Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa Bụp giấm bằng quang phổ UV-VIS. Phương pháp: định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp đo quang dựa trên phản ứng tạo màu với thuốc thử folin-ciocalteu; thẩm định phương pháp định lượng theo Hướng dẫn của ICH.
Tạp chí y - dợc học quân số 8-2017 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TOÀN PHẦN TRONG ĐÀI HOA BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L.) BẰNG QUANG PHỔ UV-VIS Trần Huy Hoàng*; Phạm Văn Hiển*; Đặng Trường Giang* Nguyễn Hồng Ngân*; Vũ Bình Dương*; Phạm Quốc Bình** TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm quang phổ UV-VIS Phương pháp: định lượng polyphenol toàn phần phương pháp đo quang dựa phản ứng tạo màu với thuốc thử folin-ciocalteu; thẩm định phương pháp định lượng theo Hướng dẫn ICH Kết quả: thẩm định phương pháp tiêu chí: tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác Các tiêu chí đáp ứng yêu cầu phương pháp định lượng theo quy định Kết luận: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm quang phổ UV-VIS * Từ khóa: Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.); UV-VIS; Polyphenol toàn phần UV-VIS Spectrometry Quantification of Total Polyphenols from Calyces of Hisbicus Sabdariffa L Summary Objectives: To validate a quantitative analysis procedure of total polyphenols in the calyces of Hisbicus sabdariffa L using UV-VS method Methods: Determining total polyphenols using UV-VIS method based on reaction between polyphenols and folin-ciocalteu reagent; validate this procedure according to ICH guidelines Results: The quantitative analysis was performed by reaction between total polyphenols and folin-ciocalteu reagent with detective wavelength of 765 nm; the method was ensured to the system suitability testing, precision, linearity, recovery, accuracy Conclusion: The quantitative analysis procedure of total polyphenols from Hisbicus sabdariffa using UV-VIS method was validated * Keywords: Hibiscus sabdariffa L.; UV-VIS; Total polyphenol total ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Bụp giấm có tên khoa học Hibiscus sabdariffa L., họ Bông (Malvaceae) Người ta thường dùng đài hoa có vị chua làm gia vị thay giấm, chế nước giải khát, siro Lá dùng chất thơm, kết hợp với đài hoa, để trị bệnh Scorbut Theo nghiên cứu ban đầu chúng tơi, nhóm hoạt chất đài hoa Bụp giấm polyphenol Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả giới [2] Polyphenol nhóm hợp chất quan trọng, * Học viện Quân y ** Học viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương2978 (vbduong@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 13/09/2017 Ngày bỏo c ng: 26/09/2017 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 8-2017 có nhiều tác dụng: chống oxy hóa, chống ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp [3] Cây Bụp giấm sử dụng nhiều thời gian gần Việt Nam Tuy nhiên, dược liệu chưa có chuyên luận Dược điển Việt Nam IV Việc định lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm có ý nghĩa quan trọng kiểm tra, kiểm soát chất lượng dược liệu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, hoá chất thiết bị Nguyên liệu Đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.,) Công ty TNHH Hồng Đài Việt, Quận 4, TP Hồ Chí Minh cung cấp, đạt TCCS * Hóa chất dung mơi: - Chất chuẩn axít gallic, hàm lượng ≥ 98% (Công ty Sigma Aldrich, Mỹ) - Thuốc thử folin-ciocalteu (Công ty Sigma Aldrich, Mỹ) - Các dung mơi, hóa chất phòng thí nghiệm: ethanol, natri carbonat… đạt tiêu chuẩn phân tích * Thiết bị: - Tủ sấy dược liệu - Máy đo hàm ẩm tự động SHIMADZU MOC 63u (Nhật) - Máy đo quang UV-Vis Biochrom Libra S70 PC (Anh) - Cân phân tích Metler độ xác 0,1 mg (Thuỵ Sỹ) - Máy chiết siêu âm gia nhiệt Sineo, Uwave - 1.000 (Trung Quốc) - Pipet xác, bình định mức loại - Cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm loại dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu Định lượng polyphenol toàn phần dịch chiết dược liệu phương pháp đo quang sau phản ứng với thuốc thử folin-ciocalteu [4, 5] Hàm lượng polyphenol tồn phần tính theo axít gallic - Dung dịch chuẩn axít gallic: cân xác 10,0 mg axít gallic chuẩn, hòa tan nước cất để 100 ml dung dịch chuẩn gốc (nồng độ 100 µg/ml) - Dung dịch thử: cân 0,5 g dược liệu (độ ẩm 9,34%) cho vào bình cầu, chiết thiết bị chiết siêu âm nhiệt độ 600C, thời gian 30 phút 60 ml nước cất Lọc thu dịch chiết, định mức 50 ml nước cất (dung dịch thử T) - Phản ứng với thuốc thử folinciocalteu: hút xác 1,0 ml dung dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm 5,0 ml thuốc thử folin-ciocalteu chuẩn bị trên, lắc phút Để yên nhiệt độ phòng 10 phút Thêm 4,0 ml dung dịch Na2CO3 7,5% Lắc phút, đậy kín, để n nhiệt độ phòng 60 phút * Thẩm định phương pháp: Thẩm định theo quy định ICH [6] tiêu sau: + Độ chọn lọc đặc hiệu + Tính tương thích hệ thống + Xác định khoảng tuyến tính: dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 10 50 µg/ml Xây dựng phương trình hồi quy biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ độ hấp thụ Yêu cầu: R2 ≥ 0,99 + Độ đúng: sử dụng phương pháp thêm chuẩn, sau xác định độ thu hồi T¹p chí y - dợc học quân số 8-2017 T lệ % tìm lại chuẩn xác định theo cơng thức: Tỷ lệ (%) tìm lại = = + Độ xác: chuẩn bị mẫu chuẩn mức nồng độ Mỗi nồng độ chuẩn bị mẫu Xác định nồng độ theo đường chuẩn mẫu ngày khác ngày + Tính tốn kết quả: từ độ hấp thụ dung dịch, tính nồng độ polyphenol tồn phần dung dịch thử theo axít gallic Hàm lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm theo axít gallic tính theo cơng thức: Cthực x V x k x 103 Hàm lượng polyphenol toàn phần (mg/g) = x 100 m x (100-H) Trong đó: Cthực: nồng độ polyphenol toàn phần dung dịch thử (µg/ml) V: thể tích dung dịch thử (ml) k: hệ số pha loãng m: khối lượng dược liệu (g) H: hàm ẩm bột dược liệu đài hoa Bụp giấm (%) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thẩm định phương pháp * Tính tương thích hệ thống: Pha dung dịch axít gallic chuẩn có nồng độ 10 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc Hút xác 1,0 ml dung dịch này, thực phản ứng với thuốc thử folinciocalteu Đo độ hấp thụ bước sóng 765 nm Thực đồng thời mẫu Độ hấp thụ đo 0,158 ± 0,00084 (RSD = 0,53%) Kết cho thấy: độ lệch chuẩn tương đối (RSD) độ hấp thụ dung dịch chuẩn sau phản ứng với thuốc thử folin-ciocalteu < 2% Như vậy, phương pháp phân tích tương thích với hệ thống quang phổ UV-VIS * Xác định khoảng tuyến tính: Lấy xác 1, 2, 3, 4, ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch nước cất Lắc đều, thu dung dịch có nồng độ thay đổi tương đương 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml axít gallic Hút xác 1,0 ml dung dịch cho vào ống nghiệm đánh số từ - tương ứng Thực phản ứng với thuốc thử folinciocalteu Song song làm mẫu trắng Đo độ hấp thụ mẫu bước sóng 765 nm Mối tương quan nồng độ độ hấp thụ axít gallic chuẩn thể bảng hình T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2017 Bng 1: Độ hấp thụ dung dịch chuẩn nồng độ (n = 3) STT C (µg/ml) 10 0,156 ± 0,001 20 0,301 ± 0,001 30 0,445 ± 0,002 40 0,578 ± 0,002 50 0,708 ± 0,001 A( ± SD) Hình 1: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ axít gallic chuẩn Kết quả: độ hấp thụ nồng độ axít gallic có tương quan tuyến tính chặt với hệ số tương quan R2 = 0,9994 phương trình hồi quy tuyến tính A = 0,0138 x C - 0,0231 Trong đó: A: độ hấp thụ dung dịch; C: nồng độ dung dịch axít gallic chuẩn (µg/ml) Khảo sát độ phương pháp Thực theo phương pháp thêm chuẩn Thêm 1,0 ml dung dịch chuẩn có nồng độ 10, 20 30 (µg/ml) vào ống nghiệm chứa 1,0 ml dung dịch thử T Mỗi mức nồng độ thêm làm mẫu Thực phản ứng với thuốc thử folin-ciocalteu, sau đo quang Dựa vào phương trình đường chuẩn, tính lượng chuẩn tìm lại Từ đó, xác định phần trăm tìm lại chuẩn Bảng 2: Kết khảo sát độ phương pháp 10 TT Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm lại (µg) Tỷ lệ (%) tìm lại 10,00 10,05 100,50 10,00 10,07 100,70 10,00 10,07 100,70 20,00 20,58 102,90 20,00 20,57 102,85 Tạp chí y - dợc học quân số 8-2017 20,00 20,61 103,05 30,00 29,86 99,53 30,00 29,84 99,47 30,00 29,88 99,60 = 101,03% RSD = 1,49% Phương pháp định lượng có độ cao với tỷ lệ % chất chuẩn tìm lại từ 99,47 103,05%, trung bình 101,03% RSD = 1,49% Khảo sát độ xác phương pháp Bảng 3: Kết đánh giá độ xác ngày khác ngày Độ xác MC1 (7,5 µg/ml) MC2 (17,0 µg/ml) MC3 (35,0 µg/ml) 7,46 ± 0,13* 17,17 ± 0,07* 34,80 ± 0,17* ± SD, µg/ml) RSD = 1,68% RSD = 0,42% RSD = 0,48% Khác ngày (n = 6) 7,37 ± 0,14* 17,11 ± 0,13* 34,58 ± 0,29* RSD = 1,91% RSD = 0,73% RSD = 0,85% Trong ngày (n = 3) ( ( ± SD, µg/ml) (*: Nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn) Chuẩn bị mẫu chuẩn mức nồng độ (7,5; 17,0; 35,0 µg/ml) Mỗi nồng độ chuẩn bị mẫu Xác định nồng độ theo đường chuẩn mẫu ngày khác ngày Kết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối điểm khảo sát ngày khác ngày < 2% Như vậy, phương pháp có độ xác cao đạt yêu cầu phân tích Hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu đài hoa Bụp giấm Bảng 4: Hàm lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm STT Hàm lượng polyphenol toàn phần 28,51 29,86 29,69 ± SD 29,35 ± 0,73 Áp dụng quy trình thẩm định để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu dược liệu nghiên cứu Kết thực nghiệm cho thấy, hàm lượng đạt 29,35 ± 0,73 mg/g (theo khối lượng dược liệu khơ tuyệt đối) tính theo axít gallic 11 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2017 BN LUN Polyphenol nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có nhiều tác dụng chống oxy hóa, kháng virut, chống ung thư, giảm lipid máu, có mặt nhiều lồi dược liệu [7] Polyphenol hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tồn thực vật có tác dụng bảo vệ thể, giúp thể chống lại nhiều loại bệnh khác gốc tự gây Đặc điểm chung chúng phân tử có vòng thơm (vòng benzen) chứa nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Tùy thuộc vào số lượng vị trí tương hỗ nhóm OH với khung hóa học mà tính chất lý - hố học hoạt tính sinh học thay đổi [1] Nhiều nghiên cứu cho thấy polyphenol thành phần dịch chiết nước ethanol đài hoa Bụp giấm [8] Dịch chiết polyphenol đài hoa Bụp giấm có tác dụng hạ lipid máu, hạ đường huyết động vật thực nghiệm người [9] Do đó, hàm lượng polyphenol tồn phần tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng dược liệu Để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần, sử dụng nhiều phương pháp HPLC, đo quang Tuy nhiên, sử dụng phương pháp đo quang để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần dễ thực hiện, nhanh chóng tính xác cao Ngoài ra, so với phương pháp HPLC, đo quang tốn Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng có độ cao 12 (101,63%) độ lặp lại tốt (RSD = 3,89%) Do vậy, phương pháp ứng dụng để xây dựng tiêu định lượng dược liệu chế phẩm từ đài hoa Bụp giấm KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp quang phổ UV-VIS dựa vào phản ứng tạo màu với thuốc thử folin-ciocalteu để định lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm Phương pháp xây dựng phù hợp với hệ thống quang phổ UV-VIS, đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu, độ cao với tỷ lệ thu hồi 101,63% độ xác cao (RSD < 2,0%) Áp dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu đài hoa Bụp giấm, cho thấy hàm lượng polyphenol toàn phần dược liệu đạt 29,35 ± 0,73 mg/g tính theo axít gallic (theo dược liệu khô tuyệt đối) TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Thông Nghiên cứu cấu trúc, khả chống oxy hóa số polyphenol dẫn xuất fullerene (c60) phương pháp hóa tính tốn 2016, tr.5-9 Fakaye T Toxicity and immunomodulatory activity of fractions of Hibiscus sabdariffa Linn (family Malvaceae) in animal models African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines 2008, (4), pp.394-398 Dickel M.l, Rates S.M.K, Ritter M.R Plants popularly used for loosing weight purposes in Porto Alegre, South Brazil Journal of Ethnopharmacology 2007, 109 (1), pp.60-71 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2017 Blainski A., Lopes G.C., De Mello J.C.P Application and analysis of the folin-ciocalteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium Brasiliense L Molecules 2013, 18 (6), pp.6852-6865 Meda A et al Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity Food chemistry 2005, 91 (3), pp.571-577 ICH Guide Validation of analytical procedures: Methodology International Conference on Harmonization Fed Reg 1997, 62 (2643) Herranz-López M et al Synergism of plant-derived polyphenols in adipogenesis: perspectives and implications Phytomedicine 2012, 19 (3), tr.253-261 Ramirez‐Rodrigues et al Physicochemical and phytochemical properties of cold and hot water extraction from Hibiscus sabdariffa Journal of Food Science 2011, 76 (3) Peng C.H et al Hibiscus sabdariffa polyphenolic extract inhibits hyperglycemia, hyperlipidemia, and glycation-oxidative stress while improving insulin resistance Journal of agricultural and food chemistry 2011, 59 (18), tr.9901-9909 13 ... đài hoa Bụp giấm KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp quang phổ UV-VIS dựa vào phản ứng tạo màu với thuốc thử folin-ciocalteu để định lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm Phương pháp xây dựng. .. vậy, phương pháp có độ xác cao đạt u cầu phân tích Hàm lượng polyphenol tồn phần mẫu đài hoa Bụp giấm Bảng 4: Hàm lượng polyphenol toàn phần đài hoa Bụp giấm STT Hàm lượng polyphenol toàn phần. .. thống quang phổ UV-VIS, đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu, độ cao với tỷ lệ thu hồi 101,63% độ xác cao (RSD < 2,0%) Áp dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu đài hoa Bụp