Xác định phytosterol trong sữa bằng sắc ký khí khối phổ (gc ms) khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NHƯ NGỌC XÁC ĐỊNH PHYTOSTEROL TRONG SỮA BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NHƯ NGỌC Mã sinh viên: 1801503 XÁC ĐỊNH PHYTOSTEROL TRONG SỮA BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Vũ Ngân Bình ThS Vũ Ngọc Tú Nơi thực hiện: Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Vũ Ngân Bình ThS Vũ Ngọc Tú, người thầy trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà thầy giáo khoa Hóa Phân tích Kiểm nghiệm thuốc, anh/chị khoa Độc học dị nguyên- Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, ban lãnh đạo đặc biệt ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc HVCH Phùng Công Lý quan tâm giúp đỡ em nhiệt tình trình thực đề tài Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên, ủng hộ em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận cách tốt Trong trình thực đề tài, dù nỗ lực đề tài cịn thiếu sót hạn chế, em mong nhận ý kiến đóng góp cho khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Như Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Phytosterol .2 1.1.1 Giới thiệu chung .2 1.1.2 Cấu trúc phytosterol 1.1.3 Hấp thu phytosterol chế gây ức chế hấp thu cholesterol 1.2 Phương pháp xác định phytosterol nước giới 1.3 Sắc ký khí khối phổ [1, 2] .9 1.3.1 Sắc ký khí 1.3.2 Detetor khối phổ (MS) 10 1.3.2.1 Nguồn ion hóa 10 1.3.2.2 Bộ phận phân tích khối 10 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Chất chuẩn 12 2.1.3 Dung mơi, hóa chất .12 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.2.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 13 2.2.1.1 Khảo sát nồng độ KOH/Ethanol 13 2.2.1.2 Khảo sát dung môi chiết .13 2.2.1.3 Khảo sát thời gian thủy phân 13 2.2.1.4 Khảo sát nhiệt độ thủy phân 13 2.2.1.5 Khảo sát điều kiện dẫn xuất 14 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích [5, 6, 7] 14 2.2.2.1 Độ đặc hiệu 14 2.2.2.2 Độ phù hợp hệ thống 15 2.2.2.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) [5] .15 2.2.2.4 Đường chuẩn 15 2.2.2.5 Độ chụm (Độ lặp lại) 16 2.2.2.6 Độ (Độ thu hồi) 17 2.2.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19 3.1 Pha chất chuẩn 19 3.1.1 Pha chuẩn gốc phytosterol .19 3.1.2 Pha chuẩn hỗn hợp 20 µg/mL 19 3.1.3 Pha chuẩn nội 5α-cholestan 19 3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu .19 3.2.1 Điều kiện GC-MS để phân tích phytosterol 21 3.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 21 3.2.2.1 Khảo sát nồng độ KOH/Ethanol 21 3.2.2.2 Khảo sát dung môi chiết .22 3.2.2.3 Khảo sát thời gian thủy phân 22 3.2.2.4 Khảo sát nhiệt độ thủy phân 23 3.2.2.5 Khảo sát điều kiện dẫn xuất 24 3.2.3 Phương pháp xử lý mẫu tối ưu 24 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích .25 3.3.1 Độ đặc hiệu 25 3.3.2 Độ phù hợp hệ thống 28 3.3.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 29 3.3.4 Đường chuẩn 30 3.3.5 Độ thu hồi, độ lặp lại 33 3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 4.1 Kết luận .42 4.2 Đề xuất 42 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ABC ATP Binding Cassette Protein cassette liên kết ATP ACAT Cholesterol acyltransferase ASG Acylated steryl glycols BSTFA N,OBis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide CI Chemical ionization Ion hóa hóa học CVD Cardiovascular Disease Bệnh tim mạch DMF Dimethylformamid EI Electron impact ionization FDA Food and Drug Administration FS Free sterols Sterol tự GC Gas Chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrometry Sắc ký khí khối phổ GLC Gas liquid chromatography Sắc ký khí lỏng GRAS Generally Recognized As Safe GSC Gas solid chromatography HMDS Hexamethyldisilane HSE Hydroxycinnamic acid esters IS Internal Standardization Chất nội chuẩn LDL-C Low Density LipoproteinsCholesterol Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp MS Mass Spectrometry Detector khối phổ NCI Ion hóa va chạm điện tử Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ “Thường Cơng nhận An tồn”- Chứng nhận FDA Sắc ký khí rắn Kỹ thuật ion hóa học âm PCI Kỹ thuật ion hóa học dương RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCF The Scientific Committee on Food Ủy ban Khoa học Thực phẩm SE Steryl esters SG Steryl glycosides TMCS Trimethylchlorosilane DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1-1: Các phương pháp xác định phytosterol nước giới Bảng 2-1: Tỷ lệ ion mức cho phép 14 Bảng 2-2: Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại 17 Bảng 2-3: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác 18 Bảng 3-1: Bảng ion số điểm IP 25 Bảng 3-2: Bảng tỷ lệ ion 26 Bảng 3-3: Bảng thời gian lưu tR 26 Bảng 3-4: Kết độ phù hợp hệ thống 29 Bảng 3-5: Giới hạn phát & giới hạn định lượng 29 Bảng 3-6: Đường chuẩn phytosterol .32 Bảng 3-7: Độ thu hồi lặp lại β-sitosterol sữa bột 33 Bảng 3-8: Độ thu hồi lặp lại β-sitosterol sữa lỏng .34 Bảng 3-9: Độ thu hồi lặp lại campesterol sữa bột 35 Bảng 3-10: Độ thu hồi lặp lại campesterol sữa lỏng 36 Bảng 3-11: Độ thu hồi lặp lại brassicasterol sữa bột 37 Bảng 3-12: Độ thu hồi lặp lại brassicasterol sữa lỏng 38 Bảng 3-13: Kết xác định hàm lượng phytosterol mẫu thực 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1-1: Cấu trúc chung phytosterol Hình 1-2: Cấu trúc phytosterol phổ biến cholesterol Hình 1-3: Cơ chế ức chế hấp thu cholesterol phytosterol Hình 3-1: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến……………………………………… 20 Hình 3-2: Khảo sát nồng độ KOH/Ethanol 21 Hình 3-3: Khảo sát dung môi chiết 22 Hình 3-4: Khảo sát thời gian thủy phân 23 Hình 3-5: Khảo sát nhiệt độ thủy phân 23 Hình 3-6: Khảo sát điều kiện dẫn xuất 24 Hình 3-7: Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu chuẩn (B) mẫu trắng thêm chuẩn (C) βsitosterol 27 Hình 3-8: Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu chuẩn (B) mẫu trắng thêm chuẩn (C) campesterol 27 Hình 3-9: Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu chuẩn (B) mẫu trắng thêm chuẩn (C) brassicasterol 28 Hình 3-10: Sắc ký đồ S/N β-sitosterol, campesterol brassicasterol 30 Hình 3-11: Đường chuẩn β-sitosterol 31 Hình 3-12: Đường chuẩn Campesterol 31 Hình 3-13: Đường chuẩn Brassicasterol 32 β-sitosterol Campesterol Brassicasterol IS NL: 2.48E6 m/z= 216.50-217.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-1ppm-1 IS RT:10.41 100 50 9.17 9.53 10.04 11.05 10 11 Relative Abundance Relative Abundance II.2 Độ phù hợp hệ thống 11.71 100 50 14.20 15.13 14 15 17.73 16 17 Time (min) 100 50 13.78 15.16 16.17 13 14 15 Time (min) 16 50 9.19 9.53 9.87 11.17 10 11 11.69 100 100 50 12.85 13 13.75 14 15.16 15 Time (min) 16.18 16 Relative Abundance Relative Abundance NL: 7.70E5 m/z= 342.97-343.97+ 382.01-383.01 MS ICIS Std-1ppm-2 17 NL: 5.03E6 m/z= 68.68-69.68+ 128.66-129.66+ 364.98-365.98+ 380.04-381.04 MS ICIS Std-1ppm-1 14.68 50 13.45 12.65 13 14 Time (min) 15 NL: 5.05E5 m/z= 356.98-357.98+ 396.03-397.03 MS ICIS Std-1ppm-2 beta_sitosterol RT:16.16 100 50 15.16 14.26 14 15 17.76 16 17 Time (min) Time (min) Campesterol RT:14.68 18 Brassicasterol RT:13.78 17 NL: 2.21E6 m/z= 216.50-217.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-1ppm-2 IS RT:10.41 100 Relative Abundance NL: 8.07E5 m/z= 342.97-343.97+ 382.01-383.01 MS ICIS Std-1ppm-1 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Time (min) Campesterol RT:14.68 NL: 5.42E5 m/z= 356.98-357.98+ 396.03-397.03 MS ICIS Std-1ppm-1 beta_sitosterol RT:16.17 18 NL: 4.04E6 m/z= 68.68-69.68+ 128.66-129.66+ 364.98-365.98+ 380.04-381.04 MS ICIS Std-1ppm-2 Brassicasterol RT:13.77 100 14.68 50 13.44 13 14 Time (min) 15 100 Relative Abundance Relative Abundance NL: 2.16E6 m/z= 216.50-217.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-1ppm-3 IS RT:10.41 50 9.14 9.52 10.12 10 10.91 11.68 11 100 50 15.14 14 17.73 15 16 17 Time (min) 100 50 12.95 13.77 13 15.15 14 16.16 15 Time (min) 16 NL: 2.51E6 m/z= 216.50-217.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-1ppm-4 50 9.19 9.53 10.06 11.01 11.49 10 11 100 50 15.15 13.77 12.60 13 14 16.16 15 Time (min) 16 13.46 12.60 13 14 Time (min) NL: 2.53E6 m/z= 216.50-217.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-1ppm-5 50 9.52 9.87 10.96 10 11.46 11 100 100 50 12.83 13.77 13 14 15.13 15 Time (min) 16.15 16 Relative Abundance Relative Abundance NL: 9.00E5 m/z= 342.97-343.97+ 382.01-383.01 MS ICIS Std-1ppm-5 17 NL: 5.59E5 m/z= 356.98-357.98+ 396.03-397.03 MS ICIS Std-1ppm-4 50 15.14 14 17.71 15 16 17 Time (min) 18 NL: 5.28E6 m/z= 68.68-69.68+ 128.66-129.66+ 364.98-365.98+ 380.04-381.04 MS ICIS Std-1ppm-4 Brassicasterol RT:13.77 100 14.68 50 13.44 13 14 Time (min) 15 NL: 5.85E5 m/z= 356.98-357.98+ 396.03-397.03 MS ICIS Std-1ppm-5 beta_sitosterol RT:16.16 100 50 15.16 14 15 17.74 16 17 Time (min) Time (min) Campesterol RT:14.67 15 beta_sitosterol RT:16.16 17 IS RT:10.40 100 Relative Abundance 100 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance NL: 8.57E5 m/z= 342.97-343.97+ 382.01-383.01 MS ICIS Std-1ppm-4 NL: 4.56E6 m/z= 68.68-69.68+ 128.66-129.66+ 364.98-365.98+ 380.04-381.04 MS ICIS Std-1ppm-3 14.67 50 Time (min) Campesterol RT:14.67 18 Brassicasterol RT:13.77 17 IS RT:10.41 100 Relative Abundance NL: 8.34E5 m/z= 342.97-343.97+ 382.01-383.01 MS ICIS Std-1ppm-3 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Time (min) Campesterol RT:14.67 NL: 5.62E5 m/z= 356.98-357.98+ 396.03-397.03 MS ICIS Std-1ppm-3 beta_sitosterol RT:16.16 18 NL: 5.26E6 m/z= 68.68-69.68+ 128.66-129.66+ 364.98-365.98+ 380.04-381.04 MS ICIS Std-1ppm-5 Brassicasterol RT:13.77 100 14.67 50 13.45 13 14 Time (min) 15 100 50 9.17 9.52 9.94 11.28 10 11 Relative Abundance Relative Abundance NL: 2.60E6 m/z= 216.50-217.50+ 367.50-368.50 MS ICIS Std-1ppm-6 IS RT:10.41 100 50 14.37 15.15 14 15 100 50 13.77 12.59 13 14 15.14 15 Time (min) II.3 Đường chuẩn Sữa bột Sữa lỏng 16.15 16 Relative Abundance Relative Abundance NL: 9.44E5 m/z= 342.97-343.97+ 382.01-383.01 MS ICIS Std-1ppm-6 17 17.74 16 17 Time (min) Time (min) Campesterol RT:14.68 NL: 6.26E5 m/z= 356.98-357.98+ 396.03-397.03 MS ICIS Std-1ppm-6 beta_sitosterol RT:16.16 18 NL: 5.42E6 m/z= 68.68-69.68+ 128.66-129.66+ 364.98-365.98+ 380.04-381.04 MS ICIS Std-1ppm-6 Brassicasterol RT:13.77 100 14.68 50 13.43 12.63 13 14 Time (min) 15 II.4 Độ lặp lại, thu hồi Sữa bột Sữa lỏng III Mẫu thực IV Chất chuẩn