TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN MẬT ONG – PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NEONICOTINOIDS BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN XXXX Xuất lần MẬT ONG – PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NEONICOTINOIDS BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) Honey – Determination of neonicotinoids residues by liquid chromatography tanderm mass spectrometry LC-MS/MS HÀ NỘI – 2022 TCVN xxxx TCVN xxxx Lời nói đầu TCVN xxxx Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN xxxx TCVN xxxx TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN XXXX Mật ong – Phương pháp xác định dư lượng neonicotinoids sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Honey – Determination of neonicotinoids residues by liquid chromatography tanderm mass spectrometry (LC-MS/MS) Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định dư lượng neonicotinoid gồm: Acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram mật ong sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Giới hạn định lượng chất 10 µg/kg Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi (nếu có) Nguyên tắc Mẫu thử axit hóa, dư lượng neonicotinoids mật ong chiết axetonitril, làm dịch chiết Sau phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần Thuốc thử Trong tiêu chuẩn sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích trừ có yêu cầu khác Nước cất dùng để phân tích phịng thí nghiệm theo TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696 : 1987) 4.1 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho LC-MS 4.2 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC 4.3 Nước (H2O), loại dùng cho LC-MS TCVN xxxx 4.4 Magie Sulphate (MgSO4), loại dùng cho phân tích 4.5 Natri axetat (CH3COONa), loại dùng cho phân tích 4.6 Axít axetic (CH3COOH), loại dùng cho phân tích 4.7 Axít formic (HCOOH), loại dùng cho phân tích 4.8 Dung dịch axetonitril 0,1 % axít axetic theo thể tích Lấy ml axít axetic (4.6) vào bình định mức 000 ml (5.12) định mức tới vạch axetonitril (4.2), lắc kỹ Dung dịch bảo quản nhiệt độ phịng bền đến tháng 4.9 Dung dịch axetonitril: nước (30:70) Lấy 30 ml axetonitril (4.1) pha vào 70 ml nước (4.3) ống đong (5.11) cho vào lọ thủy tinh 100 ml (5.15), lắc kỹ Dung dịch bảo quản nhiệt độ phịng bền đến tháng 4.10 Chất chuẩn acetamiprid, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.11 Chất chuẩn imidacloprid, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.12 Chất chuẩn thiacloprid, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.13 Chất chuẩn thiamethoxam, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.14 Chất chuẩn nitenpyram, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.15 Chất chuẩn clothianidin, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.16 Chất nội chuẩn clothianidin –d3, độ tinh khiết ≥ 98,0 % 4.17 Dung dịch chuẩn gốc acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, nồng độ 000 µg/ml axetonitril Cân 50 mg ± 0,1 mg loại chất chuẩn (4.10); (4.11); (4.12); (4.13); (4.14); (4.15); cân phân tích (5.2) vào bình định mức dung tích 50 ml (5.12) riêng biệt Hồ tan định mức đến vạch metanol (4.8) để dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 000 µg/ml Dung dịch bảo quản nhiệt độ âm 20 0C bền đến tháng CHÚ THÍCH: Lượng cân phải điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 µg/ml sau tính toán hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết nhà sản xuất 4.18 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, nồng độ 10 µg/ml axetonitril TCVN xxxx Hút 100 µl từ dung dịch chuẩn gốc acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram (4.20) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch axetonitril (4.1) Dung dịch bảo quản nhiệt độ âm 20 0C bền đến tháng 4.19 Dung dịch chuẩn hỗn hợp (S2) acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, µg/ml dung dịch axetonitril: nước Hút ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (4.21) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với dung dịch axetonitril: nước (4.9) Dung dịch chuẩn bị ngày 4.20 Dung dịch nội chuẩn gốc clothianidin –d3 nồng độ 000 µg/ml axetonitril Cho ml axetonitril (4.1) vào lọ có chứa mg chất nội chuẩn (4.15) thu dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 µg/ml Dung dịch bảo quản nhiệt độ âm 20 0C bền đến tháng 4.21 Dung dịch nội chuẩn trung gian (IS1) clothianidin -d3, 10 µg/ml axetonitril Hút 100 µl từ dung dịch nội chuẩn gốc clothianidin –d3 (4.20) cho vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với axetonitril (4.1) Dung dịch bảo quản nhiệt độ âm 20 0C bền đến tháng 4.22 Dung dịch nội chuẩn (IS2) clothianidin -d3, µg/ml trong dung dịch axetonitril: nước Hút ml dung dịch nội chuẩn trung gian (4.21) cho vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với dung dịch axetonitril: nước (4.9) Dung dịch bảo quản nhiệt độ âm 20 0C bền đến tháng 4.23 Dung môi pha động kênh B, axetonitril chứa 0,1 % axít formic Hút ml axít formic (4.7) cho vào 000 ml axetonitril (4.1), khuấy Dung dịch bảo quản nhiệt độ phòng bền đến tuần 4.24 Dung mơi pha động kênh A, nước chứa 0,1 % axít formic Hút ml axít formic (4.7) cho vào 000 ml nước (4.3), khuấy Dung dịch bảo quản nhiệt độ phịng bền đến tuần Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường, cụ thể sau: 5.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) – Bơm kênh dung môi gradient; TCVN xxxx – Đầu dò ba tứ cực với nguồn ion hóa ESI; – Máy tính phần mềm phân tích; – Hệ thống bơm mẫu tự động 5.2 Cân phân tích, có độ xác đến 0,01 mg 5.3 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 200 r/min đến 15 000 r/min 5.4 Máy vortex, tốc độ tối đa 000 r/min 5.5 Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 0C 5.6 Micropipet, dung tích µl đến 50 µl, 10 µl đến 100 µl, 20 µl đến 200 µl, 100 µl đến 000 µl ml đến ml 5.7 Máy lắc ngang 5.8 Bể siêu âm 5.9 Pipet pasteur, nhựa dung tích ml 5.10 Tủ lạnh âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 0C đến âm 30 0C 5.11 Ống đong thủy tinh, dung tích 100 ml 5.12 Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml 000 ml 5.13 Ống ly tâm, dung tích 50 ml 5.14 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml 5.15 Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 000 ml 5.16 Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 µm đường kính 13 mm 5.17 Lọ đựng dung dịch chuẩn, dung tích 10 ml, 50 ml 5.18 Ống thủy tinh, dung tích ml Lấy mẫu Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Mẫu phòng thử nghiệm nhận phải mẫu không bị hư hỏng thay đổi trình vận chuyển bảo quản TCVN xxxx Chuẩn bị mẫu 7.1 Chuẩn bị mẫu thử Cân 10 g ± 0,01 g mẫu đồng vào ống ly tâm 50 ml (5.13) Thêm 100 µl dung dịch nội chuẩn (4.22) Lắc máy vortex (5.4) 30 s sau để yên 15 trước tiến hành bước 7.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu mật ong khơng có neonicotinoid Trong lơ mẫu phân tích, chuẩn bị tối thiểu mẫu trắng 7.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát Mẫu kiểm sốt chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 20 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp (4.22) 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn (4.25) để có nồng độ chuẩn mẫu kiểm sốt 20 µg/kg nồng độ chất nội chuẩn 100 µg/kg Lắc máy vortex (5.4) 30 s sau để yên 15 trước tiến hành bước 7.4 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn Đường chuẩn dựng mẫu trắng (7.2) thêm chuẩn nồng độ khác 0; 7,5 µg/kg; 15 µg/kg; 30 µg/kg; 60 µg/kg 120 µg/kg Cho dung dịch chuẩn hỗn hợp (4.18), (4.19) dung dịch hỗn hợp nội chuẩn (4.22) vào ống ly tâm có chứa mẫu trắng theo Bảng 1, lắc 15 s máy vortex (5.4), sau để yên 15 trước tiến hành bước Bảng – Nồng độ dung dịch chuẩn dùng để xây dựng đường chuẩn Nồng độ chất chuẩn mẫu (µg/kg) Thể tích dung dịch chuẩn (4.19) thêm vào (µl) Thể tích dung dịch chuẩn (4.18) thêm vào (µl) Thể tích dung dịch nội chuẩn (4.22) thêm vào (µl) - - 100 7,5 75 - 100 15 150 - 100 30 - 30 100 60 - 60 100 120 - 120 100 Cách tiến hành 8.1 Chiết mẫu làm mẫu TCVN xxxx Cho vào mẫu 10 ml nước cất; Lắc máy vortex (5.4) đến mẫu tan hoàn toàn; Thêm 10 ml axetonitril 1% axít axetic (4.8); Lắc máy lắc ngang (5.7) 15 min; Thêm g natri axetate (4.5), g Magie Sulphate (4.4); Lắc máy voltex (5.4) min; Ly tâm mẫu 500 r/min máy ly tâm lạnh (5.3) min; Hút lớp trên, lọc màng lọc nylon (5.16), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (5.14); Phân tích thiết bị LC-MS/MS (5.1) 8.2 Tiến hành thử nghiệm LC-MS/MS 8.2.1 Yêu cầu chung Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột điều kiện đầu dò MS/MS điện thế, lượng, khí…để chất phân tích thu tỉ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) lớn cho phân mảnh ion tồn điểm nhận dạng (IP) bao gồm ion mẹ, ion con; pic nhiễu vị trí pic phân tích 8.2.2 Các điều kiện sau cho thấy phù hợp để phân tích 8.2.2.1 Điều kiện LC Cột sắc ký: RP C18, đường kính 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt m Nhiệt độ cột: (40 ± 5) 0C Tốc độ dòng: 0,2 ml/min Thể tích bơm mẫu: l Thời gian phân tích: 10 Pha động: Chạy theo chương trình gradient thể theo Bảng Bảng – Điều kiện gradient cho hệ thống LC 10 TCVN xxxx 8.2.2.2 Thời gian (min) Kênh A Nước chứa 0,1 % axít formic (4.24) Kênh B Axetonitril chứa 0,1 % axít formic (4.23) 97 0,5 97 6,0 97 7,0 97 7,5 97 10,0 97 Điều kiện MS Kiểu ion hóa: ESI (+) Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 0C Nhiệt độ hóa dung mơi: 400 0C Tốc độ dịng khí làm bay dung mơi: 600 L/h Tốc độ dịng khí qua khối nón: 20 L/h Áp suất khí va chạm: Argon, p = 2,93×10-3 mbar Điện mao quản: 2,0 kV Bảng – Điều kiện phân mảnh MS/MS STT Kháng sinh Thời gian lưu (min) Ion mẹ (m/z) Acetamiprid 4,5 223,0 Clothianidin 4,4 249,6 Imidacloprid 4,5 256,0 Nitenpyram 3,7 271,0 Thiacloprid 4,8 253,0 Thiamethoxam 4,1 292,0 Clothianidin-d3 4.42 252,6 56* 126 132* 169 175* 209 224* 237 126* Năng lượng va chạm CE (eV) 17 20 16 14 20 17 22 20 20 186 16 181* 22 211 10 135 16 Ion (m/z) Năng lượng (Sample Cone) (V) 25 16 22 22 25 20 16 11 TCVN xxxx CHÚ THÍCH: ion ký hiệu ( * ) dùng để định lượng 8.3 Trình tự bơm mẫu  Bơm dung môi kiểm tra máy: axetonitril (4.1);  Bơm dung dịch lập đường chuẩn;  Bơm mẫu trắng;  Bơm mẫu kiểm soát;  Bơm mẫu thử; 8.4 Tính tốn biểu thị kết 8.4.1 Dựng đường chuẩn Dựng phương trình bậc hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu (x) theo phương trình đường chuẩn: RF = ax + b Trong đó: b điểm cắt đường chuẩn với trục tung; a hệ số góc đường chuẩn RF tính theo cơng thức: RF  Sp Sp IS Trong đó: Sp: diện tích pic ion định lượng chất cần phân tích; SpIS: diện tích pic ion thứ cấp chất nội chuẩn Hàm lượng chất phân tích mẫu, X, microgam kilogam (μg/kg) tính theo Cơng thức sau: X C V F m Trong đó: C nồng độ chất phân tích dung dịch mẫu thử, tính microgam lít (μg/l); 12 TCVN xxxx V thể tích cuối mẫu thử, tính mililit (ml); F hệ số pha lỗng mẫu đo (nếu khơng pha loãng, F = 1); m khối lượng mẫu thử, tính gam (g) Kết biểu thị đến hai chữ số thập phân sau dấu phẩy Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: – Thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; – Phương pháp lấy mẫu sử dụng, có; – Phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; – Các chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết thử nghiệm; – Kết thử nghiệm thu 13 TCVN xxxx Thư mục tài liệu tham khảo [1] Qui trình nội VS1/QT/235/TD “Mật ong – Xác định dư lượng nhóm neonicotinoids phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần” [2] Journal of Agricultural and Food Chemistry: LC-MS/MS Analysis of Neonicotinoid Insecticides in Honey Methodology and Residue Findings in Austrian Honeys [3] Hindawi: UHPLC/MS-MS Analysis of Six Neonicotinoids in Honey by Modified QuEChERS: Method Development,Validation, and Uncertainty Measurement [4] UCT: Analysis of Neonicotinoids in Honey by QuEChERS and UHPLC-MS/MS _ 14