Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản

Đặt vấn đề LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” là kết quả của quá trình học tập và nghiên cứu của bản thân tôi tại[.]

LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim chế phẩm huyết tương điện di mao quản” kết trình học tập nghiên cứu thân trường Đại học Dược Hà Nội suốt hai năm qua Để có kết cuối này, xin chân thành cảm ơn thầy cô trường đại học Dược Hà Nội, người truyền đạt kiến thức làm tảng cho thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An, người dành nhiều tâm huyết, trí tuệ thời gian giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Phạm Thị Thanh Hà, người tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Phương, người nhiệt tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho q trình thực nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn mơn Phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm & Mỹ phẩm Hà Nội, phòng Kiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Cuối xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, khích lệ, giúp đỡ tơi tận tình Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2009 Đỗ Lan Phương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN 1.1.1 Nguyên tắc hoạt động điện di mao quản 1.1.2 Đặc điểm điện di mao quản 1.1.3 Phân loại điện di mao quản 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Tính chất vật lý 1.2.3 Tác dụng dược lý phổ tác dụng .6 1.2.4 Dược động học .6 1.2.5 Chỉ định 1.2.6 Thực trạng chất lượng chế phẩm chứa cefixim thị trường Việt Nam 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM 1.3.1 Các phương pháp dược điển 1.3.2 Các phương pháp Dược điển 13 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG 16 1.4.1 Phương pháp chiết pha rắn (solid phase extraction) 16 1.4.2 Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng 16 1.4.3 Phương pháp kết tủa protein .17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Các chế phẩm có chứa cefixim 18 2.1.2 Mẫu huyết tương chứa cefixim 18 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 18 2.2.1 Chất chuẩn đối chiếu 18 2.2.2 Hóa chất, dung mơi 19 2.2.3 Thiết bị dụng cụ .19 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 Chương 3: KẾT QUẢ .23 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP 23 3.1.1 Khảo sát quy trình chiết cefixim huyết tương 23 3.1.2 Lựa chọn chất chuẩn nội 25 3.1.3 Xác định điều kiện điện di 26 3.1.4 Kết luận 32 3.2 XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG CHẾ PHẨM 32 3.2.1 Xác định điều kiện phân tích .32 3.2.2 Xử lý mẫu 33 3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 34 3.2.4 Kết định lượng cefixim chế phẩm .40 3.2.5 So sánh kết phương pháp định lượng xây dựng với phương pháp HPLC (BP 2008) 43 3.3 XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG 46 3.3.1 Xử lý mẫu huyết tương 46 3.3.2 Thẩm định phương pháp 46 3.3.4 Định lượng cefixim huyết tương thỏ 52 Chương 4: BÀN LUẬN .56 4.1 VỀ ỨNG DỤNG CE TRONG KIỂM SOÁT ĐIỀU TRỊ 56 4.1.1 Độ nhạy .56 4.1.2 Hiệu ứng .56 4.1.3 Độ xác độ lặp lại 57 4.2 VỀ QUY TRÌNH CHIẾT LOẠI BỎ PROTEIN TRONG HUYẾT TƯƠNG .57 4.2.1 Chiết lỏng-lỏng chiết pha rắn 57 4.2.2 Loại protein huyết tương dung môi hữu .58 4.3 VỀ SO SÁNH KỸ THUẬT HPLC VÀ CE VỚI PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT TRONG CHẾ PHẨM VÀ TRONG HUYẾT TƯƠNG 59 4.3.1 Trong chế phẩm 59 4.3.2 Trong huyết tương 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AUC : Diện tích đường cong (Area Under Curve) BP : Dược điển Anh (British Pharmacopoeia) Cmax : Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration) CZE : Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) CE : Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) CPDASP : 3-[(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulphonat HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Perfomance Liquid Chromatography) IS : Chuẩn nội (Internal Standard) LOQ : Giới hạn định lượng ( Limit of Quantification) LOD : Giới hạn phát (Limit of Detection) MEKC : Sắc ký điện động Mixen ( Micellar Electrokinetic Chromatography) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol PA : Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SDS : Sodium dodecyl sulfat SKS : Số kiểm sốt S/N : Tín hiệu/nhiễu đường (Signal/Noise) STT : Số thứ tự TBAOH : Tetrabutyl amoni hydroxyd Tmax : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa TLTK : Tài liệu tham khảo USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia) DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản Bảng 1.2:Một số thuốc cefixim bị đình lưu hành khơng đạt tiêu chuẩn hàm lượng cefixim năm 2008, 2009 .8 Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim dược điển kỹ thuật HPLC .11 Bảng 1.4: Một số chương trình định lượng cefixim huyết tương HPLC 14 Bảng 1.5: Một số chương trình định lượng cefixim điện di mao quản 15 Bảng 3.6: Xác định phù hợp hệ thống điện di 34 Bảng 3.7: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định khoảng nồng độ tuyến tính 37 Bảng 3.8: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 37 Bảng 3.9: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định độ phương pháp .39 Bảng 3.10: Kết xác định độ 39 Bảng 3.11: Kết xác định độ lặp lại 40 Bảng 3.12: Kết định lượng cefixim viên nén 43 Bảng 3.13: Kết định lượng bột pha hỗn dịch Okexime 100 mg .42 Bảng 3.14: Các bước tiến hành định lượng 43 Bảng 3.15: So sánh hai phương pháp HPLC CE 45 Bảng 3.17: Kết khảo sát độ phương pháp huyết tương 50 Bảng 3.18: Nồng độ tìm lại mẫu chuẩn cefixim thời điểm ngày 51 Bảng 3.19: Kết khảo sát hiệu suất chiết 52 Bảng 3.20: Kết định lượng cefixim huyết tương thỏ .54 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di .3 Hình 3.2: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim pha huyết tương trắng pH khác nhau: a) pH 6,0, b) pH 6,8, c) pH 9,0 28 Hình 3.3: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim nồng độ đệm khác nhau: a) 10 mM, b) 20 mM, c) 30 mM, d) 50 mM 29 Hình 3.4: Phổ UV cefixim .31 Hình 3.5: Điện di đồ mẫu trắng (Đệm phosphat 50 mM điều chỉnh đến pH 6,8 acid phosphoric 0,1M) 35 Hình 3.6: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim IS .35 Hình 3.7: Điện di đồ mẫu thử cefixim IS 35 Hình 3.8: Điện di đồ cefixim có mặt cephalosporin khác 36 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính nồng độ tỉ số diện tích pic 38 Hình 3.10: Điện di đồ thu từ viên nén Fimabute 200 mg .41 Hình 3.11: Điện di đồ định lượng bột pha hỗn dịch Okexime 100 mg 42 Hình 3.12: Cefixim IS pha hỗn hợp MeOH đệm Natri phosphat 50mM, pH 6,80 ( tỷ lệ 2:8 theo thể tích) 47 Hình 3.13: Huyết tương trắng 47 Hình 3.14: Huyết tương trắng có pha chuẩn cefixim nội chuẩn IS 47 Hình 3.15: Điện di đồ cefixim có mặt số thuốc khác 48 Hình 3.16: Đường biểu diễn phụ thuộc tỉ số diện tích pic nồng độ cefixim pha huyết tương trắng .48 Hình 3.17: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim nồng độ 1,0 µg/mL 283 nm 49 Hình 3.18: Điện di đồ mẫu huyết thỏ sau 1h uống thuốc 55 Hình 3.19: Điện di đồ mẫu huyết thỏ sau 2h uống thuốc 55 Hình 3.20: Điện di đồ mẫu huyết thỏ sau 3h uống thuốc 55 Hình 3.21: Điện di đồ mẫu huyết thỏ sau 4h uống thuốc 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Cefixim là thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ có nhiều ưu điểm nổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó tác dụng mạnh với các chủng vi khuẩn Gram (-), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả khuyếch tán tới các quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhập vào được và có thời gian bán hủy lâu Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ và đạt được nồng độ điều trị máu bằng đường uống thay vì phải sử dụng đường tiêm nhiều kháng sinh khác nên rất dễ sử dụng Chính vì thế vài năm trở lại Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dưới nhiều dạng bào chế viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch Tuy nhiên, cefixim lại là một những kháng sinh có tỷ lệ thuốc chất lượng cao Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉ lưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng viên bao phim Massime (cefixim 200 mg, Ấn Độ), viên nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viên nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc) Hiện dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về Cefixim, việc kiểm nghiệm chỉ dựa tiêu chuẩn sở Trong các dược điển BP 2008 và USP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC Việc định lượng Cefixim huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu thế giới cũng ở Việt Nam Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khả tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, nhiên có nhược điểm là chi phí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, được nghiên cứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước thế giới với nhiều ưu điểm hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại Cho đến nay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới lĩnh vực phân tích và được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế Từ những phân tích trên, chúng tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim chế phẩm và huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu: Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim chế phẩm và huyết tương Định lượng hoạt chất này số chế phẩm lưu hành thị trường cũng xác định nồng độ hoạt chất mẫu huyết tương thỏ nhằm phục vụ cơng tác nghiên cứu kiểm sốt điều trị ... SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN 1.1.1 Nguyên tắc hoạt động điện di mao quản 1.1.2 Đặc điểm điện di mao quản 1.1.3 Phân loại điện di mao quản 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM. .. xây dựng với phương pháp HPLC (BP 2008) 43 3.3 XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG 46 3.3.1 Xử lý mẫu huyết tương 46 3.3.2 Thẩm định phương pháp 46 3.3.4 Định lượng cefixim. .. di mao quản [4] Điện di mao quản có nhiều kiểu khác Mỗi kiểu có chế tách riêng Bảng 1.1 tóm tắt kiểu điện di hay sử dụng phân tích Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản Kiểu điện di Cơ chế tách Điện