LÊ ĐÌNH HẢI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HẢI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HẢI MÃ SINH VIÊN: 1401175 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Th.S Vũ Ngân Bình Nơi thực Bộ mơn Hóa phân tích – độc chất HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu đến từ thầy cơ, bạn bè gia đình Khi khóa luận hồn thiện, tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến họ Đầu tiên, với tất lòng biết ơn kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, Th.S Vũ Ngân Bình – Giảng viên mơn Hóa phân tích độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình để giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu, thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Nguyễn Lâm Hồng, Th.S Ngô Minh Thúy, Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh thầy cô, anh/chị kĩ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích độc chất, Bộ mơn Vật lý – hóa lý giúp đỡ, bảo tận tình đạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng ban, thầy tập thể cán công nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – người đào tạo giúp đỡ suốt năm học tập sinh hoạt trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sính viên Lê Đình Hải MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Các acid amin 1.2 Sơ lược sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2.1 Cơ chế tách sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) 1.2.2 Pha tĩnh 1.2.3 Pha động 1.2.4 Ưu điểm phương pháp HILIC 1.3 Xác định pH pha động HILIC 1.4 Sơ lược phương pháp phân tích acid amin có 10 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu 14 2.2.1 Hóa chất 14 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 14 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch làm việc 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.3.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril 17 2.3.2 Khảo sát thời gian lưu acid amin số pha động pha tĩnh khác 17 2.3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp tách đồng thời số acid amin HILIC 17 2.4 Phương pháp thực nghiệm 17 2.4.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril 17 2.4.2 Khảo sát thời gian lưu acid amin số pha tĩnh pha động khác 19 2.4.3 Xây dựng thẩm định phương pháp tách đồng thời số acid amin HILIC 20 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril 23 3.1.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch acid thay đổi tỉ lệ acetonitril 23 3.1.2 Khảo sát thay đổi pH dung dịch đệm/muối nồng độ pha loãng acetonitril 25 3.2 Khảo sát thời gian lưu acid amin số pha tĩnh pha động khác 26 3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 26 3.2.2 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh Zorbax NH2 (150x4,6mm, 5μm) với pha động khác 27 3.2.3 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh Zorbax RX-Sil (150 x 4,6 mm, µm) với pha động khác 28 3.2.4 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh Supelco Ascentis Silica (250x4,6 mm, μm) với pha động khác 30 3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp tách đồng thời số acid amin HILIC 31 3.3.1 Xây dựng phương pháp tách đồng thời số acid amin 31 3.3.2 Thẩm định phương pháp tách đồng thời acid amin 34 3.4 Bàn luận 36 3.4.1 Ý nghĩa khảo sát pH dung dịch thay đổi tỉ lệ acetonitril 36 3.4.2 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh pha động khác 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitril ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic AQC 6-aminoquinolyl-N- 6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl carbamate hydroxysuccinimidyl tắt carbamat Điện di mao quản CE Capilary electrophoresis CNBF Chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride Cloro-3,5dinitrobenzotrifluorid DABS-Cl Dimethylamino- Dimethylamino- azobenzensulfonyl chlorid azobenzensulfonyl clorid DAD Diod array detector Detector mảng diod ESI Electrospray ionisation Bộ ion hóa tia điện tử FOMC 9-fluorenylmethyl chloroformate 9-fluorenylmethyl cloroformat HILIC HPLC Hydrophilic interaction Sắc ký lỏng tương tác thân chromatography nước High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Phân tích khối phổ NBD-F 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3- 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa- diazol 1,3-diazol Normal phase liquid Sắc ký lỏng pha thuận NP-LC chromatography OPA ortho-phthalaldehyde Aldehyd (o) – phthalic PITC Phenylisothiocyanate Phenylisothiocyanat RP-LC Reverse phase liquid Sắc ký lỏng pha đảo chromatography Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối UPLC Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu chromatography UV Ultra violet Bức xạ tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Nội dung 1.1 Tên gọi, tên viết tắt, pI acid amin 1.2 Một số phương phát phân tích acid amin 11 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát 20 3.1 Giá trị sspKa acid formic acid acetic thay 23 Trang đổi tỉ lệ ACN 3.2 Kết khảo sát khả tách acid amin thơm 33 (Phe, Tyr) thay đổi thành phần pha động 3.3 Độ phù hợp hệ thống phương pháp tách đồng 35 thời acid amin 3.4 Kết xác định giới hạn phát phương pháp 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức tổng quát acid amin 1.2 Tính lưỡng tính acid amin 3 1.3 Các chế lưu giữ chủ yếu triển khai HILIC 2.1 Cách xác định tỉ số tín hiệu/độ nhiễu (S/N) 22 3.1 Sự thay đổi sspKa theo tỉ lệ ACN(%) acid acetic 23 acid formic 3.2 Mối quan hệ tỉ lệ 𝑠𝑠𝑝𝐾𝑎 / 𝑤 𝑤𝑝𝐾𝑎 theo tỉ lệ ACN(%) 24 3.3 Quan hệ sspKa wwpKa acid hữu mạch 25 thẳng tỉ lệ ACN khác 3.4 Sự biến đổi swpH dung dịch đệm acid acetic:amoni 25 acetat (2:1), đệm acid acetic:amoni acetat (1:1), muối amoni acetat 2,5,10 mM theo tỉ lệ ACN 3.5 Sắc ký đồ mẫu Prolin pha nước, amoni 27 acetat, dung môi pha động 10 3.6 Kết thời gian lưu số acid amin cột amino 28 11 3.7 Thời gian lưu acid amin biểu thị qua hệ số 29 chọn lọc với Tryptophan αTrp acid amin pha động có swpH thay đổi 12 3.8 Sắc ký đồ tách acid amin thơm 33 13 3.9 Sắc ký đồ chương trình tách đồng thời acid amin 34 14 3.10 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu phương pháp 36 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả tách acid amin thơm (Phe, Tyr) thay đổi thành phần pha động Pha động Chất phân tích tR w1/2 ACN:Amoni acetat 10 mM Phe 8,545 0,318 75:25 Tyr 8,849 0,3443 ACN:Amoni acetat 10 mM Phe 11,346 0,404 80:20 Tyr 12,140 0,623 ACN:Amoni acetat 15 mM Phe 11,791 0,4406 80:20 Tyr 12,72 0,4564 ACN:Amoni acetat 15 mM Phe 18,435 0,4867 85:15 Tyr 20,431 0,5933 Rs 0,54 0,87 1,22 2,18 Tuy pic Phenylalanin Tyrosin tách điều kiện pha động ACN:Amoni acetat 15 mM (85:15) thời gian phân tích tương đối lớn Mặt khác, nhóm acid amin rửa giải cột Silica, áp dụng chương trình cho nhóm acid amin thời gian chương trình sắc ký lớn Do vậy, điều chỉnh tăng tốc độ dòng từ 0,8 lên mL/phút để rút ngắn thời gian lưu chất phân tích Khi tăng tốc độ dòng, thời gian lưu giữ rút ngắn, Phenylalanin Tyrosin cho kết tách tốt (Rs ≈ 2) ACN:Amoni acetat 15mM 85:15, 1,0mL/phút Phe Tyr Trp Hình 3.8 Sắc ký đồ tách acid amin thơm Chương trình sử dụng để chạy sắc ký cho nhóm acid amin tiếp theo: Leucin, Methionin, Isoleucin, Cystein Quan sát đáp ứng Methionin Cystein phân tử có lưu huỳnh (S) nên hấp thụ quang tốt so 33 với acid amin không nhân thơm khác Leucin Isoleucin không quan sát đáp ứng hấp thụ quang ngun nhân: • Leucin isoleucin hấp thụ quang • Thời gian lưu lớn (>20 phút) khiến pic bị doãng chân nhiều, chiều cao đỉnh đáp ứng thấp, không ghi nhận pic Các nhóm acid amin acid amin không nhân thơm, khả hấp thụ quang Tương tự Leucin Isoleucin, acid amin lại khơng ghi nhận đáp ứng Do phương pháp xây dựng cho phép tách đồng thời acid amin: Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin, Cystein hỗn hợp chứa nhiều acid amin với điều kiện sắc ký sau: • Pha tĩnh: Cột Supelco Ascentis Silica (250x4,6 mm, μm) • Pha động: ACN:Amoni acetat 15 mM 85:15 • Tốc độ dòng: mL/phút • Bước sóng phát hiện: 205 nm • Thời gian phân tích: 30 phút Hình 3.9 Sắc ký đồ chương trình tách đồng thời acid amin 3.3.2 Thẩm định phương pháp tách đồng thời acid amin a Độ phù hợp hệ thống Tiến hành chạy sắc ký lặp lại lần dung dịch chuẩn hỗn hợp acid amin theo chương trình xây dựng Kết thu trình bày bảng 3.6 34 Bảng 3.3 Độ phù hợp hệ thống phương pháp tách đồng thời acid amin STT tR(Trp) tR(Phe) tR(Tyr) tR(Met) tR(Cys) 15,480 17,433 19,343 21,538 24,830 15,440 17,395 19,291 21,499 24,561 15,477 17,428 19,333 21,527 24,696 15,455 17,417 19,314 21,517 24,621 15,436 17,396 19,299 21,504 24,583 15,478 17,434 19,345 21,543 24,821 TB 15,461 17,417 19,320 21,521 24,685 RSD(%) 0,13 0,10 0,12 0,08 0,48 Kết cho thấy RSD(%) thời gian lưu pic acid amin nằm giới hạn cho phép (RSD