Luận văn thạc sĩ định lượng một số hoạt chất nhóm silymarin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ THU HẰNG ĐỊNH Ư NG ỘT TRONG TH C PH ẮC K HOẠT CH T NH I Y ARIN CH C N NG BẰNG PHƯ NG PHÁP ỎNG HI U N NG CAO HPLC) Chuyên ngành: Kỹ thuật Hoá học UẬN V N THẠC Ĩ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ THU HẰNG ĐỊNH Ư NG ỘT TRONG TH C PH ẮC K HOẠT CH T NH I Y ARIN CH C N NG BẰNG PHƯ NG PHÁP ỎNG HI U N NG CAO HP C Chuyên ngành: Hoá học UẬN V N THẠC Ĩ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: T Ê HUYỀN TRÂ PGS TS Ê THỊ HỒNG HẢO Hà Nội – 2017 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Lê Huyền Trâm PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Học viên Nguyễn Thị Thu Hằng i Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia Để hoàn thành luận văn Thạ s ho h n n ạnh cố gắng ph n đấu th n nhận đƣợc động vi n v giúp đỡ lớn nhiều tập thể v nh n Trƣớc hết tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn s u sắc tới TS Lê Huyền Tr m (Trƣờng Đại h c Bách Khoa Hà Nội) tiếp nhận tận tình hƣớng dẫn, góp ý v động viên tơi suốt qua trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS L Thị Hồng Hảo (Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia) cán Khoa Nghiên cứu thực phẩm hƣớng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian h c tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Viện Đ o tạo S u đại h thầy, cô giáo Viện Kỹ thuật Hoá h c Trƣờng Đại h c Bách khoa Hà Nội đ o tạo v giúp đỡ suốt thời gian h c tập trƣờng Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gi đình ngƣời thân bạn è nhiệt tình giúp đỡ động viên tơi suốt q trình thực đề tài Xin trân tr ng cảm ơn! Hà nội, ngày 15 tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thu Hằng ii Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỨ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung h Cúc (Asteraceae) 1.2 Cây Kế sữa (Silybum marianum) 1.2.1 Đặc điểm thực vật học 1.2.2 ông d ng c y ế s a 1.3 Các hoạt chất nhóm Silymarin từ Kế sữa 1.3.1 Cấu trúc tính chất số hoạt chất nhóm silymarin 6 1.3.2 Hoạt tính sinh học dược động học hoạt chất nhóm Silymarin 10 1.3.3 Một số thực phẩm chức chứa nhóm Silymarin thị trường 13 1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phân tích Silymarin TPCN 15 1.4 Một số phƣơng ph p ph n tí h Silymarin 15 1.4.1 Phương pháp quang phổ hấp th phân tử (UV-VIS) 16 1.4.2 Phương pháp điện di mao quản (CE) 17 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng –khối phổ (LC-MS) 18 1.4.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 19 1.4.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPL ) 21 1.5 Một số kỹ thuật xử lý mẫu phân tích Silymarin 23 1.5.1 Kỹ thuật chiết hồi lưu (reflux) 23 1.5.2 Kỹ thuật chiết Soxlet (Shoxhlet extraction) 24 1.5.3 Kỹ thuật chiết kết hợp vi sóng (MAE) 25 1.5.4 Kỹ thuật chiết kết hợp siêu âm (UAE) 25 1.5.5 Một số kỹ thuật chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction) 26 iii Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tƣợng nghi n ứu 28 2.2 Phƣơng ph p nghi n ứu 28 2.2.1 hảo sát điều kiện ph n tích Silymarin HPL 28 2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 29 2.2.3 Thẩm định quy trình 30 2.2.4 Áp d ng phân tích mẫu lấy thị trường 31 2.3 Nguyên vật liệu - thiết bị 32 2.3.1 Hóa chất, chất chuẩn 32 2.3.2 Thiết bị 32 2.4 Xử lý số liệu 33 CHƢƠNG : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Khảo sát lựa ch n 34 điều kiện phân tíchSilymarinbằng phƣơng ph p HPLC 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 37 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng, viên nén, cao khô kế s a 37 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết với viên nang mềm, cao lỏng kế s a 41 3.3 Thẩm định phƣơng ph p 44 3.3.1 Độ chọn lọc, độ đặc hiệu 44 3.3.2 Độ thích hợp hệ thống 46 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn đánh giá độ tuyến tính 47 3.3.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 52 3.3.5 Độ lặp lại phương pháp 52 3.3.6 Độ thu hồi phương pháp 54 3.4 Áp dụng phƣơng ph p HPLC x định silymarin mẫu thực tế 56 KẾT LUẬN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 iv Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu AOAC Diễn giải Acetonitril Hiệp hội nh hó ph n tí h Tiếng Anh Acetonitrile Association of Official Analytical Chemists CE Điện di m o quản Capillary Electrophoresis CYP Hệ thống enz m ACN to hrome Cytochrome Dimethylformamide DMF EtOH Etanol HPLC Sắ Ethanol ý lỏng hiệu o High Performance Liquid Chromatography HPTLC Sắ ý lớp mỏng hiệu o High Performance Thin Layer Chromatography LC- MS Sắ ý lỏng hối phổ Liquid Chromatography Mass Spectrometry LOD Giới hạn ph t Limit of Detection LOQ Giới hạn định lƣợng Limit of Quantification MAE Kỹ thuật hiết ết hợp vi sóng Microwave Assisted Extraction MeOH Metanol Methanol Mp Điểm Melting point NF-B Yếu tố phi n mã PDA Mảng diod Photo Diod Arrays RSD Độ lệ h huẩn tƣơng đối Relative Standard Deviation SD Độ lệ h huẩn Standard deviation pp Nuclear Factor-kappa B Tetrahydrofuran THF TPCN Thự phẩm UAE Kỹ thuật hiết ết hợp si u m Ultrasonic Assisted Extraction UPLC Sắ Ultra Performance Liquid ý lỏng si u hiệu Chromatography USP Dƣợ điển Ho Kỳ United States Pharmacopeia UV-VIS Qu ng phổ hấp thụ ph n tử Ultraviolet -Visible v Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tính chất vật lý số hợp chất nhóm Silymarin ảng 3.1 Chƣơng trình gr dient ph động 37 Bảng 3.2: Kết khảo sát dung moi chiết khác 38 Bảng 3.3: Kết thử nghiệm quy trình xử lý mẫu nhiều lipid 42 Bảng 3.4: Kết đ nh gi độ lặp lại chất phân tích 46 Bảng 3.5: Kết phân tích khoảng tuyến tính hợp chất nhóm Silymarin 48 ảng 3.6: Kết ph n tí h x định LOD v LOQ ủ hất 52 Bảng 3.7: Kết thẩm định độ lặp lại củ phƣơng ph p 53 Bảng 3.8: Độ thu hồi chất phân tích HPLC 54 Bảng 3.9: Kết ph n tí h h m lƣợng Silymarin số mẫu TPCN thu thập thị trƣờng Hà Nội 56 vi Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Một số hình ảnh Kế sữ (Silybum marianum L Gaertn.) Hình 1.2: Hạt kế sữa Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo Silymarin Hình 1.4: Một số loại thực phẩm hứa thành phần Kế sữa 14 Hình 1.5: Phổ hấp thụ UV-VIS Silymarin 16 Hình 1.6: Điện di đồ thu đƣợc phân tích Silymarin 17 Hình 1.7: Sắ ý đồ HPTLC hoạt chất nhóm Silymarinvà dịch chiết hạt Kế sữa (UV 366nm) 20 Hình 1.8: Mối quan hệ tƣơng đối diện tích pic chất phân tích với thời gian chiết 24 Hình 2.1: Thiết bị HPLC (Alliance – Waters) sử dụng nghiên cứu 32 Hình 3.1: Sắ đồ phân tích Silybin Isosilybin sử dụng methanol acid acetic 35 Hình 3.2: Sắ đồ phân tích Silybin Isosilybin sử dụng methanol acid phosphoric 35 Hình 3.3 Sắ đồ phân tích mẫu cao kế sữ đƣợc tiêu chuẩn hóa điều kiện tối ƣu 36 Hình 3.4: Sự tạo vịng lập thể Silibin A Isosilybin A với methanol 36 Hình 3.5: Quy trình phân tích silymarin TPCN dạng bột 39 Hình 3.6: Sắ ý đồ phân tích nhóm chất Silymarin với dung mơi chiết acetone 40 Hình 3.7: Sắ ý đồ phân tích nhóm chất Silymarin với dung mơi chiết ethanol 40 Hình3.8: Sắ ý đồ phân tích nhóm chất Silymarin với dung mơi chiết methanol 40 Hình 3.9: Sơ đồ thử nghiệm xử lý mẫu phân tích TPCN viên nang mềm 41 Hình 3.10: Quy trình xử lý mẫu phân tích TPCN viên nang mềm 43 Hình 3.11: Sắ ý đồ phân tích Silymarin viên nang mềm loại lipid n-hexan 43 Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu trắng (viên nang cứng) khơng có Silymarin Hình 3.13: Sắ ý đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp Silymarin Hình 3.14: Sắc ký đồ mẫu trắng (viên nang cứng) thêm chuẩn Silymarin Hình 3.15: Phổ hấp thụ UV (200-400nm) chất Silymarin vii 44 44 45 45 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 3.16: Sắc ký đồ ph n tí h độ lặp lại chất phân tích 47 Hình 3.17: Đồ thị v phƣơng trình đƣờng chuẩn hợp chất nhóm Silymarin 49 ý đồ phân tích hỗn hợp Silymarin 50ppm 50 Hình 3.19: Sắ ý đồ phân tích hỗn hợp Silymarin 25ppm 50 Hình 3.20: Sắ ý đồ phân tích hỗn hợp Silymarin 12,5ppm 51 Hình 3.21: Sắ ý đồ phân tích hỗn hợp Silymarin ppm 51 Hình 3.18: Sắ Hình 3.22: Sắ ý đồ phân tích hỗn hợp Silymarin 2,5 ppm 51 Hình 3.23: Sắ ý đồ phân tích hỗn hợp Silymarin 1,25ppm 51 Hình 3.24: Sắ ý đồ ph n tí h độ lặp lại mẫu viên nang cứng 53 Hình 3.25: Sắ ý đồ ph n tí h độ lặp lại mẫu viên nang mềm 54 Hình 3.26: Sắc ký đồ ph n tí h độ lặp lại mẫu bột nguyên liệu 54 Hình 3.27: Sắc ký đồ ph n tí h độ thu hồi mẫu viên nang cứng 55 Hình 3.28: Sắc ký đồ ph n tí h độ thu hồi mẫu viên nang mềm 55 Hình 3.29: Sắc ký đồ ph n tí h độ thu hồi mẫu bột ngun liệu 56 Hình 3.30: Sắc ký đồ phân tích mẫu nguyên liệu NL05 57 Hình 3.31: Sắcký đồ phân tích mẫu viên nén VN01 58 Hình 3.32: Sắc ký đồ phân tích mẫu viên nang mềm NM01 58 ý đồ phân tích mẫu viên nang cứng NC10 58 Hình 3.33: Sắ Hình 3.34: Chứng nhận phân tích mẫu cao khô Kế sữa viii 60 41.227 - 263321 0.010 32.565 - 2137215 AU 14.073 - 86251 0.020 Luận văn Thạc sĩ khoa học 18.601 - 391135 19.971 - 116485 Nguyễn Thị Thu Hằng 0.000 0.00 20.00 40.00 Minutes 32.325 - 1604511 0.010 14.058 - 64756 AU 0.015 18.557 - 355574 19.909 - 117556 0.020 0.005 40.798 - 224476 Hình 3.25: Sắc ký đồ p ân tíc đ lặp lại mẫu viên nang mềm 0.000 0.00 20.00 40.00 Minutes Hình 3.26: Sắc ký đồ p ân tíc đ lặp lại mẫu b t nguyên liệu 3.3.6 Đ thu hồi ph ng ph p Độ ủ phƣơng ph p đƣợc thể thông qu độ thu hồi Thực đ nh giá cách thêm chuẩn hỗn hợp Silymarin vào mẫu thực phẩm không chứa Sil m rin qu đ nh gi sơ ộ v x định tỷ lệ (%) thu hồi chuẩn Silymarin xử lý mẫu phân tích theo quy trình tối ƣu lựa ch n Với mẫu phân tích, thực lặp lại 06 lần tính kết trung bình Kết phân tích độ thu hồi tƣơng ứng với chất ph n tí h đƣợc mơ tả Bảng 3.8 Hình 3.25, Hình 3.26 Hình 3.27 Bảng 3.8: Đ thu hồi chất phân tích p ương p áp HPLC Ch t phân tích Taxifolin L ng thêm chu n (mg/g) 0,40 Đ thu hồi mẫu nguyên liệu (%) 101,5 Đ thu hồi Đ thu hồi mẫu mẫu mẫu viên viên nang mềm nang c ng (%) (%) 98,38 96,02 Silychristin 0,40 98,26 99,84 99,38 Silydianin 0,40 100,8 96,83 96,79 54 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Silybin 0,40 99,02 102,1 97,52 Isosilybin 0,40 97,59 97,81 98,78 Các kết bảng 3.8 cho thấ phƣơng ph p đƣợc xây dựng có giá trị độ thu hồi đạt yêu cầu AOAC [6],trong mẫu nguyên liệu ho độ thu hồi tốt s u đến mẫu viên nang cứng mẫu viên nang mềm So sánh với số nghiên cứu khác độ thu hồi củ phƣơng ph p n o so với nghiên cứu E Mudge cộng [34] nhƣng thấp chút so với nghiên cứu Mohamed A Korany cộng [32] Điều ảnh hƣởng mẫu trắng tới chất phân tích nghiêu cứu khơng giống Dƣới đ l sắ ý đồ ph n tí h độ thu hồi số mẫu đƣợc thể Hình 3.27, Hình 3.28 Hình 3.29 0.005 40.572 - 234803 32.195 - 1859809 0.010 18.527 - 347223 19.881 - 116862 AU 0.015 14.028 - 70498 0.020 0.000 0.00 20.00 40.00 Minutes 40.571 - 274674 32.174 - 2282982 0.010 18.528 - 423045 19.868 - 144398 AU 0.020 14.022 - 82437 Hình 3.27: Sắc ký đồ p ân tíc đ thu hồi mẫu viên nang cứng 0.000 0.00 20.00 40.00 Minutes Hình 3.28: Sắc ký đồ p ân tíc đ thu hồi mẫu viên nang mềm 55 41.615 - 253201 32.835 - 2066617 0.010 18.675 - 364151 20.076 - 127222 AU 0.020 Luận văn Thạc sĩ khoa học 14.173 - 74053 Nguyễn Thị Thu Hằng 0.000 0.00 20.00 40.00 Minutes Hình 3.29: Sắc ký đồ p ân tíc đ thu hồi mẫu b t nguyên liệu 3.4 Áp dụng phƣơng pháp HPCL xác định Silymarin mẫu thực tế Phƣơng ph p s u hi tối ƣu hó v thẩm định đƣợc áp dụng nhằm phân tích hàm lƣợng Silymarin 27 mẫu nguyên liệu sản phẩm TPCN thu thập ngẫu nhiên thị trƣờng Hà Nội Kết phân tí h đƣợc thể bảng 3.9 tƣơng ứng với kí hiệu loại mẫu TPCN Bảng 3.9: K t phân tích àm lượng Silymarin m t s mẫu TPCN thu thập thị trường Hà N i Nền mẫu Ký hiệu mẫu Đ n vị HL Silymarin Viên nang mềm Viên nang cứng NM01 mg/viên 14,9 NM02 mg/viên 29,6 NM03 mg/viên 32,8 NM04 mg/viên 19,7 NM05 mg/viên 10,5 NM06 mg/viên 6,64 NC01 mg/viên 11,9 NC02 mg/viên 11,1 NC03 mg/viên 126 NC04 mg/viên 12,7 NC05 mg/viên 118 NC06 mg/viên 92,5 NC07 mg/viên 121 NC08 mg/viên 76,4 56 Nguyễn Thị Thu Hằng Viên nén Nguyên liệu Luận văn Thạc sĩ khoa học NC09 mg/viên 114 NC10 mg/viên 34,5 VN01 mg/viên 64,9 VN02 mg/viên 41,5 VN03 mg/viên 116 NL01 g/100g 41,2 NL02 g/100g 8,94 NL03 g/100g 5,91 NL04 g/100g 42,6 NL05 g/100g 98,1 NL06 g/100g 49,7 NL07 g/100g 11,1 NL08 g/100g 9,35 Nhận xét: Từ kết thu đƣợc bảng 3.9 cho thấy h m lƣợng Silymarin 08 mẫu nguyên liệu d o động khoảng từ 91 g/100g đến 98,1 g/100g; 06 mẫu viên nang mềm từ 64 mg/vi n đến 32,8 mg/viên; 10 mẫu viên nang cứng từ 11 mg/vi n đến 126 mg/viên; 03 mẫu viên nén từ 41,5 mg/vi n đến 116 mg/viên Một số hình ảnh sắc ký đồ thu đƣợc phân tích mẫu TPCN thực tế hình 3.30, hình 3.31, hình 3.32 hình 3.33 Hình 3.30: Sắc ký đồ phân tích mẫu nguyên liệu NL05 57 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 3.31: Sắc đồ phân tích mẫu viên nén VN01 Hình 3.22: Sắc đồ phân tích mẫu viên nang mềm NM01 Hình 3.33: Sắc ký đồ phân tích mẫu viên nang cứng NC10 58 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Qua kết khảo s t sơ ộ nhận thấy thị trƣờng nay, số lƣợng sản phẩm TPCN chứa Kế sữa nhiều dạng viên nang cứng s u đến dạng viên nang mềm dạng viên nén Tuy nhiên, h m lƣợng Silymarin dạng mẫu bột khơ (viên nang cứng, viên nén) lại ó xu hƣớng o so với dạng mẫu chứa nhiều lipid (viên nang mềm) Điều chất Silymarin hầu nhƣ hông t n dung mơi hữu hơng ph n ực, thế, chúng hịa tan phân tán thành phần lipid viên nang mềm Một điểm cần lƣu ý l tất mẫu sản phẩm thực phẩm đƣợc khảo sát nghiên cứu n công bố thành phần Kế sữ dƣới dạng cao chiết (Milk thistle extract) nhƣng lại hƣ ông ố cụ thể h m lƣợng thành phần Silymarin Việc cơng bố thành phần cao Kế sữa có lợi so với công bố thành phần dạng Kế sữ thơ l m tăng hấp thu hoạt chất v thông thƣờng với lƣợng nhƣ nh u sản phẩm dạng cao chiết chứa nhiều hoạt chất Tu nhi n, với mứ độ d o động h m lƣợng Silymarin mẫu cao chiết Kế sữa nhƣ nghiên cứu gây hó hăn ho ngƣời tiêu dùng lựa ch n sản phẩm phù hợp để sử dụng nhà quản lý kiểm soát chất lƣợng sản phẩm Do đó, cần thiết phải cơng bố thành phần h m lƣợng hoạt chất Silymarin nhãn sản phẩm liên quan Một vấn đề khác cần qu n t m li n qu n đến sản phẩm cao Kế sữ đƣợc phát trình nghiên cứu chứng nhận phân tích (Certificate of Analysis, CoA) mẫu nguyên liệu cao khơ hạt Kế sữa (Hình 3.34) có khác biệt lớn h m lƣợng Silymarin sử dụng hai phƣơng ph p ph n tí h h nh u Trong sản phẩm này, nhà sản xuất công bố h m lƣợng Silymarin khơng nhỏ 80% (trong h m lƣợng Silybin + Isosilybin không nhỏ 30%) Kết phân tích phịng thí nghiệm nhà sản xuất cho thấy với phƣơng ph p qu ng phổ hấp thụ UVVIS hàm lƣợng Sil m rin đạt 81 1% hi sử dụng phƣơng ph p sắc ký lỏng hiệu o (HPLC) h m lƣợng Silymarin đạt 50 26% (trong h m lƣợng Silybin + Isosilybin 31,8%) 59 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 3.34: Chứng nhận phân tích m t mẫu cao khô K s a Tƣơng tự với sản phẩm cao khô Kế sữa khác, CoA ũng hông n u rõ chi tiết phƣơng ph p ph n tí h sử dụng để x định h m lƣợng Silymarin, chí có sản phẩm cơng bố chất lƣợng với kết dƣơng tính hi định tính thành phần Kế sữ Điều khơng g hó hăn hiểu nhầm cho công ty sử dụng sản phẩm cao khô Kế sữa làm nguyên liệu đầu v o để sản xuất thực phẩm v phịng thí nghiệm khác cơng tác kiểm so t v đảm bảo chất lƣợng sản phẩm từ khâu sản xuất đến lƣu thơng ti u dùng Do điều cần thiết cần thống phƣơng ph p ph n tí h Silymarin nguyên liệu Kế sữa sản phẩm TPCN 60 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu húng tiến hành nghiên cứu v thu đƣợc kết nhƣ s u: 1.Đã lựa ch n đƣợc c điều kiện sắc ký HPLC để phân tích hợp chất nhóm Sil m rin đạt hiệu cao phù hợp với nhiều phịng thí nghiệm Việt Nam: - Cột C18 S mmetr W ters (150 mm x mm; μm) v tiền cột loại; - Tố độ dòng: 1,0 mL/phút; - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL; - Detector PDA với khoảng ghi phổ từ 200nm – 400nm, định lƣợng 288 nm; - Ph động: gradient dung môi methanolvà acid phosphoric 0,1% (tetrahydrofuran 1%) Đã lựa ch n đƣợc quy trình xử lý mẫu phù hợp với đối tƣợng phân tích nhƣ mẫu dạng bột (viên nén, viên nang cứng, cao khô Kế sữa), mẫu nhiều lipid (viên nang mềm) C qu trình n đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian, hiệu cao áp dụng phịng thí nghiệm khác 3.Đã thẩm định phƣơng ph p ph n tí h theo tiêu chí AOAC: - Độ đặc hiệu độ ch n l c cao; - Đƣờng chuẩn với khoảng tuyến tính rộng từ 0,5 µg/ml đến 50 µg/ml; - Độ nhạ tốt với LOQ hoảng 12 – 24 mg/g LOQ từ – 0,8 mg/g; - Độ lặp lại v độ thu hồi đạt u ầu ủ AOAC Đã phân tích 27 mẫu cao chiết sản phẩm TPCNchứa thành phần Kế sữa thu thập ngẫu nhiên tr n địa bàn Hà Nội.Kết phân tích cho thấy phƣơng ph p HPLC l phù hợp v đ ng tin ậ để x định h m lƣợng Silymarin cao chiết sản phẩm thực phẩm 61 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT Các kết phân tích mẫu thực tế luận văn kết phân tích n đầu Cần tiếp tục triển khai phân tích nhiều mẫu nhằm đ nh gi hính xác hiệu củ phƣơng ph p Đƣ thêm qu định hoạt chất Taxifolin, thành phần Silymarin có hàm lƣợng đ ng ể dƣợc liệu ũng nhƣ nguyên liệu cao chiếtKế sữa vào phiếu chứng nhận phân tích (CoA) Cơng bố h m lƣợng hoạt chất Silymarin nhãn sản phẩm TPCN thay công bố lƣợng cao chiếtKế sữa sản phẩm Thống phƣơng ph p ph n tí h Silymarin từ nguyên liệu đến thành phẩm để thuận lợi việc kiểm so t v đảm bảo chất lƣợng sản phẩm 62 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2004), Thông tư 08/2004/TT-BYT ngày 28/3/2004 hướng dẫn việc quản lý sản phẩm thực phẩm chức Võ Văn Chi (2004) Từ điển thực vật thông d ng, NXB Khoa h c kỹ thuật (2004) Võ Văn Chi (2012) Từ điển thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Y h c, Hà Nội, tr 670 Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2007), Hóa Phân tích,Tập - Phân tích d ng c , Nhà xuất Y h c, Hà Nội, tr.173-210 Trần Tử An (chủ biên) (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y h c, Hà Nội, tr 84-110 Trần C o Sơn (2010) Thẩm định phương pháp ph n tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa h c Kỹ thuật, Hà Nội, tr.5-58 TIẾNG ANH Ludovico Abenavoli, Raffaele Capasso, Natasa Milic and Francesco Capasso (2010), Milk thistle in liver diseases: past, present, future, Phytotherapy Research, 24(10), pp 1423-143 Abouzid Sameh (2012), Silymarin, Natural Flavonolignans from Milk Thistle, Phytochemicals - A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, pp 255-272 Ahlam Elwekeel, Ahlam Elfishawy and Sameh Abouzid (2013): Silymarin content in Silybum marianum fruits at different maturity stages, Journal of Medicinal Plants Research, 7(23), pp 1665-1669 10 Amani N Shafik, Mostafa M Khodeir (2011), Improved antifibrotic effect of a combination of verapamil and silymarin in rat-induced liver fibrosis, Arab Journal of Gastroenterology, 12(3), pp 143-149 63 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học 11 iederm nn D V vří ov E L Cvak and V Kren (2014), Chemistry of silybin, Natural Product Reports, 31(9), pp 1077-1232 12 Ding T., Tian S., Zhang Z., Gu D., Chen Y., Shi Y., Sun Z (2001), Determination of active component in silymarin by RP-LC and LC/MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26(1), pp 155-161 13 Enrica B., C Benelli, and Pirona O (1992), Effect of the flavanolignans of Silybum marianum L On lipid peroxidation in rat liver microsomes and freshly isolated hepatocytes, Pharmacological Research, 25(2), pp 147-165 14 E e Ç ğd ş Seher K Sezin G Şe nem T (2011), Ultrasound-Assisted Extraction of Silymarin Components from Milk Thistle Seeds (Silybum marianum L.), 36 (6), pp 311- 318 15 Ferenci P, Dragosics B, Dittrich H, Frank H, Benda L, Lochs H, Meryn S, Base W, Schneider B(1989), Randomized controlled trial of silymarin treatment in patients with cirrhosis of the liver, Journal of Hepatology, 9(1), pp 105-113 16 Fraschini F., Demartini G., and D Esposti (2002), Pharmacology of silymarin, Clinical Drug Investigation,22(1), pp 51-65 17 Ghosh A., Ghosh Tanmoy, and S Jain (2010), Silymarin – a review on the pharmacodynamics and bioavailability enhancement approaches, Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2(10), pp 348–355 18 Hasanloo T., Kavari-Nejad Majidi E., Shams Ardakani (2008), Flavonolignan Production in Cell Suspension Culture of Silybum marianum,Pharmaceutical Biology, 46(12), pp 876-882 19 John Buckingham, V Ranjit N Munasinghe (2015), Dictionary of Flavonoid with CD-ROM, CRC Press 20 Kevin Anthony and Mahmoud A Saleh (2012), Chemical profiling and antioxidant activity of commercial milk thistle food supplements, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 4(10), pp 4440-4450 21 Kroll D.J., Shaw H.S., and Oberlies N.H (2007), Milk thistle nomenclature: why it matters in cancer research and pharmacokinetic studies, Integrative Cancer Therapies, 6, 110-119 64 Nguyễn Thị Thu Hằng 22 Kv sni F Luận văn Thạc sĩ khoa học ev R Voldři h M and Krátká J (2003), Analysis of the active components of silymarin, Journal of Chromatography A, 990(1– 2), pp 239-245 23 Lajos Nagy, Ákos Kuki, Ggy Dếk, Bernadett Biri, Miklós Nagy, Miklós Zsuga, Sándor Kéki (2011), Systematic identification of active ingredients of Silybum Marianum seed, Arad Medical Journal, XIV(2), pp 9-12 24 Lee D.Y and Liu Y (2003), Molecular structure and stereochemistry of silybin A, silybin B, isosilybin A, and isosilybin B, Isolated from Silybum marianum (milk thistle), Journal Natural Product, 66(9), pp 1171-1174 25 Liu Hong, Du Zhenxia, end Qipeng Yuan (2009), A novel rapid method for simultaneous determination of eight active compounds in silymarin using a reversed-phase UPLC-UV detector, Journal of Chromatography B, 877(32), pp 4159-4163 26 Madaus&Co (1976), Symposium on the pharmacodynamics of silymarin, Urban & Schwarzenberg, Cologne, German, pp 98-102 27 Mateen S., Tyagi A., Tyagi A, Agarwal C, Singh RP, Agarwal R (2010), Silibinin inhibits human nonsmall cell lung cancer cell growth through cellcycle arrest by modulating expression and function of key cell-cycle regulators, Molecular Carcinogenesis, 49(3), pp 247-258 28 Mayer K E., Myers R P., and S.S Lee (2005), Silymarin treatment of viral hepatitis a systematic review, Journal of Viral Hepatitis, 12(6), pp 559-67 29 Meghreji Moin A, Patel C.N (2010),Validated method for Silymarin by Spectrophotometry in Bulk drug and Pharmaceutical formulations, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2(1), pp 396-400 30 Minakhmetov R A., Onuchak L A., V.A Kurkin, E V Evdeeva and A V Volosueva (2001), Analysis of Flavonoids inSilybum marianum Fruit by HPLC, Chemistry of Natural Compounds, 37(4), pp 318-321 31 Mira Lurdes, Silva Manuela, and Manso C F (1994), Scavenging of reactive oxygen species by silibinin dihemisuccinate, Biochemical Pharmacology, 48(4), pp 753-759 65 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học 32 Mohamed A Korany , Rim S Haggag, Marwa A.A Ragab, Osama A Elmallah (2017), A validated stability-indicating HPLC method for simultaneous determination of Silymarin andCurcumin in various dosage forms, Arabian Journal of Chemistry , 10 (2), pp S1711–S1725 33 Morazzoni P and Bombardelli E (1995), Silybum marianum (Cardusmarianum), Fitoterapia, 66, pp 3-42 34 Mudge E., Paley L., Andreas Schieber and Paula N Brown (2015), Optimization and single-laboratory validation of a method for the determination of flavonolignans in milk thistle seeds by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407(25), pp 7657-7666 35 Parveen R and Ahmad S (2010), Stability-indicating HPTLC method for quantitative estimation of silybin in bulk drug and pharmaceutical dosage form, Biomedical Chromatography, 24(6), pp 639-47 36 Pepping J (1999), Milk thistle: Silybum marianum, American Journal of Health-System Pharmacy, 56(12), pp 1195-1197 37 Pilat L., Mihali C., Herman H., Popescu C., Turcus V., Ardelean A (2011), Pharmacology of Silybum marianum and its active constituents Therapeutic activity - Part 1, Jurnal Medical Aradean, XIV(2), pp 25-33 38 Quaglia M.G., Bossu E., Donati E, Mazzanti G, Brandt A (1999), Determination of silymarine in the extract from the dried silybum marianum fruits by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 19(3/4), pp 435-442 39 Radjabian T., Rezazadeh S,H and HuseiniH.F.(2008), Analysis of silymarin components in the seed extracts of some milk thistle ecotypes from Iran by HPLC, Iranian Journal of Science and Technology (Sciences), 32(2), pp 141-146 40 Saleh I.A., Vinatoru M., T.J Mason, NS Abdel-Azim, EA Aboutabl, and FM Hammouda (2015),Ultrasonic-Assisted Extraction and Conventional Extraction of Silymarin from Silybum marianum seeds; A Comparison, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 6(2), pp 709-717 66 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học 41 Shamama J., Kohli K., Mushir Ali (2011), Reassessing Bioavailability of Silymarin, Alternative Medicine Review, 16(3), pp 239-249 42 Somia Gul, Kashifa Khanum and Nusrat Mujtaba (2015), New validated method for analysis of salymarin in polyherbal formulation (aqueous extract, oral liquid and solid dosage form), Chemistry International,1(1) pp.103-106 43 Xiu-lan Cai, Dan-ni Li, Jun-qin Qiao, Hong-Zhen Lian (2009),Determination of Silymarin Flavonoids by HPLC and LC-MS and Investigation of Extraction Rate of Silymarin in Silybummarianum Fruits by Boiling Water, Asian Journal of Chemistry, 21(1), pp 63-74 44 Tamayo C and Diamond S (2007), Review of clinical trials evaluating safety and efficacy of milk thistle (Silybum marianum [L.] Gaertn.), Integrative Cancer Therapies, 6(2), pp 146-157 45 The United States Pharmacopeia (2015),Powdered Milk Thistle Extract Monograph, United States Pharmacopeia, 38, pp 1387 46 Thomas W Flaig, Glode Michael(2010), A study of high-dose oral silybinphytosome followed by prostatectomy in patients with localized prostate cancer, The Prostate, 70(8), pp 848-855 47 Tsai J.H., Liu JY, Wu TT, Ho PC, Huang CY, Shyu JC, Hsieh YS, Tsai CC, Liu YC (2008), Effects of silymarin on the resolution of liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats, Journal of Viral Hepatitis, 15(7), pp 508-514 48 Yasin Ghafor, Nian N Mohammad and Dler M Salh (2014),Extraction and Determination of Chemical Ingredients from Stems of Silybum marianum, Chemistry and Materials Research, 6(4), 2014 49 Wagner H., Horhammer L (1968),On the chemistry of silymarin (silybin), the active principle ofthe fruits from Silybum marianum (L.) Gaertn (Carduus marianus L.), Arzneimittel Forschung - Drug Research, 18, pp 688–696 50 Wang Xin, Zheng Xianzhe, Liu Chenghai (2008),Optimization of microwaveassisted extraction of silymarin from milk thistle seeds, International journal of agricultural and biological engineering, 1(1), pp 75-81 67 Nguyễn Thị Thu Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học 51 Wen Z., Dumas T.E., Schrieber SJ, Hawke RL, Fried MW, Smith PC (2008), Pharmacokinetics and metabolic profile of free, conjugated, and total silymarin flavonolignans in human plasma after oral administration of milk thistle extract, Drug metabolism and disposition, 36, pp 65-72 52 World Health Organization (2002), Fructus Silybi Mariae, WHO Monographs on Selected Medicinal Plants, 2, pp 300-322 68 ... 1.4.2 Phương pháp điện di mao quản (CE) 17 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng –khối phổ (LC-MS) 18 1.4.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 19 1.4.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPL ) 21 1.5 Một số. .. thực vật học 1.2.2 ông d ng c y ế s a 1.3 Các hoạt chất nhóm Silymarin từ Kế sữa 1.3.1 Cấu trúc tính chất số hoạt chất nhóm silymarin 6 1.3.2 Hoạt tính sinh học dược động học hoạt chất nhóm Silymarin. .. 10 1.3.3 Một số thực phẩm chức chứa nhóm Silymarin thị trường 13 1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phân tích Silymarin TPCN 15 1.4 Một số phƣơng ph p ph n tí h Silymarin 15 1.4.1 Phương pháp quang