCT mỹ phẩm đến sức khỏe người tiêu dùng tiến hành Dựa nghiên cứu này, để đảm bảo an toàn cho người sử dụng, nướcMỹ, liên minh Châu Âu, Asean số nước khác đưa giới hạn sử dụng cho MIT MCT mỹ phẩm : không 100ppm (0,01%) cho MIT không 15ppm (0,0015%) cho hỗn hợp MCT/MIT tỷ lệ 3:1, sử dụng hỗn hợp MCT/MIT thêm MIT [14][16][20][24][25][27] Ở Việt Nam, ngày 13/04/2015 cục Bảng 3.10 Độ MCT mẫu dầu gội đầu Stt Khối lượng mẫu placebo (g) Lượng chuẩn thêm (µg) Diện tích pic (mAu.s) Lượng tìm lại (µg) % Thu hồi 1,0215 7,712 72294 7,666 99,40 1,0126 7,712 70527 7,478 96,97 1,0156 7,712 72915 7,732 100,25 1,0301 9,64 89478 9,49 98,42 1,0257 9,64 90847 9,63 99,93 1,0149 9,64 91418 9,69 100,55 1,0119 11,568 110205 11,685 101,02 1,0651 11,568 112604 11,940 103,22 1.,0598 11,568 108615 11,517 99,56 % thu hồi trung bình %RSD 98,87 1,72 99,634 1,10 101,26 1,82 90914 Chuẩn Bảng 3.11 Độ MIT mẫu khăn ƣớt Khối lượng Lượng Diện tích Lượng % Thu % Thu hồi Stt mẫu placebo chuẩn pic tìm lại hồi trung bình thêm (µg) (mAu.s) (µg) (g) 1,0002 7,984 37000 8,082 101,23 1,0118 7,984 37195 8,125 101,77 1,0101 7,984 37578 8,209 102,82 1,0025 9,98 46543 10,167 101,87 1,0007 9,98 46184 10,09 101,09 1,0112 9,98 45314 9,90 99,18 1,0107 11,976 55818 12,193 101,81 1,0214 11,976 54746 11,959 99,86 1,0214 11,976 55656 12,158 101,52 Chuẩn 45687 48 % RSD 101,94 0,79 100,72 1,37 101,06 1,04 Bảng 3.12 Độ MCT mẫu khăn ƣớt Stt Khối lượng Lượng Diện tích Lượng % Thu % Thu hồi mẫu placebo chuẩn pic tìm lại hồi trung (g) thêm (µg) (mAu.s) (µg) bình 1,0002 23,04 66860 22,83 99,1 1,0118 23,04 67954 23,21 100,7 1,0101 23,04 68137 23,27 101,0 1,0025 28,80 88086 30,08 104,4 1,0007 28,80 86743 29,62 102,9 1,0112 28,80 84396 28,82 100,1 1,0107 34,56 103281 35,27 102,1 1,0214 34,56 101547 34,68 100,3 1,0214 34,56 103113 35,21 101,9 Chuẩn % RSD 100,27 0,25 102,5 2,16 101,4 0,93 84335 Bảng 3.13 Độ MIT mẫu nƣớc giữ ẩm Stt Khối lượng Lượng Diện tích Lượng % Thu % Thu hồi mẫu placebo chuẩn pic tìm lại hồi trung (g) thêm (µg) (mAu.s) (µg) bình 1,0014 7,984 34622 7,563 94,73 1,0120 7,984 35418 7,737 96,90 1,0110 7,984 36062 7,877 98,67 1,0005 9,98 45254 9,89 99,05 1,0015 9,98 44115 9,64 96,56 1,0242 9,98 43761 9,56 95,78 1,0017 11,976 53661 11,722 97,88 1,0225 11,976 51415 11,231 93,78 1,0014 11,976 51283 11,202 93,54 Chuẩn 45687 49 % RSD 96,76 2,04 97,13 1,76 95,07 2,56 Bảng 3.14 Độ MCT mẫu nƣớc giữ ẩm Khối lượng Stt mẫu placebo (g) Lượng chuẩn thêm (µg) Diện tích Lượng pic tìm lại (mAu.s) (µg) % Thu % Thu hồi hồi trung bình 1,0014 23,04 68159 23,28 101,02 1,0120 23,04 69071 23,58 102,37 1,0110 23,04 69384 23,69 102,84 1,0005 28,80 89015 30,40 105,55 1,0015 28,80 88391 30,19 104,81 1,0242 28,80 87302 29,81 103,52 1,0017 34,56 105792 36,13 104,54 1,0225 34,56 104992 35,85 103,74 1,0014 34,56 105142 35,90 103,89 Chuẩn % RSD 102,08 0,92 104,63 0,98 104,06 0,41 84335 Từ kết cho thấy: Tỷ lệ thu hồi tất mẫu nằm khoảng 80 – 110% (93,54% - 104,54%) Ở số nồng độ giá trị RSD >2%, nhiên quy trình phân tích chất có nồng độ nhỏ mẫu phức tạp nên kết tốt, chấp nhận 3.2.6 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp xác định qua thực nghiệm cách phân tích mẫu tự tạo mẫu mỹ phẩm có nồng độ chất chuẩn MIT, MCT thêm vào cách giảm dần, giảm dần Kết thực nghiệm mẫu thu kết sau: - Nền mẫu dầu gội đầu: Với nồng độ MIT 0,0165 µg/ml MCT 0,048µg/ml pic MIT MCT cao lần so với mẫu đường Như phương pháp có giới hạn phát cho MIT 0,33 µg/g cho MCT 0,96 µg/g 50 mẫu dầu gội đầu theo phương pháp xử lý mẫu quy trình Với nồng độ MIT 0,066 µg/ml MCT 0,192µg/ml pic MIT MCT cao 10 lần so với mẫu đường nồng độ độ độ xác đạt yêu cầu Như phương pháp có giới hạn định lượng cho MIT 1,32 µg/g cho MCT 3,84 µg/g mẫu dầu gội đầu theo phương pháp xử lý mẫu quy trình - Nền mẫu khăn ướt mẫu nước giữ ẩm: Với nồng độ MIT 0,0499 µg/ml MCT 0,144µg/ml pic MIT MCT cao lần so với nhiễu đường Như phương pháp có giới hạn pháp cho MIT 0,998 µg/g cho MCT 2.88 µg/g mẫu khăn ướt, nước giữ ẩm theo phương pháp xử lý mẫu quy trình Với nồng độ MIT 0,1996 µg/ml MCT 0,567µg/ml pic MIT MCT cao 10 lần so với mẫu đường nồng độ độ độ xác đạt yêu cầu Như phương pháp có giới hạn định lượng cho MIT 3,992 µg/g cho MCT 11,52 µg/g mẫu khăn ướt nước giữ ẩm theo phương pháp xử lý mẫu quy trình 3.3 Áp dụng kiểm tra mẫu mỹ phẩm Áp dụng quy trình HPLC xây dựng để định lương số chế phẩm dầu gội, khăn ướt, nước giữ ẩm thị trường Hà Nội Thu kết bảng 3.15 Đề tài tiến hành kiểm tra 26 mẫu mỹ phẩm có: 07 nước giữ ẩm, 13 mẫu dầu gội, 06 mẫu khăn ướt phương pháp HPLC xây dựng Kết cho thấy: mẫu (02, 08,18) có giới hạn MIT vượt giới hạn, mẫu (21) có MCT vượt giới hạn mẫu (15) có MIT MCT vượt giới hạn cho phép 51 Bảng 3.15 Kết khảo sát MIT, MCT số mẫu mỹ phẩm thị trường STT Tên MCT MIT (µg/g) (µg/g) 01 Sữa tắm lileboy 02 Khăn ướt tẩy trang tinh chất cam tươi 03 Giấy ướt NuFresh táo hương táo 04 Khăn ướt RosyAloe vera 05 Khăn ướt Ezy 06 Khăn ướt Nuna 2,47 07 Dầu gội Nuwell Green tea 95,8 08 Dầu gội clear men 105,9 09 Dầu gội Dove 10 Dầu gội Tresemme 11 Dầu tắm gội Pigeon 12 Sữa tắm gội toàn thân Gohnson’s baby 13 Nước CBDA Yves Rocher 14 Nước hoa hồng Yves Rocher 15 Kết luận 48,5 3,47 85,5 Quá giới hạn 36,0 5,07 10,94 Khăn ướt tẩy trang tinh chất lô hội 14,8 80,2 16 Dầu tắm gội (Kodomo hair & body wash) 2,89 0,94 17 Dầu tắm gội Septona 18 Dầu tắm gội dịu nhẹ cho bé Evoluderm 19 Dầu tắm gội hạnh nhân Cadum bebe 20 Nước hoa hồng trắng sáng da White perfect 21 Dầu tắm gội toàn thân dành trẻ em aquavera 22 Nước hoa hồng dưỡng trắng da Nevia 23 Nước hoa hồng không cồn Laser precision 3,13 24 Nước hoa hồng Evoluderm lotion tonique 22,39 25 Dầu gội đầu thái dương 26 Khăn ướt Luck-lady 16,3 9,13 52 Quá giới hạn Quá giới hạn 117,5 Quá giới hạn 2,64 Quá giới hạn 2,96 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Về chất bảo quản Methylisothiazolinon Methylcloroisothiazolinon Methyisothiazolinon (MIT) với Methylchloroisothiazolinon (MCT)có khả tan tốt nước, hạn chế phát triển vi sinh vật, hiệu lực cao phối hợp MCT với MIT theo tỷ lệ 3:1 Chính MIT, MCT sử dụng nhiều lĩnh vực khác có sử dụng mỹ phẩm đặc biệt sản phẩm có thành phần lớn nước dầu gội đầu, khăn ướt, nước giữ ẩm Tuy nhiên, MIT, MCT có tác động có hại tới môi trường hệ sinh thái sức khỏe người Tác động có hại hay gặp phản ứng dị ứng Để hạn chế ảnh hưởng có hại này, Mỹ, Châu Âu, hệ thống hòa hợp mỹ phẩm ASEAN có quy định giới hạn hàm lượng MIT, MCT sử dụng mỹ phẩm Việt Nam, Ngày 13/4/2015 cục Quản lý dược có quy định cụ thể công văn 6577/QLDMP: Các chất bảo quản Methylisothiazolinon (MIT) hỗn hợp Methylisothiazolinon với Methylchloroisothiazolinon (MCT + MIT) (tham chiếu 39, 57 Annex V) theo tỷ lệ 3:1 sử dụng sản phẩm rửa (rinse-off products) với nồng độ không 0,01% (100ppm) 0,0015% (15ppm); Hỗn hợp MCT + MIT theo tỷ lệ 3:1 có thêm MIT không sử dụng sản phẩm mỹ phẩm Tuy nhiên, nước ASEAN chưa có phương pháp để định tính, định lượng MIT, MCT Cần thiết phải có phương pháp để kiểm tra MIT, MCT mỹ phẩm Trên sở đề tài tiến hành 4.2 Về phƣơng pháp nghiên cứu Qua tài liệu nghiên cứu để định tính, đạnh lượng MIT, MCT dùng phương pháp sắc ký khí GC–MS sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Trong phương pháp GC–MS cần điều kiện tiến hành phức tạp, yều cầu trình xử lý mẫu khó Phương pháp HPLC đơn giản hơn, có độ nhạy, đặc hiệu cao, phù hợp với điều kiện đa số phòng thí nghiệm Việt Nam nên lựa chọn phương pháp nghiên cứu HPLC 4.2.1 Về phương pháp xử lý mẫu 53 Mỹ phẩm loại hàng hóa đặc biệt, phong phú, nhiều dạng, thành phần mỹ phẩm phức tạp thường trước Quá trình tách chiết, xử lý mẫu mỹ phẩm phụ thuộc nhiều vào dạng mỹ phẩm Dựa vào hướng dẫn sau nghiên cứu tài liệu, lựa chọn xử lý mẫu sau: cho dung môi chiết mẫu vào bình có mẫu thử, lắc siêu âm 20 phút cho tan, làm nguội vòi nước chảy, lọc qua giấy lọc, mẫu phức tạp dầu gội đầu tiến hành lắc siêu âm, làm lạnh nước đá, ly tâm lọc qua giấy lọc Thông thường phương pháp HPLC dung môi chiết pha động ảnh hưởng đến sắc ký, để tăng khả bảo quản, giảm phân hủy hoạt chất lựa chon dung môi chiết Methanol Mặt khác, MIT MCT chất bảo quản, nồng độ sử dụng nhỏ không xác định trước, quy trình xử lý mẫu đề tài đưa áp dụng nồng độ giới hạn chúng mỹ phẩm có tính chất thăm dò tạm thời nồng độ MIT, MCT mẫu thử định lượng Lượng dung môi chiết sử dụng thay đổi tùy thuộc vào mẫu thử sau xác định sơ trước nồng độ MIT, MCT có mẫu để đưa nồng độ phân tích vào khoảng nồng độ khảo sát 4.2.2 Về xây dựng quy trình phân tích Xây dựng quy trình phân tích mỹ phẩm phức tạp, tiến hành dựa mẫu chuẩn mà quy trình bị ảnh hưởng nhiều mẫu Vì xây dựng quy trình bước đầu tiến hành vào mẫu thử phải có thay đổi để phù hợp với mẫu khác Trong mẫu có nhiều chất chưa xác định trước (có chất ghi nhãn chất không ghi) gây khó khăn trình xây dựng quy trình phân tích Thậm chí mẫu, quy trình phân tích phải thay đổi theo nhà sản xuất khác Trong trình thực nghiệm, có chất mẫu có thời gian lưu dài (lên đến 200 phút với mẫu dầu gội đầu, 120 phút với mẫu khăn ướt, nước giữ ẩm), chất thời gian chạy sắc ký không đủ, không rửa giải ảnh hưởng tới mẫu thử sau nên thời gian phân tích thực tế mẫu thử dài nhiều so với 54 thời gian quy trình phân tích xây dựng mẫu chuẩn Từ vấn đề xây dựng chương trình sắc ký để định tính định lượng MIT, MCT mẫu dầu gội đầu, khăn ướt, nước giữ ẩm sau: - Cột Phenomenex C8, µm (250 mm x 4,6 mm) - Pha động: + ) Mẫu dầu gội đầu: Methanol- Nước (10:90) + ) Mẫu khăn ướt, nước giữ ẩm: Methanol- Nước (30:70) - Bước sóng: 274 nm - Tốc độ dòng: ml/ phút - Thể tích tiêm: +) Mẫu dầu gội đầu: 50 µl +) Mẫu khăn ướt, nước giữ ẩm: 20 µl - Dung môi pha mẫu: Methanol Lưu ý rằng, quy trình phân tích nêu quy trình mà sau thực nghiệm thấy áp dụng cho phần lớn sản phẩm dầu gội đầu, khăn ướt, nước giữ ẩm nhiên phân tích quy trình thay đổi để phù hợp với mẫu thử cần kiểm nghiệm 4.2.3 Về thẩm định phương pháp Do MIT, MCT chất bảo quản xác hàm lượng nên để thẩm định phương pháp chủ yếu thực mẫu tự tạo Nồng độ khảo sát MIT, MCT nhỏ lượng chuẩn thêm vào đến µg, với lượng nhỏ chúng cân cho mẫu nên lượng hoạt chất thêm vào cách thêm thể tích tính toán dung dịch chuẩn MIT, MCT Mặc dù tiến hành nồng độ thấp kết thu cho thấy phương pháp đáp ứng yêu cầu định tính, định lượng đồng thời MIT, MCT mẫu dầu gội đầu, khăn ướt, nước giữ ẩm Cụ thể: Độ thích hợp hệ thống: Độ lặp lại tốt với RSD thời gian lưu 1,0 % diện tích pic %; số đĩa lý thuyết 2000; hệ số bất đối nhỏ 1,4 độ phân giải 55 Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ mẫu tự tạo: pic chất cần phân tích tách hoàn toàn khỏi pic khác Sắc ký đồ mẫu trắng, dung dịch mẫu placebo không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn Hệ số chồng phổ UV-VIS pic hoạt chất cần phân tích thu sắc ký đồ dung dịch mẫu tự tạo với pic tương ứng sắc ký đồ dung dịch chuẩn >0,99 Độ tuyến tính: Hệ số tương quan nồng độ diện tích pic chất MIT, MCT có r ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995), hệ số y-intercept 2%, nhiên quy trình phân tích chất có nồng độ nhỏ mẫu phức tạp nên kết tốt, chấp nhận Gới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: Vì mẫu phức tạp xác định LOD, LOQ theo phương pháp pha loãng Kết quả: Bảng 4.1 Gới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng MIT Dầu gội đầu MCT LOD (µg/g) LOQ (µg/g) LOD (µg/g) LOQ (µg/g) 0,33 1,32 0,96 3,84 2.88 11,52 Khăn ướt, nước 0,998 3,992 giữ ẩm 4.3 Về kiểm tra mẫu mỹ phẩm Đề tài tiến hành kiểm tra 26 mẫu mỹ phẩm có: 07 nước giữ ẩm, 13 mẫu dầu gội, 06 mẫu khăn ướt phương pháp HPLC xây dựng Kết cho thấy: mẫu (02, 08,18) có giới hạn MIT vượt giới hạn, mẫu (21) có MCT vượt giới hạn mẫu (15) có MIT MCT vượt giới hạn cho phép Một điều đáng ý có sản phẩm không ghi có MIT, MCT nhãn trình kiểm tra phát có Còn số mẫu có thành phần MIT, MCT nhãn kiểm tra lại không phát thấy 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài hoàn thành mục tiêu đặt ra: - Xây dựng phương pháp, định tính định lượng đồng thời Methylchlorothiazolinon Methylchloroisothiazolinontrong số dạng mỹ phẩm (dầu gội, khăn ướt, nước giữ ẩm) với phương pháp phân tích áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với Detector tử ngoại – khả kiến mảng diod - Áp dụng phương pháp xây dựng để định tính, định lượng Methylchlorothiazolinon Methylchloroisothiazolinontrong số mỹ phẩm lưu hành thị trường (03 mẫu dầu gội đầu, khăn ướt, nước giữ ẩm Cụ thể: Xây dựng quy trình phân tích: - Cột Phenomenex C8, µm (250 mm x 4,6 mm) - Pha động: + ) Mẫu A đầu: Methanol- Nước (10:90) + ) Mẫu khăn ướt, nước giữ ẩm: Methanol- Nước (30:70) - Bước sóng: 274 nm - Tốc độ dòng: ml/ phút - Thể tích tiêm: +) Mẫu dầu gội đầu: 50 µl +) Mẫu khăn ướt, nước giữ ẩm: 20 µl - Dung môi pha mẫu: Methanol Thẩm định phương pháp: độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ xác, độ đúng, khoảng tuyến tính Kết thu cho thấy phương pháp đáp ứng yêu cầu định tính, định lượng đồng thời MIT, MCT mẫu dầu gội đầu, khăn ướt, nước giữ ẩm Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp là: 57 MIT Dầu gội đầu Khăn ướt, nước giữ ẩm MCT LOD (µg/g) LOQ (µg/g) LOD (µg/g) LOQ (µg/g) 0,33 1,32 0,96 3,84 0,998 3,992 2.88 11,52 Áp dụng số chế phẩm dầu gội đầu, khăn ướt, nước ẩm thị trường: Kết kiểm tra cho thấy 26 mẫu mỹ phẩm kiểm tra có mẫu (02, 08,18) có giới hạn MIT vượt giới hạn, mẫu (21) có MCT vượt giới hạn mẫu (15) có MIT MCT vượt giới hạn cho phép Một số đề nghị: - Áp dụng phương pháp vừa xây dựng để tiến hành kiểm tra định tính, định lượng Methylchlorothiazolinon Methylchloroisothiazolinon sản phẩm mỹ phẩm - Tiếp tục mở rộng nghiên cứu quy trình mẫu mỹ phẩm khác dựa vào sở 03 mẫu nghiên cứu - Qua kiểm tra số mỹ phẩm thị trường, số lượng tỷ lệ có mặt MIT, MCT tương đối lớn có sản phẩm không đạt yêu cầu cần tăng cường kiểm tra, kiểm soát chất lượng mỹ phẩm nhằm phòng tránh tác hại đến người tiêu dùng, đặc biệt thời điểm mà việc kinh doanh mỹ phẩm phát triển mạnh 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Tử An (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 13-80, 249-275, 311-317 ASEAN (2003), Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm, Bản dịch Cục quản lý Dược, 2008 Bộ Y tế, (Cục Quản lý dược Việt Nam), (2015), Công văn số 6577/QLD-MP việc cập nhật qui định chất dùng mỹ phẩm, ngày 13/4/2015 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 5, Các kỹ thuật sắc ký Bộ Y tế (2011), Thông tư 06/2011/TT-BYTBộ trưởng Bộ Y tế qui định Quản lý mỹ phẩm, ngày 25 tháng năm 2011 Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn ASEAN thẩm định quy trình phân tích, Phụ lục – Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định đăng ký thuốc Chính phủ (2004), Nghị định số 179/2004/NĐ-CP Chính phủ qui định quản lý nhà nước chất lượng hàng hóa, ngày 21/10/2004 Lê Thị Hường Hoa (2013), Nghi n cứu x y dựng quy tr nh phát xác định hàm lượng số chất bị cấm sử dụng mỹ phẩm, luận án tiến sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội 10 Phạm Luận (2013), Xử lý mẫu phân tích, Đại học quốc gia Hà Nội 11 Hồ Viết Quý (2009), Các phương pháp ph n tích công cụ hóa học đại, NXB đại học Sư phạm, Hà Nội, 203-217 12 Hoàng Thanh Tâm (2008), Xây dựng phương pháp phát số chất thuộc nhóm glucocorticoid trộn trái phép mỹ phẩm, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội 13 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, Tài liệu đào tạo Tài liệu tiếng Anh 14 ASEAN (2008), ASEAN Cosmetic Document 3rd Printed in Thailand by The Thai Cosmetic Manufacture Association 15 ASEAN (2013), ACTLC, Draft of ASEAN Guideline on Analytical Method Validation: Inter-laboratory Study 16 AOAC (1998), Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA 17 Amparo Salvador and Alberto Chisvert, “Analysis of Cosmetic Products”, Elsevier Science (2007), 4-53, 141-185 18 BP 2010, Validation of Analytical Procedures Supplementary Chapter III E Printed in the United Kingdom by The Stationery Office, N5977690 C34 8/2009 19 Chatzizacharias NA, Kouraklis GP, Theocharis SE, “Disruption of FAK signaling: a side mechanism in cytotoxicity”, Toxicology 2008 Mar 12;245(12) 20 Christina L Burnett’, Wilma F Bergfeld, Donald V Belsito, Curtis D Klaassen, PhD James G Marks Jr, Ronald C Shank, Thomas J Slaga, Paul W Snyder, F Alan Andersen, “Final Report of the Safety Assessment of Methylisothiazolinone”, International journal of Toxicology 29(Supplement 3) lB7S-2l3S 21 Du S, McLaughlin B, Pal S, Aizenman E, “In vitro neurotoxicity of methylisothiazolinone, a commonly used industrial and household biocide, proceeds via a zinc and extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase-dependent pathway”, J Neurosci 2002 Sep 1;22(17):7408-16 22 D.s.Orth, C.m Lutes, S.r.Milstein, and Allinger , “Determination of shampoo preservative stability and apparent activation energies by the linear regression method of preservativefficacy testin”, Cosmet Chem., 38, 307-319 (September/October 1987) 23 David M Bliesner (2006), Validating Chromatographic Methods, Wileyinterscience, A John Wiley & Sons, inc., Publication 24 European Commission; The scientific committee on cosmetic products and non food products intended for consumers Opinion concerning Methylisothiazoline (2003); Available from, as of June 26, 2014 25 European Commission, “Scientific Committee on Consumer Safety opinion on the mixture of 5-chloro-2-methylisothiazolin-3(2H)-one and 2- methylisothiazolin-3(2H)-one”, The SCCS adopted this opinion at its 5th plenary meeting of December 2009 26 Environmental Protection Agency, “Methylisothiazolinone”, EPA-738-F-98008, October 1998 27 Environmental Protection Agency, “Survey and Exposure Assessment of Methylisothiazolinone in Consumer Products”, Survey of chemical substances in consumer products No 134, 2015 28 Faculty of health sciences university of copenhagen denmark, Methylisothiazolinone: Contact Allergy and Antimicrobial Efficacy 29 Geier J, Lessmann H, Schnuch A, Uter W, “Recent increase in allergic reactions to methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone: is methylisothiazolinone the culprit”, Contact Dermatitis 2012 Dec;67(6):334-41 30 ICH Topic Q2B (1996), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology 31 Irena Baranowska, Iwona Wọciechowska, “The determination of preservaties in costetics and Environmental water by HPLC”, Polish Journal of Environmental Studies;2013, Vol 22 Issue 6, p1609 32 J.Bella (2006) "Comparative toxicity of alternative antifouling biocides on embryos and larvae of marine invertebrates" Sci Total Environ 367 (2–3): 573– 85 33 Jette Rud Larsen, “Trine Thorup Andersen, Survey of liquid hand soaps, including health and environmental assessments”, Survey of Chemical Substances in Consumer Products, No 69 2006 58-59 34 Kerem Yazar, Stina Johnsson, Marie-Louise Lind, Anders Boman and Carola Liden´, “Preservatives and fragrances in selected consumer-available cosmetics and detergents”, Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institutet, SE171 77 Stockholm, Sweden 35 Ludwig Huber, (2010), Validation of Analytical Methods Printed by Agilent Technologies 36 Larisa Borisova-Jan, Stefan Jönsson, Dick Fransson, Monica Tammela, Monika Johansson , Screening procedure for determination of preservatives in commercial skin-care products , 2011-10-06 37 Michael E Swartz (1997), Analytical Method Development And Validation, Marcel Dekker, INC Publication 38 Rohm and Haas, Toxicology Department, “Evaluation of the toxicity of Kathon biocide,” August, 1984 39 Rhys Jones, Lee Williams, Katie-Jo Teehan, Helen Lodder, Alan Edgington, Adam Senior, Geoff Davies, Steve Jordan, Claire Desbrow, Paul Roberts, Victor Vandell, Elena Gairloch, “Evaluation of Methylisothiazolinone (MI) Extraction from Sunscreen using Supported Liquid Extraction prior to GC/MS Analysis”, biotage (2015) 40 S.C Rastogi, H.Jensen, R.petersen, “Preservative in skin creams”, NERI technical report, No.297, 1999 41 Shimadzu: Application Note A Simple HPLC Method for the Detection of Preservatives in Inks http://www.ssi.shimadzu.com/products/literature/pathfinder/Appl_PF_Ink_Pres ervatives_06F_en.pdf 42 USP 34/ NF 29 (2011) Validation of Compendial Procedure Printed in the United States by United Book Press, Inc., Baltimore, MD 43 Wang Ping,LI Jie,Zheng He-hui, “Determination of 22 preservatives in cosmetics by ultra performance liquid chromatography”, Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2009-06 44 Xiao Zhou, Xiaolan Li, Zhiyan Chen, Changwen Ye, Yun Zhou, Dongling Meng, “Quantitative determination method for methylisothiazolinone and chloro methyl isothiazolinone in water-based adhesive”, Chinese journal of chromatography2015 Jan;33(1):75-9 [...]... hn so vi MIT v MCT li cú kh nng gõy d ng cao hn vỡ vy MCT khụng c dựng n c trong m phm v cỏc sn phm chm súc sc khe cỏ nhõn m thng kt hp vi MIT vi t lMCT:MIT (3:1) Hn hp ny c s dng rng rói trong m phm, cỏc sn phm chm súc cỏ nhõn v c trong trong cụng nghip thay th cho MIT v MCT dựng n c MCT dựng n c ch yu trong cụng nghip khụng c dựng trong m phm[22][25][29] 1.2.2.4.nh hng n ngi s dng: Liu c LD50 chut:... vi t l s dng trong cỏc sn phm ln lt l 41%, 39%, 34%, 25%, vimethylchloroisothiazolinonehoc hn hp methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone (MCT / MIT) thỡ cú t l s dng trong cỏc sn phm l 22% [34] Nhng lý do trờn cho thy tớnh cp thit v vic kim tra, kim soỏt cỏc cht bo qun s dng trong cỏc sn phm khỏc núi chung v trong m phm núi riờng 1.2 Cỏc cht bo qun nghiờn cu trong ti 1.2.1 Methylisothiazolinon. .. tan tt trong nc nờn thng s dng trong cỏc m phm nh kem dng m, chng nng, sa ra mt, kem dng da, du gi u, sa tm, ngoi ra MIT cũn s dng trong mt s sn phm chm súc cỏ nhõn nh nc sỳc ming, kem ỏnh rng, giy t cho tr em[26] Trong cụng nghip: Methylisothiazolinone c s dng kim soỏt cht nhn hỡnh thnh do vi khun, nm v to trong sn xut bt giy v giy, trong h thng lm mỏt nc, s dung cỏc hot ng khai thỏc du, trong h... 1,5% an Mch (37 trong 2536 bnh nhõn c th nghim da liu) Tuy nhiờn, trong giai on 2010-2013, t l bnh nhõn an Mch d ng vi MIT tng 6 lờn ỏng k 2,0% trong nm 2010, 3,0% nm 2011, 3,7% trong nm 2012 (2766 bnh nhõn da liu th nghim ti an Mch) v n nm 2013 l 5,7% c, trong cựng thi gian, t l tng t 1,9% nm 2009 lờn 4,4% trong nm 2011 (da trờn 21.274 bnh nhõn da liu) T l Phn Lan l 1,4% v 0,6% trong s 10.821 da... ether): 281 nm ; ( trong ethanol 95%): 275 nm [24][25][33] 1.2.1.3.ng dng: Methylisothiazolinonl mt cht thuc nhúm isothiazoline ó c ng ký u tiờn ti M vo nm 1977 nh l mt khỏng sinh vi nhiu mc ớch s dng khỏc nhau MIT cú tỏc dng dit khun, tan tt trong nc nờn c ng dng nhiu lm cht bo qun trong m phm, sn phm chm súc cỏ nhõn trong cụng nghip v nụng nghip[26] Trong m phm: MIT c phộp s dng trong m phm, nhng... nghiờn cu ti Xõy dng phng phỏp nh tớnh nh lng ng thi Methylisothiazolinonv Methylcholoroisothiazolinon trong m phm vi cỏc mc tiờu sau: 1 Xõy dng phng phỏp nh tớnh nh lng ng thi Methylisothiazolinon v Methylcholoroisothiazolinontrong mt s dng m phm (du gi, khn t, nc gi m) 2 p dng phng phỏp ó xõy dng nh lng Methylisothiazolinon v Methylcholoroisothiazolinontrong mt s m phm ang lu hnh trờn th trng 2 Chng... tt trong nc, acetonitril, methanol ớt tan trong xylen tan c th trong mt s dung mụi: - Trong nc:>100g/100ml (200C), 5367 g/l (250C) - Trong m : >574.6 g/l (pH 5), >489.0 g/l (pH 9) - Acetonitril:> 78,76g/100ml (200C) - Methanol:>79,1g/100ml (200C) - Ethyl acetate : 562 g/l (100C), 688 g/l (300C) - Hexane : 0.93 g/l (100C), 2.4 g/l (300C) 4 Nhit núng chy: 47,480C, nhit sụi: 2370C hp th: UV max ( trong. .. Methylchloroisothiazolinone vi Methylisothiazolinone (MCT + MIT) (tham chiu 39, 57 Annex V) theo t l 3:1 ch c s dng trong cỏc sn phm ra sch (rinse-off products) vi nng khụng quỏ 0,01% (100ppm) v 0,0015% (15ppm) Hn hp MCT + MIT theo t l 3:1 v cú thờm MIT thỡ khụng c s dng trong snphm m phm Thi hn ỏp dng quy nh i vi Methylisothiazolinone (MIT) v hn hpMethylchloroisothiazolinone vi Methylisothiazolinone (MCT... ng: Dung mụi A l axid o-phosphoric 0,1% trong nc; dung mụi B l methanol Chy theo Gradient sau õy: 1% B , 99% A liờn tc trong 10 phỳt, A gim ti 49% trong 30 phỳt tip theo, sau ú gim n 10% trong 1 phỳt, duy trỡ trong 9 phỳt Cõn bng trc khi tiờm tip theo l 16 phỳt - Tc pha ng: 1 ml/phỳt, - Th tớch tiờm 20 àl, - Nhit ct: nhit mụi trng Phng phỏp 4: nh lng MIT v MCT trong du gi[22].iu kin sc ký: - Ct sc... Trong sc ký lng hiu nng cao, mu phõn tớch c tiờm qua bung tiờm v c i vo ct nh pha ng, cỏc thnh phn trong mu phõn tớch c tỏch ra trờn 14 pha tnh cha trong ct ri i qua detector phỏt hin v cho cỏc tớn hiu c ghi trờn sc a Pha tnh trong sc ký lng : Pha tnh hay dựng nht trong sc ký lng hiu nng cao l pha tnh m trong ú cỏc nhúm silanol trờn b mt ht silicagel (cht mang) ó c liờn kt vi cỏc nhúm húa hc khỏc nhau