Nội dung bài viết với mục tiêu phân tích sự biến đổi về cấu tạo giải phẫu của cuống lá trong quá trình tạo mô sẹo và hình thành rễ bất định, định lượng saponin toàn phần trong rễ tạo thành. Mời các bạn cùng tham khảo.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH RỄ TỪ CUỐNG LÁ CÂY TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS H T TSAI ET K.M.FENG) IN VITRO V\ BƢỚC ĐẦU ĐỊNH LƢỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG RỄ TẠO THÀNH Nguyễn Thị Ngọc Hương*, Trần Hùng*, Trương Thị Đẹp* TÓM TẮT Mở đầu: Tất phận c a Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) dùng làm thuốc bổ, cầm m{u, tăng cường sinh dục, chống stress Việc nghiên cứu s hình thành rễ bất định t cuống khơng mang ý ngh a quan trọng vi nhân giống lồi thuốc mà góp phần thu nhận saponin t rễ, đ{p ứng nguồn nguyên liệu cho l nh v c y ược học tư ng lai Mục tiêu: Phân tích s biến đổi cấu tạo giải phẫu c a cuống trình tạo mơ sẹo hình thành rễ bất định Định lượng saponin toàn phần rễ tạo thành Đối tượng-phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy cuống t cụm chồi Tam thất hoang tháng tuổi môi trường tạo rễ; nh ng thay đổi đặc điểm giải phẫu c a cuống l{, đặc điểm hình thái c a mơ sẹo rễ bất định phân tích, mơ tả chụp hình Kết quả: Nồng độ auxin giúp s tạo rễ nhiều t cuống mg/l NAA sau 10 tuần môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Các tế bào vùng mô mềm gần biểu bì phân chia tạo mơ phân sinh rễ Các tế bào mô mềm gần cung libe gỗ tạo nốt tròn phân hóa mạch Rễ hình thành có hệ thống mạch nối với mạch c a nốt tròn ph a H|m lượng saponin chiếm 5,5% rễ nuôi cấy Kết luận: NAA auxin thích hợp cho s tạo rễ bất định t cuống Tam thất hoang Rễ tạo thành có khả sinh tổng hợp v| t ch lũy saponin Từ khóa: Tam thất hoang, mơ sẹo, rễ bất định ABSTRACT STUDY ON MORPHOGENESIS OF ADVENTITIOUS ROOT FROM PETIOLE OF PANAX STIPULEANATUS H T TSAI ET K.M.FENG IN VITRO AND PRELIMINARY QUANTIFICATION OF TOTAL SAPONINS IN THESE ROOTS Nguyen Thi Ngoc Huong, Tran Hung, Truong Thi Dep * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 45-51 Background: All parts of the Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng are used as tonics, stopping bleeding, sexual enhancement, and anti-stress The study of the morphogenesis of adventitious root from the petiole is not only important in micropropagation of this medicinal plant, but also contributes to getting saponins from these roots, to the supply of raw materials for the medical pharmacy field in the future Objectives: Analysing anatomical changes of petioles during callus formation and adventitious rooting Quantification of total saponins in these roots Methods: Petiole explants of 3-month-old plants were cultured on root-induced medium; the anatomical *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Th Ngọc Hương ĐT: 0933386054 Chuyên Đề Dƣợc Email : ngochuongyd82@gmail.com 45 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 changes of petiole, the morphological characteristics of callus and adventitious root were analysed, descriptived and photoghraphed Results: Concentration of auxin induces the most roots from the petiole is mg/l of NAA after 10 weeks on MS medium (Murashige & Skoog, 1962) The parenchyma cells near epidermis are divided to form root meristems The parenchyma cells near xylem and phloem form nodules with xylogenesis Adventitious roots have the conducting tissues connect with these of the nodules inside The content of total saponins in these roots is 5% Conclusions: NAA is the auxin suitable for the formation of adventitious roots from Panax stipuleanatus petiole These roots are able to biosynthesise and accumulate saponins Keyword: Panax stipuleanatus, callus, adventitious rooting ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHI NCỨU T t phận Tam th t hoang (Araliaceae) ều làm thuốc Thân rễ thường ược dùng làm thuốc bổ, c {u, t ng cường sinh dục, chống stress Lá nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an th n(9) Do ó, việc phân tích thành ph n hóa học Tam th t hoang ã ược nhà khoa học quan tâm nghiên cứu t nh ng n 1985(13) Nh ng nghiên cứu g n }y cho th y saponin Tam th t hoang có tác dụng chống ung thư(1) Đặc biệt, saponin thuộc nhóm olean t rễ thân rễ Tam th t hoang có t{c ộng kìm hãm hoạt ộng HepG2 (dòng t bào ung thư gan người)(4) Với nh ng giá tr ược liệu vậy, nên nay, Tam th t hoang ang khai thác b a ãi S{ch ỏ Việt Nam nêu rõ Tam th t nguồn g n ặc biệt quý hi ối với Việt Na tr n th giới v| ang ứng trước nguy tuyệt chủng cao(9) Đố ƣợng Việc nuôi c y in vitro rễ b t nh nh ng loài thuốc thuộc chi Panax cho th y tỷ lệ t ng sinh rễ v| h| ượng hợp ch t bi n ưỡng thứ c p rễ r t cao có khả n ng so s{nh với rễ tự nhiên(3,6) Vận dụng nh ng ưu iểm phương ph{p nuôi c y mô ại hông phụ thuộc thời ti t, khí hậu, chủ ộng trình ni c y, rút ngắn thời gian ni trồng, ch ng ã ti n hành nghiên cứu nhằm tìm hiểu phát sinh rễ t cuống Tam th t hoang in vitro v| nh ượng saponin tồn ph n rễ tạo thành, góp ph n {p ứng nguồn nguyên liệu cho ĩnh vực y ược học tương 46 Cuống chồi Tam th t hoang in vitro (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) tháng tuổi có nguồn gốc t mơ sẹo thân rễ ược ni trồng phòng thí nghiệm môn Sinh lý thực vật – Khoa Sinh học Công nghệ sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên Tp.HCM Phƣơn pháp Thí nghiệm tạo rễ từ cuống Cuống { có ường kính khoảng 1-2 mm ược cắt thành nhiều oạn dài 5-7 v| ược ặt nằ ngang tr n trường MS ½ (Murashige Skoog, 1962)(5) có bổ sung riêng lẻ IBA NAA nồng ộ 1, 3, mg/l Các mẫu ược che tối iều kiện nhiệt ộ 22 ± oC ẩm ộ 65% Số rễ ược x{c nh thời iểm 10 tu n nuôi c y thống kê ph n mềm SPSS, phiên 11.5 dùng cho Window Sự khác biệt có ý nghĩa mức p≤0,05 giá tr ược biểu mẫu tự khác kèm theo sau Sự thay ổi hình thái c u tạo giải phẫu cuống trình phát sinh rễ ược quan sát l n ượt thời iểm 10 tu n sau nuôi c y Rễ in vitro thời iểm 20 tu n ược thu nhận ly trích saponin tồn ph n Quan sát hình thái giải phẫu Cuống { ược cắt ngang dao lam thành lát cắt dày 200-300 µm, nhuộm phương ph{p nhuộm kép Bộ môn Thực vật Khoa Dược Quy trình nhuộm: Ngâm vi phẫu Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học v|o nước Jav n trắng Rửa Ti p tục ngâm vi phẫu dung d ch acid acetic 10% 10 phút Nhuộm vi phẫu với thuốc nhuộm son phèn-lục iod 15 phút Rửa Quan sát vi phẫu ã nhuộm kính hiển vi quang học chụp ảnh vật nh v| 10 ( ộ phóng ại 40X, 100X) Bảng 1: Ảnh hưởng c a IBA đến khả tạo rễ bất định t cuống Tam thất hoang sau 12 tuần nuôi cấy Định lượng saponin toàn phần rễ tạo thành phương pháp cân Mẫu thân rễ, rễ b t nh mọc t thân rễ (cây tự nhiên) rễ nuôi c y ược ngâm M OH, si u } 20 ph t, thu ược cao MeOH Cô cao M OH n khơ hòa tan cắn với nước Cao nước n|y ược lắc phân bố với DCM cho n dung d ch DCM khơng màu thu ược cao nước cao DCM L y cao nước ti p tục lắc phân bố với n Butano n d ch n Butanol không màu Thu cao n Butanol cô n cắn Các số trung bình cột với kí tự khác kèm theo sau khác biệt có ý nghĩa mức p≤0,05 T nh h| ượng saponin toàn ph n (%): S=a/M*(1-x)*100 Trong ó: S: h| ượng saponin (%), a: khối ượng saponin toàn ph n (g), M: khối ượng ược liệu (g), x: hàm ẩm ược liệu (%) KẾT QUẢ Ảnh hƣởng củ IB N đến tạo rễ bất định cuống Tam thất hoang Tại thời iểm 10 tu n sau nuôi c y, mẫu c y IBA tạo rễ với tỷ lệ l n ượt 12,5; 25,75;18,75 ứng với nồng ộ 1, 3, mg/l Tuy nhiên, tỷ lệ tạo rễ với số rễ hơng {ng ể khác biệt hơng có ý nghĩa thống kê (ở mức p=95%) (Bảng 1) Khác với IBA, NAA cho tỷ lệ tạo rễ t ng d n theo nồng ộ Ở nồng ộ mg/l NAA cho tỷ lệ tạo rễ cao so với nồng ộ g/ v| 50 Số rễ t ng n theo nồng ộ NAA ôi trường, nồng ộ NAA mg/l số rễ khác biệt so với ối chứng (Bảng 2) Chuyên Đề Dƣợc Nồ ộ IBA (mg/L) Tỷ lệ rễ (%) a 0,00 ± 0,00 a 12,50 ± 7,22 a 25,75 ± 10,55 a 18,75 ± 18,75 Số rễ a 0,00 ± 0,00 a 0,34 ± 0,17 a 0,75 ± 0,22 a 0,88 ± 0,38 Bảng 2: Ảnh hưởng c a NAA đến khả tạo rễ bất định t cuống Tam thất hoang sau 12 tuần nuôi cấy Nồ ộ NAA (mg/L) Tỷ lệ rễ (%) b 0,00 ± 0,00 b 4,00 ± 4,00 a 53,33 ± 8,58 a 63,00 ± 15,62 Số rễ b 0,00 ± 0,00 b 0,05 ± 0,05 ab 1,53 ± 0,57 a 2,32 ± 0,87 Các số trung bình cột với kí tự khác kèm theo sau khác biệt có ý nghĩa mức p≤0,05 Sự hình thành rễ bấ định từ cuống Tam thất hoang Vi phẫu cuống mặt g n phẳng, mặt ưới lồi tròn Biểu bì biểu ì ưới có lớp cutin mỏng phẳng Mơ mềm khuy t t bào hình b u dục, kéo dài, x p lỏng lẻo Libe gỗ c p x p thành cung gi a, gỗ libe ưới (ảnh 4) Tại thời iểm tu n, tr n ôi trường MS bổ sung IBA NAA nồng ộ khác nhau, mẫu cuống có d u hiệu t ng ch thước bề ngang Hai u v t cắt phù nhiều v| xu t mơ sẹo Sau ó, sẹo liên tục t ng sinh phát triển mạnh quanh v t cắt cho n tràn bề mặt ôi trường Mô sẹo có màu trắng, chi t quang rắn (ảnh 2B) Điều cho th y, có lẽ mơ sẹo khơng ti p tục phản ph}n hóa | t ng trưởng v| t ch ũy ột số ch t bên tạo ộ cứng mô sẹo Thật vậy, lát cắt ngang qua khối mô sẹo v t cắt sát cuống cho th y vách t bào ch ng ã tẩm ch t b n Hơn th n a, nhiều khối 47 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 mô mề ang ph}n hóa th|nh i v| gỗ xu t n c|ng t ng ộ cứng mẫu (ảnh 5, ảnh ảnh 7) Khi cắt ngang vùng phù lên sát v t cắt cuống tu n, t bào vùng mô mề ưới biểu bì mơ mềm g n hệ thống mạch dẫn có ph}n chia u tiên (ảnh 5) Ở tu n thứ 10, nhóm t bào tạo thành vùng phân sinh dạng nốt tròn Các nốt tròn phía ngồi hình th|nh ược mơ phân sinh rễ (ảnh 8) Các nốt tròn bên rải rác t cung libe gỗ phía ngo|i có xu hướng hóa mạch (ảnh 7) Sau ó rễ hình thành nối hệ thống mạch dẫn với mạch dẫn nốt bên (ảnh 8) Rễ ạt ược c u trúc hoàn chỉnh phá vỡ nốt tròn mơ sẹo ể xu t bên ngồi (ảnh ảnh 9) Q trình tạo mơ sẹo Tam th t hoang tương tự với khử phân hóa t bào mơ mềm vỏ ể phân hóa thành ba loại nốt tròn mơ sẹo t trụ hạ diệp Keo (Racosperma mangium (Wi ) P y) ưới tác ộng auxin cytokinin Nốt tròn thứ nh t phân hóa vùng phân sinh, nốt tròn thứ hai phân hóa mạch nốt tròn thứ ba gồm t bào mô mềm(11) 48 Ảnh 1: Cụm chồi Tam thất hoang in vitro A B Ảnh 2: Cuống mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l (A, thời điểm tuần, B, thời điểm tuần) Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Ảnh 3: Cuống rễ sau 14 tuần môi trường MS có bổ sung NAA mg/l Ảnh 4: Vi phẫu cuống Tam thất hoang Ảnh 5: Các tế bào mô mềm gần cung libe gỗ mũi tên c a cuống phân chia sau tuần môi trường MS có bổ sung NAA mg/l Ảnh 6: Các tế bào mơ mềm phía ngồi c a cuống phân chia tạo nốt tròn sau tuần mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l Chuyên Đề Dƣợc Ảnh 7: Các tế bào mô mềm phía c a cuống phân chia tạo nốt tròn phân hóa mạch mũi tên sau tuần mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l 49 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Ảnh 8: S khởi rễ hình thành có s nối mạch với nốt ên mũi tên sau 10 tuần mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l Định ƣợng saponin toàn phần rễ tạo thành Bảng 3: H|m lượng saponin toàn phần rễ bất định t thân rễ hình thành t mơ sẹo cuống Rễ bất định từ thân rễ Rễ bất định in vitro Thân rễ Tam thất hoang Tỷ lệ saponin / TLK (%) 5,27 5,50 12,95 H| ượng saponin rễ nuôi c y tương tự rễ b t nh mọc t thân rễ tự nhiên t so với thân rễ BÀN LUẬN Đối với loài thuốc khác thuộc chi Panax Ta th t Panax notoginseng, khả n ng hình thành rễ b t nh t chồi hoa cao nh t ôi trường MS có bổ sung mg/l IBA(2) Ở sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis, cuống phát sinh mô sẹo rễ ạt tỷ lệ số ượng cao nh t trường MS có bổ sung mg/l NAA(10) Trong nghiên cứu n|y, tr n ối tượng Tam th t hoang, t n su t tạo rễ NAA cao IBA chứng tỏ 50 Ảnh 9: Rễ đạt cấu trúc hoàn chỉnh kéo dài bên ngồi khối mơ sẹo sau 10 tuần mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l ch t iều hòa t ng trưởng thực vật phù hợp cho tạo rễ cuống in vitro Trong nghiên cứu trước }y chúng tôi, vật liệu h{c { v| th}n rễ Tam th t hoang tự nhi n, NAA th c ẩy hình thành rễ b t nh nồng ộ t 0,5 n mg/l(7,8) K t nghiên cứu l n n a khẳng nh NAA auxin thích hợp cho hình thành rễ b t nh t nhiều vật liệu khác Tam th t hoang KẾT LUẬN Sự hình thành rễ b t nh ước quan trọng nhân giống thực vật Đối với nh ng loài thuốc | ặc biệt loài thuộc chi Panax Ta th t hoang, rễ b t nh có khả n ng sinh tổng hợp v| t ch ũy saponin Vì vậy, việc tìm hiểu trình hình thành rễ b t nh t cuống Tam th t hoang nh ượng saponin rễ tạo thành hứa hẹn quy trình nhân sinh khối rễ thu nhận saponin t rễ tương Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chun L and et al (2011) Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their cytotoxic effects on human cancer cells Bull Korean Chem Soc 32, pp 3513-3518 Gao XF, Xu ZH, Liu JJ, Ma LP, Yin LP, & Jia W (2006) Adventitious root induction and in vitro culture of Panax notoginseng China journal of Chinese materia medica, 31(18), 14851488 Kevers C, Jacques P, Thonart P, & Gaspar T (1999) In vitro root cultures of Panax ginseng and P quinquefolium Plant growth regulation, 27(3), 173-179 Liang C, Ding Y, Song SB, Kim JA, Cuong NM, Ma JY, & Kim YH (2013) Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB Journal of ginseng research, 37(1), 74 Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473- 497 Murthy HN, Hahn EJ, & Paek KY (2008) Adventitious roots and secondary metabolism Chinese Journal of Biotechnology, 24(5), 711-716 Nguyễn Th Ngọc Hương, Tr n H ng, Trương Th Đẹp (2015) Nghiên cứu hình thành rễ b t nh t mô sẹo Tam th t hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) nuôi c y in vitro Tạp ch Y học Thành phố Hồ Chí Minh, Tập 19, Số 3, tr 570-573 Chuyên Đề Dƣợc 10 11 12 13 Nghiên cứu Y học Nguyễn Th Ngọc Hương, Tr n H ng, Trương Th Đẹp (2016) Tìm hiểu bi n ổi hình thái phát sinh rễ Tam th t hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) nuôi c y in vitro v| ước u nh tính oleanolic acid rễ tạo thành Tạp ch công nghệ Sinh học, Tập 14, Số 1, tr 49-54 Nguyễn Ti n Bân (2009) S{ch đỏ Việt Nam Phần II Th c Vật, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội Nhut DT, Huy NP, Chien HX, Luan TC, & Thao LB (2012) In vitro culture of petiole longitudinal thin cell layer explants of vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 2012 Jul-Sept; 3(3): 178-190 Takemori NK, Marschner R, Quoirin M, Bona C, Zanette F (2000) Anatomical study of Racosperma (ex-Acacia) mangium tissues cultured in vitro Brazilian Archives of Biology and Technology, 43(1), 0-0 Yang Chong R and et al (1985) Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus Acta Botanica Yunnanica 7, pp 103-106 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 18/10/2017 01/11/2017 15/03/2018 51 ... mg/l Định ƣợng saponin toàn phần rễ tạo thành Bảng 3: H|m lượng saponin toàn phần rễ bất định t thân rễ hình thành t mơ sẹo cuống Rễ bất định từ thân rễ Rễ bất định in vitro Thân rễ Tam thất hoang. .. IBA đến khả tạo rễ bất định t cuống Tam thất hoang sau 12 tuần nuôi cấy Định lượng saponin toàn phần rễ tạo thành phương pháp cân Mẫu thân rễ, rễ b t nh mọc t thân rễ (cây tự nhiên) rễ nuôi c y... t hoang, rễ b t nh có khả n ng sinh tổng hợp v| t ch ũy saponin Vì vậy, việc tìm hiểu trình hình thành rễ b t nh t cuống Tam th t hoang nh ượng saponin rễ tạo thành hứa hẹn quy trình nhân sinh