Nguyễn song toàn xác định cholesterol trong thực phẩm, thực phẩm chức năng bằng sắc ký khí khối phổ (gc ms) khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN SONG TOÀN XÁC ĐỊNH CHOLESTEROL TRONG THỰC PHẨM, THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN SONG TOÀN MÃ SINH VIÊN: 1801694 XÁC ĐỊNH CHOLESTEROL TRONG THỰC PHẨM, THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Vũ Ngân Bình ThS Vũ Ngọc Tú Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiền, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Ngân Bình ThS Vũ Ngọc Tú – người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn trưởng khoa ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, anh Phùng Công Lý anh chị công tác khoa Độc học Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hỗ trợ giúp đỡ em suốt trình thực nghiên cứu khoa Em gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo mơn Hóa phân tích – Độc chất, thầy Ban giám hiệu, phịng Đào tạo giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp q trình học tập trường Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bênh cạnh ủng hộ em để hồn thành khóa luận cách tốt Trong q trình thực đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót, kính mong thầy đưa góp ý, đánh giá để khóa luận em thêm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Song Toàn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cholesterol 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Vai trò cholesterol hoạt động sinh lý thể 1.1.3 Vai trò cholesterol chế bệnh lý 1.1.4 Quy định hành 1.2 Tổng quan quy trình phân tích cholesterol thực phẩm 1.2.1 1.3 Quy trình xử lý mẫu .6 Phương pháp sắc ký khí – khối phổ .8 1.3.1 Hệ thống GC 1.3.2 Hệ thống khối phổ 10 1.3.3 Các nghiên cứu thực xác định cholesterol .11 1.3.4 5α-cholestan .15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.2.1 Chất chuẩn .16 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 16 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ: 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.3.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 17 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích .19 2.3.3 Áp dụng phương pháp 22 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 23 3.1.1 Khảo sát nồng độ dung dịch KOH xà phịng hóa 23 3.1.2 Khảo sát nhiệt độ xà phịng hóa .24 3.1.3 Khảo sát thời gian xà phịng hóa 24 3.1.4 Khảo sát dung môi chiết 25 3.1.5 Khảo sát hỗn hợp chất dẫn xuất 26 3.1.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu .26 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích .29 3.2.1 Độ đặc hiệu .29 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống .30 3.2.3 Giới hạn định lượng, giới hạn phát .31 3.2.4 Đường chuẩn độ tuyến tính .31 3.2.5 Độ độ chụm .32 3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích hàm lượng cholesterol 34 Chương 4: Kết luận kiến nghị .38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 5AC 5α-cholestane 5α-cholestan AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa học phân tích thống BSTFA N,OBis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide N,OBis(trimethylsilyl)trifloroacetamid CHO Cholesterol Cholesterol DMF Dimethylformamide Dimethylformamid EI Electron Impact Va chạm electron FID Flame ionization detector Detector ion hóa lửa GC Gas Chromatography Sắc ký khí GLC Gas–liquid chromatography Sắc ký khí-lỏng GSC Gas–solid chromatography Sắc ký khí-rắn HMDS Hexamethyldisilazane Hexamethyldisilazan High-performance liquid chromatography The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use Sắc ký lỏng hiệu cao KOH Potassium hydroxide Kali hydroxit LDL Low-Density Lipoproteins Lipoprotein tỉ trọng thấp LDL-C low-density lipoprotein-cholesterol Cholesterol lipoprotein tỉ trọng thấp MS Mass spectrometry Phương pháp khối phổ TMCS Chlorotrimethylsilane Chlorotrimethylsilan HPLC ICH Hội đồng quốc tế hai hóa yêu cầu kỹ thuật dược phẩm dùng cho người TMS Trimethylsilyl Trimethylsilyl USFDA U.S Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ USP US Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ UV Ultraviolet Tia tử ngoại DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học cholesterol Hình 1.2 Cấu trúc màng tế bào Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống GC-MS Hình 1.4 Sơ đồ phận khối phổ 11 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo 5α-cholestan .15 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 18 Hình 3.1 Kết khảo sát nồng độ KOH 23 Hình 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng xà phịng hóa 24 Hình 3.3 Kết khảo sát thời gian xà phịng hóa .25 Hình 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 25 Hình 3.5 Khảo sát hỗn hợp chất dẫn xuất 26 Hình 3.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu .28 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng .29 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn dung môi 29 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn .29 Hình 3.10 Kết tỉ số S/N mức nồng độ 31 Hình 3.11 Kết thẩm định độ tuyến tính 32 Hình 3.12 Sắc ký đồ số mẫu sữa a, Sữa gạo rang b, Sữa tươi tiệt trùng c, Sữa chua uống d, Sữa bột .34 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu thực để xác định cholesterol 12 Bảng 3.1 Tỉ lệ ion chất phân tích chuẩn nội .30 Bảng 3.2 Số điểm IP CHO 5AC .30 Bảng 3.3 Kết thời gian lưu 30 Bảng 3.4 Kết diện tích pic 30 Bảng 3.5 Độ chệch điểm chuẩn 32 Bảng 3.6 Kết độ thu hồi độ chụm 33 Bảng 3.7 Kết xác định hàm lượng cholesterol mẫu thực phẩm 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển, người bị vào nhịp sống hối để theo kịp với phát triển Chính điều khiến nhiều người khơng có đủ thời gian để chăm sóc thân, bỏ qua điều tưởng nhỏ bé vô quan trọng, đố bữa ăn hàng ngày Nhiều người lựa chọn thực phẩm qua loa, không quan tâm đến chất lượng hay hàm lượng dinh dưỡng thực phẩm họ ăn uống, hay chọn thực phẩm chế biến sẵn nhằm giảm bớt thời gian cho việc ăn uống nấu nướng Thói quen tưởng vơ hại vơ tình dẫn đến nhiều hậu không mong muốn, nguyên nhân khơng phải loại đồ ăn an tồn với sức khỏe người dùng Nếu chúng gây ngộ độc lập tức, ta dễ dàng nhận biết né tránh, nhiên có nhiều loại thực phẩm gây hại từ từ, thứ gây hại bên loại thực phẩm tác nhân gây bệnh âm thầm, gây bệnh bệnh nhân dùng nhiều Đây yếu tố mang lại nhiều hậu từ đến từ thực phẩm Cholesterol yếu tố vậy, gây nhiều loại bệnh tật xã hội, phổ biến bệnh hệ tim mạch Trên giới chưa có quy định cụ thể giới hạn cholesterol thực phẩm, nhiên với chứng rõ ràng ảnh hưởng cholesterol lên sức khỏe, quan y tế khuyến cáo hạn chế lượng cholesterol nạp vào thể Việc biết lượng cholesterol thực phẩm giúp người tiêu dùng đưa lựa chọn cân đối thực phẩm sử dụng hàng ngày để đưa thực đơn tốt cho sức khỏe Vì vậy, phương pháp xác định cholesterol thực phẩm nghiên cứu để định lượng cholesterol nhanh, xác thuận tiện Một phương pháp phổ biến để xác định cholesterol sử dụng sắc ký khí Hiện Việt Nam, Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia công bố Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12385:2018 hướng dẫn xác định hàm lượng cholesterol thực phẩm sử dụng sắc ký khí với detector ion hóa lửa (FID) Tuy nhiên quy trình xử lý mẫu TCVN 12385:2018 phức tạp, quy trình chiết sử dụng dung môi toluen dễ tạo nhũ tương, nhũ tương tạo khó bị phá hủy gây khó khăn việc làm dịch chiết Vì lý đó, chúng tơi thực đề tài “Xác định cholesterol thực phẩm, thực phẩm chức sắc ký khí khối phổ (GC-MS)” nhằm cải tiến quy trình xử lý mẫu phương pháp nhanh đơn giản Đề tài nhắm tới mục tiêu: Xây dựng quy trình xử lý mẫu thẩm định quy trình xử lý mẫu xây dựng quy trình định lượng cholesterol thực phẩm thực phẩm chức phương pháp GC-MS Ứng dụng phương pháp để xác định cholesterol mẫu mua thị trường Chương 4: Kết luận đề xuất  Kết luận Sau trình nghiên cứu, đề tài đạt mục tiêu đề ra, cụ thể: Đã xây dựng thành công quy trình xử lý mẫu để xác định cholesterol thực phẩm sử dụng 5α-cholestan làm nội chuẩn GC-MS với quy trình cụ thể trình bày Quy trình xây dựng xử lý mẫu phương pháp xà phịng hóa trực tiếp với thời gian phù hợp, quy trình chiết sử dụng dung mơi n-hexan thực đơn giản so với dung môi toluen dùng TCVN 12385:2018 [2] Thẩm định phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC, ICH Phương pháp định lượng cholesterol nồng độ ppm (tương đương 50μg cholesterol lượng mẫu cân) thực phẩm Ứng dụng phương pháp xây dựng để thực phân tích mẫu có thị trường sản phẩm từ sữa động vật đa phần chứa cholesterol với hàm lượng tương đối cao Các sản phẩm sữa thực vật khơng chứa cholesterol  Đề xuất Phương pháp ứng dụng mở rộng số hướng nghiên cứu khác nhau: - Nghiên cứu cải tiến quy trình xử lý mẫu: giảm lượng dung mơi chiết cần sử dụng, giảm thời gian xử lý mẫu, ứng dụng để đưa quy trình định lượng nhanh - - - chóng tiết kiệm với độ độ lặp lại tương đương Nghiên cứu thay đổi điều kiện sắc ký trường hợp thay đổi chuẩn nội khơng có chất chuẩn nội phương pháp nghiên cứu, cần điều kiện sắc ký phù hợp với chuẩn nội Nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng phương pháp: cải tiến phương pháp để định lượng đồng thời nhiều hợp chất có khung cấu trúc sterol phytosterol hormone steroid Nghiên cứu thay đổi điều kiện sắc ký để giảm mức LOQ phương pháp, giúp định lượng mẫu chứa cholesterol hàm lượng thấp 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích Tập II: Phân tích dụng cụ, Nhà xuất Y học, Hà Nội Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu (2018), TCVN 12385:2018, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ, Hà Nội Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Agellon, Luis B (2008), "Metabolism and function of bile acids", Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes, Elsevier, pp 423-440 Apstein, M D and Carey, M C (1996), "Pathogenesis of cholesterol gallstones: a parsimonious hypothesis", Eur J Clin Invest 26(5), pp 343-52 Baek, Amy E and Nelson, Erik R (2016), "The contribution of cholesterol and its metabolites to the pathophysiology of breast cancer", Hormones and Cancer 7, pp 219-228 Chen, Yan-Zong, et al (2015), "Determination of cholesterol and four phytosterols in foods without derivatization by gas chromatography-tandem mass spectrometry", Journal of food and drug analysis 23(4), pp 636-644 Commission, European (2021), "Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 of 22 March 2021 on the performance of analytical methods for residues of pharmacologically active substances used in food-producing animals and on the interpretation of results as well as on the methods to be used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC and 98/179/EC", Off J Eur Union 180, pp 84109 Connor, W E., et al (1978), "The plasma lipids, lipoproteins, and diet of the Tarahumara indians of Mexico", Am J Clin Nutr 31(7), pp 1131-42 10 Cook, Robert P (2015), Cholesterol: chemistry, biochemistry, and pathology, Elsevier 11 Cruz, M L., et al (1994), "Effects of infant nutrition on cholesterol synthesis rates", Pediatr Res 35(2), pp 135-40 12 Dinh, T and Thompson, L (2015), "Cholesterol: Properties, processing effects, and determination", Encyclopedia of Food and Health, Elsevier Inc., pp 60-69 13 Du, M and Ahn, DU (2002), "Simultaneous analysis of tocopherols, cholesterol, and phytosterols using gas chromatography", Journal of Food Science 67(5), pp 1696-1700 14 Fletouris, DJ, et al (1998), "Rapid determination of cholesterol in milk and milk products by direct saponification and capillary gas chromatography", Journal of Dairy Science 81(11), pp 2833-2840 15 Folch, Jordi, Lees, Mark, and Sloane Stanley, Gerald H (1957), "A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues", J biol Chem 226(1), pp 497-509 16 Goldstein, Joseph L and Brown, Michael S (2015), "A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins", Cell 161(1), pp 161-172 17 Goluszko, P and Nowicki, B (2005), "Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells", Infection and immunity 73(12), pp 7791-7796 18 Harmonisation, International Conference on (2005), "'Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology", ICH harmonised tripartite guideline, pp 113 19 Holst, Jennifer P, et al (2004), "Steroid hormones: relevance and measurement in the clinical laboratory", Clinics in laboratory medicine 24(1), pp 105-118 20 Holzbach, R T., et al (1973), "Cholesterol solubility in bile Evidence that supersaturated bile is frequent in healthy man", J Clin Invest 52(6), pp 1467-79 21 Hussain, Ghulam, et al (2019), "Role of cholesterol and sphingolipids in brain development and neurological diseases", Lipids in health and disease 18(1), pp 1-12 22 INTERNATIONAL, AOAC (2023), Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Oxford University Press, Oxford 23 Jirsa, M and Groen, A K (2001), "Role of biliary proteins and non-protein factors in kinetics of cholesterol crystallisation and gallstone growth", Front Biosci 6, pp E154-67 24 King, AJ, et al (1998), "Rapid method for quantification of cholesterol in turkey meat and products", Journal of food science 63(3), pp 382-385 25 Klatt, Low V, Mitchell, Barbara A, and Smith, Randall L (1995), "Cholesterol analysis in foods by direct saponification—gas chromatographic method: collaborative study", Journal of AOAC International 78(1), pp 75-79 26 Krause, Martin R and Regen, Steven L (2014), "The structural role of cholesterol in cell membranes: from condensed bilayers to lipid rafts", Accounts of chemical research 47(12), pp 3512-3521 27 Naeemi, Esmaeel D, et al (1995), "Rapid and simple method for determination of cholesterol in processed food", Journal of AoAC international 78(6), pp 15221524 28 Nordestgaard, BG and Zilversmit, DB (1988), "Large lipoproteins are excluded from the arterial wall in diabetic cholesterol-fed rabbits", Journal of lipid research 29(11), pp 1491-1500 29 Oguro, Hideyuki (2019), "The roles of cholesterol and its metabolites in normal and malignant hematopoiesis", Frontiers in endocrinology 10, p 204 30 Orlova, Elena V, et al (1999), "Three-dimensional structure of low density lipoproteins by electron cryomicroscopy", Proceedings of the National Academy of Sciences 96(15), pp 8420-8425 31 Portincasa, P., et al (1994), "Gallbladder motor function in gallstone patients: sonographic and in vitro studies on the role of gallstones, smooth muscle function and gallbladder wall inflammation", J Hepatol 21(3), pp 430-40 32 Portincasa, P., Moschetta, A., and Palasciano, G (2006), "Cholesterol gallstone disease", Lancet 368(9531), pp 230-9 33 Sekhar, M Sonal, et al (2020), "Physiological role of cholesterol in human body", Dietary sugar, salt and fat in human health, Elsevier, pp 453-481 34 Simons, Kai and Ehehalt, Robert (2002), "Cholesterol, lipid rafts, and disease", The Journal of clinical investigation 110(5), pp 597-603 35 Simons, Kai and Sampaio, Julio L (2011), "Membrane organization and lipid rafts", Cold Spring Harbor perspectives in biology 3(10), p a004697 36 Skålén, Kristina, et al (2002), "Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis", Nature 417(6890), pp 750-754 37 Spady, D K and Dietschy, J M (1988), "Interaction of dietary cholesterol and triglycerides in the regulation of hepatic low density lipoprotein transport in the hamster", J Clin Invest 81(2), pp 300-9 38 Spady, D K., Woollett, L A., and Dietschy, J M (1993), "Regulation of plasma LDL-cholesterol levels by dietary cholesterol and fatty acids", Annu Rev Nutr 13, pp 355-81 39 Tabas, Ira, Williams, Kevin Jon, and Borén, Jan (2007), "Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications", Circulation 116(16), pp 1832-1844 PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 Kết khảo sát nhiệt độ xà phịng hóa PL-1 Phụ lục 1.2 Kết khảo sát nồng độ KOH PL-1 Phụ lục 1.3 Kết khảo sát hỗn hợp dẫn xuất PL-1 Phụ lục 1.4 Kết khảo sát thời gian xà phịng hóa PL-2 Phụ lục 1.5 Kết khảo sát dung môi chiết PL-2 Phụ lục 2.1 Kết đường chuẩn sắc ký đồ tương ứng PL-3 Phụ lục 3.1 Diện tích pic ion CHO – mẫu thêm chuẩn .PL-4 Phụ lục 3.2 Diện tích pic ion CHO – mẫu chuẩn dung môi PL-4 Phụ lục 3.3 Diện tích pic ion 5AC – mẫu thêm chuẩn PL-4 Phụ lục 3.4 Diện tích pic ion 5AC – mẫu chuẩn dung môi .PL-4 Phụ lục 4.1 Kết chạy lặp lại mẫu chuẩn - chuẩn nội .PL-5 Phụ lục 4.2 Kết chạy lặp lại mẫu chuẩn - chất phân tích PL-5 Phụ lục 5.1 Kết thẩm định độ lặp lại độ PL-6 Phụ lục 5.2 Kết thẩm định độ độ lặp lại nồng độ 5ppm PL-7 Phụ lục 5.3 Kết thẩm định độ độ lặp lại nồng độ 10ppm 20ppm .PL-8 Phụ lục 6.1 Kết định lượng cholesterol mẫu thực tế .PL-9 Phụ lục 6.2 Sắc ký đồ định lượng mẫu thực PL-10 Phụ lục 1: Kết khảo sát Phụ lục 1.1 Kết khảo sát nhiệt độ xà phịng hóa Phụ lục 1.2 Kết khảo sát nồng độ KOH Phụ lục 1.3 Kết khảo sát hỗn hợp dẫn xuất PL-1 Phụ lục 1.4 Kết khảo sát thời gian xà phịng hóa Phụ lục 1.5 Kết khảo sát dung môi chiết PL-2 12.4 12.5 Time (min) 5alpha-cholestane RT:12.45 100 50 12.26 12.3 12.4 12.5 Time (min) 5alpha-cholestane RT:12.45 100 50 12.4 12.5 Time (min) 5alpha-cholestane RT:12.46 100 50 12.3 12.4 12.5 Time (min) 5alpha-cholestane RT:12.44 100 50 12.2 12.6 12.3 12.4 12.5 Time (min) 12.6 14.15 15.66 15 19 NL: 4.34E7 m/z= 128.50-129.50+ 326.50-327.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-10ppm 18.70 17.27 16 17 Time (min) 18 19 NL: 7.66E7 m/z= 128.50-129.50+ 326.50-327.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-20ppm Cholesterol RT:16.48 100 50 14.28 14 12.7 17.29 15.35 15 16 17 Time (min) 18.69 18 19 NL: 2.01E8 m/z= 128.50-129.50+ 326.50-327.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-50ppm Cholesterol RT:16.51 100 50 14.77 15.66 14 12.7 NL: 4.08E6 m/z= 216.50217.50 MS ICIS Std-100ppm 18 Cholesterol RT:16.47 14 NL: 7.71E6 m/z= 216.50217.50 MS ICIS Std-50ppm 16 17 Time (min) 50 12.7 NL: 8.05E6 m/z= 216.50217.50 MS ICIS Std-20ppm 17.81 18.70 15.57 15 100 12.66 12.6 14.15 14 12.64 12.29 0 12.62 12.25 12.31 12.3 50 12.7 NL: 8.71E6 m/z= 216.50217.50 MS ICIS Std-10ppm NL: 2.10E7 m/z= 128.50-129.50+ 326.50-327.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-5ppm Cholesterol RT:16.47 100 12.66 12.6 Relative Abundance 12.3 Relative Abundance Relative Abundance 50 NL: 8.39E6 m/z= 216.50217.50 MS ICIS Std-5ppm Relative Abundance 5alpha-cholestane RT:12.45 100 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Phụ lục 2: Kết đường chuẩn 15 18 19 NL: 1.99E8 m/z= 128.50-129.50+ 326.50-327.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-100ppm Cholesterol RT:16.49 100 50 14.74 14 12.6 18.71 17.29 16 17 Time (min) 15 15.84 17.25 16 17 Time (min) 18.61 18 19 Phụ lục 2.1 Kết đường chuẩn sắc ký đồ tương ứng PL-3 Phụ lục 3: Kết độ đặc hiệu Phụ lục 3.1 Diện tích pic ion CHO – mẫu thêm chuẩn Phụ lục 3.2 Diện tích pic ion CHO – mẫu chuẩn dung môi RT: 11.89 - 12.99 NL: 6.29E6 m/z= 216.50217.50 MS Dau-Spk5ppm-3 RT: 12.46 MA: 14184867 100 90 Relative Abundance 80 70 60 50 40 30 12.54 20 12.55 12.18 12.19 10 11.94 12.04 11.98 12.25 12.10 12.13 12.27 12.60 12.37 12.63 12.68 12.73 12.76 12.90 12.94 12.82 RT: 12.46 MA: 7352285 100 NL: 3.45E6 m/z= 148.50149.50 MS Dau-Spk5ppm-3 90 80 70 12.54 60 50 12.13 40 30 11.92 12.00 12.17 12.19 12.27 12.29 12.32 12.35 12.04 20 12.58 12.60 12.65 12.71 12.73 12.88 12.91 12.82 12.98 10 11.9 12.0 12.1 12.2 12.3 12.4 Time (min) 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 Phụ lục 3.3 Diện tích pic ion 5AC – mẫu thêm chuẩn RT: 12.06 - 12.74 NL: 9.31E6 m/z= 216.50217.50 MS Std-5ppm RT: 12.46 MA: 22885939 100 90 Relative Abundance 80 70 60 50 40 30 20 10 12.17 12.09 12.12 12.18 12.23 12.26 12.29 12.30 12.36 12.52 12.38 12.54 12.57 12.62 12.64 12.67 12.69 12.71 NL: 4.60E6 m/z= 148.50149.50 MS Std-5ppm RT: 12.45 MA: 11207255 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 12.07 12.12 12.14 12.17 12.19 12.51 12.23 12.26 12.29 12.31 12.35 12.37 12.54 12.55 12.59 12.65 12.66 12.71 12.10 12.15 12.20 12.25 12.30 12.35 12.40 Time (min) 12.45 12.50 12.55 12.60 12.65 12.70 Phụ lục 3.4 Diện tích pic ion 5AC – mẫu chuẩn dung môi PL-4 Phụ lục 4: Kết độ phù hợp hệ thống Phụ lục 4.1 Kết chạy lặp lại mẫu chuẩn - chuẩn nội Phụ lục 4.2 Kết chạy lặp lại mẫu chuẩn - chất phân tích PL-5 Phụ lục 5: Độ độ lặp lại Phụ lục 5.1 Kết thẩm định độ lặp lại độ PL-6 Phụ lục 5.2 Kết thẩm định độ độ lặp lại nồng độ 5ppm PL-7 Phụ lục 5.3 Kết thẩm định độ độ lặp lại nồng độ 10ppm 20ppm PL-8 Phụ lục 6: Kết mẫu thực: Phụ lục 6.1 Kết định lượng cholesterol mẫu thực tế PL-9 Phụ lục 6.2 Sắc ký đồ định lượng mẫu thực PL-10