MỞ ĐẦU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN T[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bầy tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau Đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô, anh chị Bộ mơn Hóa Phân tích- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Bộ mơn Hóa Phân tích & Độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập làm thực nghiệm Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân ln động viên, khích lệ, giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012 Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu thuốc điều trị HIV 1.2 Tình hình sử dụng thuốc HIV Việt Nam giới 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 1.3.1.Các phương pháp sắc ký 1.3.2.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) 1.4 Giới thiệu chung phương pháp điện di mao quản 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản .9 1.4.2 Thiết bị phương pháp điện di mao quản 10 1.4.3 Các trình xảy mao quản .11 1.4.4 Sự phân loại hay kiểu (mode) phương pháp điện di mao quản 12 1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) .12 1.4.6 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 13 1.4.7 Phân tích định lượng theo điện di mao quản 23 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Đối tượng nghiên cứu .24 2.1.1 Điều kiện nghiên cứu 24 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Nội dung nghiên cứu .26 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC,NVP AZT 29 3.1.1 Chọn bước sóng phát chất 29 3.1.2 Mao quản xử lý mao quản 31 3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu 32 3.1.4 Độ điện di độ điện di hiệu dụng .33 3.1.5 Lựa chọn chế tách 34 3.1.6 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di 36 3.1.7 Ảnh hưởng thành phần dung dịch đệm 39 3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất tạo mixen SDS 39 3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm 41 3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu .43 3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng điện di 45 3.1.12 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mao quản 46 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ưu 47 3.1.14 Định tính 3TC, AZT NVP điều kiện điện di thiết lập 47 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 50 3.2.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống .50 3.2.2 Tính đặc hiệu 50 3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 52 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 56 3.2.5 Độ lặp lại phương pháp 57 3.2.6 Độ phương pháp 58 3.2.7 Kết định lượng chế phẩm 61 3.3 Ưu nhược điểm phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 63 3.4 Hướng phát triển đề tài .64 KẾT LUẬN .65 DANH MỤC CÁC BẢNG STT bảng Tên bảng Trang 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng MEKC 19 3.1 Tổng kết điều kiện điện di tối ưu 47 3.2 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 49 3.3 Diện tích pic điện di đồ nồng độ 3TC tương ứng 52 3.4 Diện tích pic điện di đồ nồng độ AZT tương ứng 54 3.5 Diện tích pic điện di đồ nồng độ NVP tương ứng 55 3.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 57 Kết xác định độ lặp lại MEKC định lượng 3TC Kết xác định độ lặp lại MEKC định lượng AZT Kết xác định độ lặp lại MEKC định lượng NVP Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn 3TC Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn AZT Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn NVP 57 3.13 Kết định lượng viên nén Avocomb-N 61 3.14 Kết định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 62 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 58 58 59 60 60 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 11 1.2 Quá trình tách chất CZE 13 1.3 Cấu trúc Mixen dịng EOF MEKC 15 1.4 Cấu trúc khơng gian β- cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 22 3.1 Phổ hấp thụ 3TC, AZT NVP 31 3.2 Khảo sát chế tách CZE, MEKC 35 3.3 Điện di đồ pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17 37 3.4 Điện di đồ nồng độ SDS 25mM; 50mM 75mM 40 3.5 Điện di đồ nồng độ đệm 5mM; 10mM 20mM 42 3.6 Điện di đồ thời gian bơm mẫu 3s, 5s 7s 44 3.7 Điện di đồ điện di 15kV; 20kV 22 kV 46 3.8 Điện di đồ 3TC, AZT NVP điều kiện tối ưu 48 Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP điều kiện tối ưu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm 3TC điều kiện tối ưu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm AZT điều kiện tối ưu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm NVP điều kiện tối ưu 48 3.13 Điện di đồ mẫu trắng 51 3.14 Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP 51 3.9 3.10 3.11 3.12 49 49 49 Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT NVP 51 Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT NVP thêm hỗn hợp chuẩn Đường chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ 3TC Đường chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ AZT Đường chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ NVP 52 3.20 Điện di đồ viên nén Avocomb-N 62 3.21 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 63 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 53 54 55 DANH MỤC VIẾT TẮT ARV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người (Acquired immunodeficiency syndrome) Thuốc kháng virut USP Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea) CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) HIV AIDS CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography) CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) EOF Spic Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow) Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic chromatography) Diện tích pic tm Thời gian di chuyển (Migration times) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) HPLC MEKC RSD % Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự AZT Zidovudine LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantity) NVP Nevirapine D4T Stavudine 3TC Lamivudine MỞ ĐẦU Theo phân tích chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV tiếp tục trì sống ngày tăng cao hệ hai tác động chủ yếu Một số người nhiễm HIV hàng năm toàn cầu mức cao Chỉ tính riêng năm 2008, giới có khoảng 2,7 triệu người nhiễm HIV Hai kết tích cực liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số người tử vong, kéo dài sống cho người bệnh Đến tháng 12/2008 ước tính khoảng triệu người nhiễm HIV nước có thu nhập thấp trung bình điều trị thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần vòng năm Trong vịng năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết AIDS giảm 10% [12] HIV/AIDS vấn đề lớn giới Việt Nam Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS (Sau Hội An, An Giang, Hải Phịng, Quảng Ninh, ) Chúng ta khơng ngăn chặn lây lan bệnh mà điều trị hiệu để giảm nguy tử vong kéo dài cải thiện chất lượng sống cho người HIV/AIDS Trong điều trị kháng Retrovirut đóng vai trị lớn Trước nước ta chưa đầy đủ loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa phối hợp hai loại thuốc điều trị HIV/AIDS Giờ kết hợp loại thuốc trường hợp lâm sàng nặng Hiện nay, nước ta sản xuất thuốc chống HIV Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg) Tuy nhiên phần lớn sử dụng thuốc kháng HIV theo chương trình quốc gia cấp [12] Để đảm bảo điều trị, an toàn sử dụng, việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV cần thiết Vì cần có phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV Cho tới sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích hóa lý đa số sử dụng để định lượng loại thuốc Ưu điểm phương pháp độ lặp lại, độ xác khả tách tốt Đồng thời thiết bị HPLC ... NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC... quản lý chất lượng thuốc nước ta Từ phân tích trên, tiến hành nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài: ? ?Xây dựng phương pháp định lượng số hoạt. .. (mode) phương pháp điện di mao quản 12 1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) .12 1.4.6 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 13 1.4.7 Phân tích định lượng theo điện di mao