Phương pháp định lượng các bacoside tính theo bacoside A3 trong rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) bằng HPLC-UV được xây dựng và thẩm định. Điều kiện phân tích được thực hiện trên cột pha đảo VertisepTM C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 205 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút.
KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst HPLC tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao Trần Trung Nghĩa1, Nguyễn Văn Tài2, Lê Hùng Tiến1, Lê Chí Hồn1, Phạm Thị Lý1, Nguyễn Văn Kiên1, Nguyễn Thu Trang2, Phan Thị Trang2 Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ; Viện Dược liệu Nhận ngày 05/11/2017, Phản biện xong ngày 27/12/2017, Duyệt đăng ngày 28/12/2017 TÓM TẮT P hương pháp định lượng bacoside tính theo bacoside A3 rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) HPLC-UV xây dựng thẩm định Điều kiện phân tích thực cột pha đảo VertisepTM C18 (4,6 x 250 mm, µm), bước sóng phát 205 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút Khoảng tuyến tính phương pháp phân tích bacoside 13,5-270 µg/ml (r2=0,9999) Phương pháp cho độ độ lặp lại cao Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 2,70 µg/ml 8,91 µg/ml Phương pháp áp dụng để xác định hàm lượng bacoside số mẫu rau đắng biển, kết cho thấy hàm lượng bacoside khoảng 1,71–4,45%, mẫu có hàm lượng bacoside cao mẫu RĐB 2-13 (4,45 ± 0,02%) Từ khóa: Rau đắng biển, định lượng bacoside, HPLC Đặt vấn đề Rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) có tên gọi khác rau sam đắng Từ lâu, loài sử dụng phổ biến đời sống người dùng làm rau ăn dùng làm thuốc y học cổ truyền Ấn Độ từ 3000 năm trước, có tác dụng bảo vệ trí nhớ, bổ thần kinh tăng cường nhận thức, nghiên cứu theo hướng để bảo vệ thần kinh [2], [4] Hiện nay, nhiều tác giả nước nghiên cứu thành phần hóa học 86 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số (9) – 2017 tác dụng dược lý rau đắng biển Kết nghiên cứu cho thấy rau đắng biển sử dụng rộng rãi y học cổ truyền để điều trị chứng tâm phiền khác Rau đắng biển có chứa alkaloid brahmine, nicotinine, herpestine, bacosides A [3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside-10, 20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-ene], saponin triterpenoid, saponin A, B C, axit betulinic, D-mannitol, stigmastanol, β-sitosterol, stigmasterol pseudojujubogenin glycoside Các nghiên cứu dược lý cho thấy KHOA HỌC NƠNG - LÂM NGHIỆP rau đắng biển có nhiều tác dụng dược lý, bao gồm phản ứng thần kinh trung ương (tăng cường trí nhớ, chống trầm cảm), giảm đau, chống co giật, chống oxy hóa, tiêu hóa, nội tiết, chống vi khuẩn, chống viêm, giảm đau, tim mạch tác động làm giãn trơn Tổng quan tập trung vào thành phần hóa học hiệu dược lý rau đắng biển [1], [3], [5-7] Ở Việt Nam có dược phẩm “Ích Trí Mộc Linh” (cơng ty Dược phẩm Tuệ Linh) kết hợp từ rau đắng biển với thảo dược khác có tác dụng cải thiện trí nhớ, tăng khả tập trung, giảm căng thẳng tình trạng lo lắng, khắc phục tình trạng hay quên, chứng lơ đãng, tăng cường sức khỏe khả miễn dịch Tuy nhiên, chưa có vùng sản xuất dược liệu rau đắng biển Việt Nam, dựa vào khai thác tự nhiên Nghiên cứu có mục tiêu xây dựng phương pháp định lượng hàm lượng bacoside rau đắng biển HPLC, đồng thời đánh giá hàm lượng bacoside mẫu rau đắng biển thu từ địa phương khác sau trồng nhân giống địa điểm nhằm tuyển chọn dòng có hàm lượng bacoside cao, đáp ứng yêu cầu sản xuất nguồn dược liệu Vật liệu phương nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu pháp Các mẫu dược liệu (toàn cây) rau đắng biển Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ – Viện Dược liệu thu thập Thu thập mẫu nghiên cứu định danh loài (Bacopa monnieri (L.) Wettst, phận dùng (toàn cây) Thu mẫu rau đắng biển vùng sinh thái khác Việt Nam Bảng Danh sách mẫu dược liệu nghiên cứu TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu RĐB 01 RĐB 02 Thanh Hóa RĐB 03 RĐB 04 Nghệ An RĐB 05 RĐB 06 RĐB 07 RĐB 08 Đà Nẵng RĐB 09 RĐB 10 Lấp Vò - Đồng Tháp RĐB 11 Vũng Tàu RĐB 12 RĐB 13 RĐB 14 Long An RĐB 15 RĐB 16 Đồng Tháp RĐB 17 RĐB 18 TP Hồ Chí Minh RĐB 2-01 RĐB 2-02 RĐB 2-03 RĐB 2-04 RĐB 2-05 RĐB 2-06 RĐB 2-07 RĐB 2-08 RĐB 2-09 Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa) RĐB 2-10 RĐB 2-11 RĐB 2-12 RĐB 2-13 RĐB 2-14 RĐB 2-15 RĐB 2-16 RĐB 2-17 RĐB 2-18 gồm 18 mẫu ký hiệu từ RĐB 01 đến RĐB 18 Thu mẫu rau đắng biển sau nhân giống trồng Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa), ký hiệu từ RĐB 2-01 đến RĐB2-18 (Bảng 1) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng tổng bacoside dược liệu rau đắng biển Dung dịch chuẩn: Hòa tan bacoside A3 chuẩn methanol pha loãng để tạo Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ số (9) – 2017 87 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP thành dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 235 ppm Sau đó, tiến hành pha lỗng dung dịch chuẩn gốc methanol để thu dung dịch có nồng độ từ 11,75–235 ppm Các dung dịch chuẩn lọc qua màng lọc có kích cỡ 0,45 µm thu dung dịch dùng để triển khai sắc ký Dung dịch thử: Cân xác khoảng 2,5 g bột dược liệu rau đắng biển, chiết hồi lưu với methanol đến dịch lọc nhạt màu Lọc dịch chiết vào bình định mức, bổ sung dung mơi đến vạch Sau đó, lọc dịch chiết qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm thu dung dịch thử dùng để triển khai sắc ký Ct tỏch: Vertisep C18 (250 mm ì 4,6 mm, àm) Detector UV-Vis: bc súng 205 nm Pha ng: Dung dịch đệm (A)– Acetonitril (B) • Dung dịch đệm pH 2,15 (A): Hòa tan 0,07 g KH2PO4 khan 0,3 ml H3PO4 85% nước cất, định mức xác thành 500 ml, lắc đều, lọc, siêu âm loại bọt khí Pha động rửa giải theo chương trình gradient trình bày bảng Bảng Chương trình gradient rửa giải pha động Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%) 70 30 25 60 40 26 70 30 30 70 30 • Tốc độ dòng: 1,5 ml/phỳt Th tớch tiờm mu: 20 àl Nhit cột: 28oC a) Xây dựng phương pháp định lượng Tiến hành khảo sát dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng, thể tích 88 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số (9) – 2017 tiêm mẫu… để tìm chương trình định lượng phù hợp b) Thẩm định phương pháp định lượng HPLC ■■ Tính thích hợp hệ thống Tiến hành sắc ký loại mẫu sau theo quy trình phân tích: Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic sắc ký đồ Nếu có đáp ứng pic phải ≤1,0% so với đáp ứng pic mẫu chuẩn Sắc ký đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu khác khơng có ý nghĩa thống kê pic chất chuẩn sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ dung dịch thử, xuất thêm pic khác khơng phải pic chất chuẩn phải tách hồn toàn khỏi pic đáp ứng yêu cầu chung phương pháp sắc ký lỏng quy định Dược điển Việt Nam ■■ Tính thích hợp hệ thống Thực nghiệm: Dung dịch chuẩn: tiến hành sắc ký lặp lại 06 lần Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng Thời gian lưu có RSD ≤1,0%, diện tích pic có RSD ≤2,0% ■■ Khoảng tuyến tính Thực nghiệm: Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn có nồng độ từ 13,5-270 ppm cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với hệ số pha loãng khác Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch lặp lại 03 lần) ghi lại sắc ký đồ xác định đáp ứng pic Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính nồng KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP độ chất chuẩn có mẫu đáp ứng pic thu sắc ký đồ phương pháp bình phương tối thiểu ■■ Độ thu hồi Độ phương pháp hay tỷ lệ thu hồi (%) = Khối lượng hoạt chất thu hồi/Khối lượng hoạt chất thêm vào × 100 Nếu phương pháp đúng, tỷ lệ thu hồi mức nồng độ: 97,0-103,0%, RSD tỷ lệ thu hồi (≤2,0%) mức nồng độ ■■ Độ lặp lại Tiến hành định lượng 06 mẫu thử độc lập, mẫu lặp lại 03 lần Xác định hàm lượng hoạt chất có mẫu thử cách sử dụng đường chuẩn mục xác định khoảng tuyến tính Độ lặp lại phương pháp xác định giá trị RSD (%) kết định lượng hàm lượng bacoside mẫu Nếu phương pháp đúng, giá trị RSD (%) kết định lượng hàm lượng bacoside có mẫu ≤2,0% ■■ Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát (LOD): Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn phân tích HPLC đến tín hiệu chất định phân tích sắc ký đồ thu có tỷ lệ S/N (tín hiệu/nhiễu) = 2H/h đạt khoảng từ 2–3, H chiều cao pic định phân tích, h chiều cao tín hiệu nhiễu lớn Nồng độ xác định giới hạn phát (LOD) phương pháp ứng với chất định phân tích Giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn định lượng phương pháp xác định dựa giới hạn phát LOQ=3,3 × LOD 2.2.2 Định lượng mẫu rau đắng biển Tiến hành sắc ký riêng biệt dung dịch mẫu thử, mẫu thử lặp lại lần, ghi nhận sắc ký đồ ghi lại đáp ứng chất cần phân tích Nồng độ chất cần phân tích dung dịch thử (C, ppm) = [(S-a)/b] xH/100 Với S diện tích pic bacoside; a,b hệ số phương trình đường chuẩn; H độ tinh khiết chất chuẩn (%) Hàm lượng chất phân tích dược liệu (%) = [(C×100×100)/(m×1000000)]×[100/ (100-a) Với C: nồng độ bacoside dung dịch mẫu thử, xác định đường chuẩn (ppm); m: khối lượng dược liệu (g); a: độ ẩm dược liệu (%) 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Tập hợp kết loại bỏ giá trị thô theo test Dixon Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Chúng tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn dung môi pha mẫu theo điều kiện mô tả So sánh thời gian lưu pic bacoside A3 chuẩn Kết nghiên cứu trình bày hình Sắc ký đồ dung môi pha mẫu không xuất pic bacoside A3 khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic bacoside A3 sắc ký đồ dung dịch chuẩn Sắc ký đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu khác khơng có ý nghĩa thống kê so với pic chất chuẩn bacoside A3 sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ dung dịch thử không xuất thêm pic khác (pic tạp) ảnh hưởng đến pic chuẩn bacoside A3 Pic bacoside A3 sắc ký đồ dung dịch chuẩn thử tinh khiết Hệ số tinh khiết pic bacoside A3 sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử xấp xỉ 1,0 Như vậy, phương pháp chọn có tính đặc hiệu cao với bacoside A3 dùng Tạp chí Khoa học & Công nghệ số (9) – 2017 89 KHOA HỌC NƠNG - LÂM NGHIỆP Hình Kết khảo sát tính đặc hiệu A: Mẫu thử; B: bacoside A3 chuẩn, C: dung mơi để phân tích thành phần hợp chất bacoside A3 dược liệu rau đắng biển 3.1.1 Tính thích hợp hệ thống Tiến hành sắc ký lặp lại lần dung dịch chuẩn có nồng độ 135 µg/ml với điều kiện chọn Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống trình bày bảng Kết độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic tương ứng 0,1497 0,2015%, thấp 2% Điều cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống sắc ký HPLC sử dụng ổn định, phù hợp cho phép phân tích bacoside rau đắng biển 3.1.2 Độ tuyến tính Chúng tơi tiến hành sắc ký theo điều kiện mô tả dung dịch chuẩn có nồng độ từ 13,5-270µg/ml, kết thu thể bảng Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính bacoside A3 Nồng độ (µg/ml) 13,5 27,0 67,5 135 216 270 Diện tích pic 51351 103830 258925 522013 821108 1034329 Bảng Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký STT TB SD RSD (%) Thời gian lưu (phút) 20,302 20,323 20,323 20,332 20,354 20,389 20,337 0,03045 0,1497 Diện tích pic 523533 524442 524916 524622 524091 522013 523936,2 1055,594 0,2015 90 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ số (9) – 2017 Hình Đồ thị biểu diễn đường chuẩn bacoside A3 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP Kết nghiên cứu cho thấy có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ bacoside A3 dung dịch theo phương trình: y= 3820,8x + 1037,2 với hệ số tương quan r2=0,9999 3.1.3 Độ thu hồi Độ thu hồi đại lượng đặc trưng cho sai số phương pháp phân tích Để xác định độ thu hồi phương pháp, sử dụng phương pháp thêm chuẩn trình bày mục 2.2 với lượng bacoside A3 thêm vào mẫu thử 218 µg Chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn mẫu không thêm chuẩn; xác định lượng chất thêm vào dựa phương trình đường chuẩn xây dựng Kết thu trình bày bảng Kết cho thấy thêm lượng bacoside A3 chuẩn khác nhau, phương pháp Bảng Kết khảo sát độ thu hồi phương pháp STT Trung bình Lượng Lượng bacoside bacoside A3 A3 thu hồi thêm vào (µg) (µg) 218,0 221,5 218,0 218,7 218,0 221,7 101,20 Thu hồi (%) 101,60 100,30 101,70 cho độ thu hồi nằm khoảng 98-102% độ lệch chuẩn tương đối