Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Vũ Ngân Bình PHÂN TÍCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 9720210 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Phản biện 1……………………………………… ……………………………………… Phản biện 2……………………………………… ……………………………………… Phản biện 3……………………………………… ……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại……………………………………………………… Vào hồi………… giờ…… ngày……….tháng……… năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội A-GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Sắc ký lỏng tương tác thân nước (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC) kỹ thuật tách sử dụng pha tĩnh phân cực pha động phân cực, có khả lưu giữ tốt chất phân cực, nghiên cứu Alpert vào năm 1990 Đặc điểm chế, lưu giữ yếu tố ảnh hưởng HILIC nghiên cứu Acid amin đơn vị cấu trúc protein, tham gia tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng thể Các chế phẩm chứa acid amin sử dụng trường hợp thể bị thiếu protein cần bổ sung nhanh thời gian ngắn, điều trị cân dẫn truyền thần kinh, chữa bệnh gan, tiểu đường,… Acid amin có tính phân cực cao, lưu giữ sắc ký lỏng pha đảo, chúng thường dẫn xuất hoá Với chế phẩm chứa acid amin thành phần khác thường sử dụng nhiều kỹ thuật khác để định lượng HILIC khắc phục nhược điểm lưu giữ acid amin RPLC Bên cạnh đó, HILIC lưu giữ chất phân cực khác Như phân tích đồng thời acid amin với thành phần phân cực khác chế phẩm đa thành phần HILIC Rối loạn chuyển hóa acid amin tình trạng bệnh gặp lại có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người bệnh Các enzym tham gia trình tổng hợp chuyển hóa acid amin bị thay đổi hoạt tính, dẫn đến nồng độ acid amin thể bị thay đổi đột biến, nguy hiểm đến tính mạng Một nhóm rối loạn chuyển hoá hay gặp rối loạn chuyển hoá acid amin thơm Phân tích acid amin dịch sinh học giúp sàng lọc, chẩn đốn, đánh giá tình trạng bệnh nhân theo dõi hiệu điều trị phác đồ chữa bệnh Nền mẫu dịch sinh học phức tạp, nghiên cứu phân tích acid amin sử dụng kỹ thuật dẫn xuất hố phân tích RPLC -UV phương pháp áp dụng Bệnh viện Nhi Trung ương thường gặp khó khăn độ chọn lọc Các nghiên cứu sử dụng RPLC không dẫn xuất hoá kết nối với detector MS thường sử dụng pha động có nhiều nước, gặp vấn đề tính tương thích dung mơi pha động với detector MS Trong đó, pha động HILIC chứa tỷ lệ cao dung môi hữu cơ, thể ưu điểm tương thích với detector MS Do đề tài “Phân tích số acid amin sắc ký lỏng tương tác thân nước” thực Mục tiêu luận án Mục tiêu Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời số acid amin thành phần khác chế phẩm HILIC-DAD xác định số yếu tố ảnh hưởng đến lưu giữ hình dáng pic HILIC Mục tiêu Xây dựng phương pháp phân tích số acid amin thơm huyết tương HILIC-MS/MS nhằm hỗ trợ theo dõi điều trị bệnh rối loạn chuyển hoá acid amin Những đóng góp luận án * Nghiên cứu Việt Nam xác định số yếu tố ảnh hưởng tới lưu giữ acid amin HILIC * Nghiên cứu biện luận việc sử dụng DEA để cải thiện hình dáng pic acid amin phân tích HILIC * Nghiên cứu Việt Nam sử dụng HILIC phân tích acid amin chế phẩm huyết tương, cụ thể là: - Đã xây dựng quy trình định lượng ba acid amin tryptophan, phenylalanin, tyrosin chế phẩm thuốc tiêm truyền HILIC - Đã xây dựng quy trình định lượng acid amin hoạt chất phân cực chế phẩm đa thành phần HILIC-UV gồm: + Quy trình phân tích glycin, cystein amoni glycyrrhizinat + Quy trình phân tích cystin vitamin B6 + Quy trình phân tích methionin paracetamol - Đã xây dựng quy trình định lượng tryptophan, phenylalanin tyrosin huyết tương người HILIC-MS/MS Ý nghĩa luận án Luận án xác định yếu tố ảnh hưởng tới lưu giữ acid amin HILIC, làm cho xây dựng phương pháp phân tích nhiều acid amin chế phẩm, dịch sinh học mẫu khác Luận án cho thấy rõ ưu điểm HILIC phân tích chế phẩm chứa acid amin hoạt chất khác Thay phải sử dụng nhiều phương pháp cho acid amin hoạt chất khác chế phẩm, đề tài xây dượng phương pháp đơn giản định lượng đồng thời thành phần Đây hướng tiếp tục khai thác Luận án xây dựng phương pháp HILIC-MS/MS đơn giản, đặc hiệu để phân tích acid amin thơm dịch sinh học, ứng dụng phân tích mẫu huyết tương người bình thường, người nghi mắc bệnh rối loạn chuyển hoá acid amin thơm, người theo dõi điều trị rối loạn chuyển hoá acid amin thơm Bố cục luận án Luận án gồm chương, 46 bảng, 55 hình, 117 tài liệu tham khảo (10 Tài liệu tiếng Việt 107 tài liệu tiếng Anh), phụ lục Luận án có 138 trang gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Chương Tổng quan (33 trang); Chương Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương Kết nghiên cứu (68 trang); Chương Bàn luận (19 trang); Kết luận đề xuất (2 trang) B-NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN HILIC kỹ thuật sắc ký sử dụng pha tĩnh pha động phân cực, có khả lưu giữ chất phân tích phân cực Pha tĩnh sử dụng phân tích HILIC bề mặt phân cực, phổ biến silica khơng dẫn xuất silica dẫn xuất hố với nhiều nhóm chức phân cực khác Pha động HILIC thường hỗn hợp dung môi hữu trộn lẫn với nước (phổ biến acetonitril) dung dịch acid/đệm/muối nước, nước dung môi rửa giải mạnh Cơ chế tách HILIC phức tạp, gồm chế phân bố chất phân tích lớp nước hấp phụ bề mặt pha tĩnh khối dung dịch lại pha động, chế hấp phụ, chế trao đỏi ion tổ hợp chế Các yếu tố ảnh hưởng tới lưu giữ, chọn lọc, hình dáng pic HILIC tiếp tục nghiên cứu Acid amin đơn vị cấu trúc protein, phân tử sinh học đóng vai trị chủ yếu hình thành, trì cấu trúc chức thể sống Các chế phẩm chứa acid amin sử dụng trường hợp thể bị thiếu protein cần bổ sung nhanh thời gian ngắn, điều trị cân dẫn truyền thần kinh, chữa bệnh gan, tiểu đường, ngăn ngừa ung thư… Để phân tích acid amin chế phẩm, kỹ thuật sử dụng phổ biến sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp dẫn xuất hoá mẫu trước sau cột, phát detector UV huỳnh quang Khó khăn phân tích chế phẩm chứa acid amin chế phẩm chứa hoạt chất khác acid amin, thường hoạt chất phân cực Thông thường phải áp dụng nhiều phương pháp để phân tích thành phần này, sử dụng phương pháp dẫn xuất hoá acid amin phương pháp RPLC cho hoạt chất cịn lại HILIC có khả lưu giữ tốt chất phân cực acid amin hoạt chất có độ phân cực acid amin, phân tích đồng thời chất, đơn giản hố q trình phân tích Bệnh rối loạn chuyển hoá (RLCH) acid amin bẩm sinh rối loạn khiếm khuyết di truyền dẫn đến thiếu giảm hoạt tính enzym chuyển hóa acid amin Hậu acid amin chất chuyển hóa liên quan bị tích luỹ thể chuyển hướng sang đường chuyển hoá khác, tạo thành sản phẩm chuyển hóa khác Do rối loạn chuyển hoá acid amin đặc trưng nồng độ bất thường một vài acid amin chất chuyển hố Nồng độ acid amin dịch sinh học bệnh nhân cần theo dõi thường xuyên để đánh giá hiệu điều trị Các acid amin thơm thường dùng chẩn đốn điều trị RLCH acid amin thơm gồm có gồm có phenylalanin tyrosin bệnh Phenylketon niệu (PKU), tyrosin huyết (TYR II TYR III) Có nhiều kỹ thuật định lượng acid amin dịch sinh học khối phổ hai lần, sắc ký lỏng, sắc ký khí, điện di mao quản Kỹ thuật sử dụng nhiều phương pháp phân tích acid amin dịch sinh học sắc ký lỏng kết nối detector MS Hầu hết phương pháp phải dẫn xuất hóa với tác nhân khác Phương pháp phân tích HILIC kết nối detector khối phổ khơng cần thiết phải dẫn xuất; dung môi hữu tủa protein huyết tương phù hợp với pha động HILIC; pha động giàu dung mơi hữu HILIC thích hợp với detector khối phổ Do kỹ thuật có nhiều ưu điểm phân tích acid amin chất phân cực huyết tương Như vậy, việc xây dựng phương pháp định lượng đồng thời nhiếu acid amin chế phẩm, huyết tương định lượng đồng thời acid amin hoạt chất khác chế phẩm HILIC khả thi cần thiết Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến lưu giữ acid amin đóng vai trị quan trọng xây dựng phương pháp định lượng nhiều acid amin HILIC CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu - Chất chuẩn: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh, Sigma, Toronto Research Chemicals - Mẫu huyết tương (Viện Huyết học truyền máu Trung Ương), mẫu huyết tương chuẩn tham chiếu (Clincheck® - Control) - Dung mơi, hố chất đạt tiêu chuẩn LC-MS/MS, HPLC tinh khiết phân tích 2.1.2 Trang thiết bị - Hệ thống máy HPLC Agilent 1100, 1200 series phần mềm Chemstation (Trường Đại học Dược Hà Nội) - Hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1260 Infinity LC kết nối detector Agilent 6460 Triple Quad MS (Khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia) - Các trang thiết bị, dụng cụ khác phòng thí nghiệm Trường Đại học Dược Hà Nội Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia 2.2 Đối tượng nghiên cứu Mẫu thử gồm chế phẩm tiêm truyền chứa acid amin (Kidmin Nephosteril), chế phẩm chứa acid amin hoạt chất phân cực khác (Amiphargen, Cystine B6 Baillieu, Pasafe) 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian lưu số acid amin HILIC a) Khảo sát pha tĩnh Khảo sát hai pha tĩnh: cột Zorbax Rx-Sil có bề mặt hạt nhồi silica khơng dẫn xuất, cột Zorbax NH2 có bề mặt hạt nhồi silica dẫn xuất tạo nhóm aminopropyl bề mặt Dựa thay đổi thời gian lưu phân tích acid amin hai pha tĩnh pha động khác để xác định ảnh hưởng pha tĩnh tới lưu giữ acid amin b) Khảo sát pha động Cố định số điều kiện sắc ký khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh pha động hỗn hợp acetonitril dung dịch acid, muối đệm pH, nồng độ khác Ghi lại thời gian lưu acid amin pha động khác theo thành phần pha động loại pha tĩnh kể Dựa liệu thời gian lưu acid amin điều kiện chạy sắc ký khác để đưa dự đoán ảnh hưởng pH nồng độ muối thời gian lưu acid amin 2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích chế phẩm chứa acid amin HILIC 2.3.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích số acid amin thơm chế phẩm - Xây dựng phương pháp: khảo sát điều kiện sắc ký: pha tĩnh, thành phần pha động, tỷ lệ pha động - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) tiêu chí độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn, độ đúng, độ xác - Áp dụng phương pháp chế phẩm tiêm truyền 2.3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng amoni glycyrrhizinat, cystein glycin chế phẩm - Xây dựng phương pháp + Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: dung môi pha mẫu + Khảo sát điều kiện sắc ký: pha tĩnh, pha động (thành phần, tỷ lệ) - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) tiêu chí độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn, độ đúng, độ xác - Áp dụng phương pháp chế phẩm Amiphargen 2.3.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng cystin vitamin B6 chế phẩm - Xây dựng phương pháp + Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: dung mơi pha mẫu, thể tích dung môi, thời gian siêu âm, thời gian lắc mẫu + Khảo sát điều kiện sắc ký: pha động (thành phần, tỷ lệ) - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) tiêu chí độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn, độ đúng, độ xác - Áp dụng phương pháp chế phẩm Cystin B6 Baillieu 2.3.2.4 Xây dựng phương pháp định lượng methionin paracetamol chế phẩm - Xây dựng phương pháp + Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: dung môi pha mẫu + Khảo sát điều kiện sắc ký: pha tĩnh, pha động (thành phần, tỷ lệ) - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) tiêu chí độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn, độ đúng, độ xác, độ ổn định phương pháp - Áp dụng phương pháp chế phẩm Pasafe amin theo nhóm tương tự (trừ acid amin có liên kết hydro với pha tĩnh, gồm cystein, glutamin, serin, threonin) 6,5 tR AA (phút) 5,5 4,5 3,5 3 Trp Phe Tyr Met Cys Leu Ile pH PĐ Thr Ser Val Ala Gly Gln Pro Hình 3.3 Thời gian lưu số AA theo pH pha động, cột Zorbax Rx-Sil (150 x 4,6 mm, µm) 3.2 Xây dựng phương pháp phân tích chế phẩm chứa acid amin HILIC 3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng số acid amin thơm chế phẩm tiêm truyền Từ khảo sát phần 3.1, phân tích acid amin cột silica, acid amin có mạch R khơng mang điện rửa giải theo nhóm Do chế phẩm đa acid amin, tiến hành nghiên cứu tìm điều kiện tách acid amin thuộc nhóm rửa giải sớm nhóm - acid amin thơm gồm tryptophan, phenylalanin tyrosin * Quy trình chuẩn bị mẫu: Mẫu thử Kidmin Nephrosteril pha loãng 100 lần 66,7 lần pha động trước phân tích, lọc qua màng PTFE 0,45 µm, thể tích tiêm 20 µL * Điều kiện sắc ký: - Pha tĩnh: Cột Inertsil Amide (150 x 4,6 mm; µm) (GL Science, Tokyo, Nhật Bản); 11 - Pha động: hỗn hợp ACN với dung dịch amoni acetat 125 mM, tỷ lệ 80:20, tốc độ dòng 0,8 ml/phút; - Bước sóng phát hiện: 210 nm (Phe) 230 nm (Trp, Tyr) * Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1),cho kết độ phù hợp hệ thống đảm bảo; chọn lọc với chất phân tích; tuyến tính khoảng nồng độ định lượng (23-54 ppm với Trp, 43100 ppm với Phe 3-7 ppm với Tyr); độ lặp lại ngày khác ngày (RSD % 0,8-2%); độ đảm bảo ba mức nồng độ (độ thu hồi 98,0-102%) * Áp dụng phương pháp hai mẫu thử Kidmin Nephrosteril, kết % hàm lượng so với nhãn Trp, Phe Tyr mẫu thử Kidmin 110,5%; 97,3% 89,6%; Trp Phe mẫu thử Nephosteril 112,0% 88,9% 3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng acid amin hoạt chất khác chế phẩm 3.2.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng amoni glycyrrhizinat, cystein glycin chế phẩm * Quy trình xử lý mẫu: Mẫu thử pha loãng 10 lần nước cất hai lần, lọc qua màng cellulose 0,45 µm, thể tích tiêm µL * Điều kiện sắc ký: - Pha tĩnh: cột Agilent Zorbax RX silica (250 ´ 4,6 mm; μm) giữ nhiệt độ 30°C; - Pha động: hỗn hợp acetonitril - đệm phosphat (3 mM, pH 3,5), tỷ lệ 75:25 (tt/tt); tốc độ dòng 0,8 ml/phút; - Bước sóng phát hiện: 200 nm (Cys, Gly) 254 nm (AG) * Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) cho kết độ phù hợp hệ thống đảm bảo; chọn lọc với chất phân tích; tuyến tính khoảng nồng độ định lượng (133-400 ppm với AG, 12 54-163 ppm với Cys 988-2963 ppm với Gly); độ lặp lại ngày khác ngày (RSD 0,9-1,9%); độ đảm bảo ba mức nồng độ (độ thu hồi 99,6-101,3%) * Áp dụng phương pháp mẫu thuốc tiêm Amiphargen, kết % hàm lượng so với nhãn AG, Cys Gly mẫu thử 95,9%; 98,6% 98,0% 3.2.1.2 Xây dựng phương pháp định lượng cystin vitamin B6 chế phẩm * Quy trình xử lý mẫu: Cạo lớp vỏ bao phim, nghiền 20 viên chế phẩm, cân xác khoảng 0,0512 (g) bột chế phẩm (tương ứng với khoảng 40 mg cystin mg vitamin B6) vào bình định mức 50 mL Thêm khoảng 45 mL dung dịch HCl 0,1M, lắc Siêu âm phút, lắc xoáy phút, định mức vừa đủ dung dịch HCl 0,1 M Hút mL dịch vào bình định mức 10 mL, định mức vừa đủ ACN Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu dung dịch thử dùng để định lượng cystin vitamin B6 chế phẩm; tiêm 50 µL * Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh: cột Luna 5u Silica (2) (250 x 4,6 mm; µm) (Phenomenex Torrance, California, Mỹ); - Pha động: Hỗn hợp ACN – amoni acetat 50 mM = 65:35 (tt/tt); tốc độ dịng 1,5 mL/phút; - Bước sóng phát hiện: 250 nm (cystin) 286 nm (vitamin B6) * Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) cho kết độ phù hợp hệ thống đảm bảo; chọn lọc với chất phân tích; tuyến tính khoảng nồng độ định lượng (từ 200-600 ppm với cystin, 25-73 ppm với vitamin B6); độ lặp lại ngày khác ngày (RSD từ 1,3-1,8%); độ đảm bảo ba mức nồng độ (độ thu hồi 98,6-102%) Kết phân tích độ ổn định cho thấy mẫu thử ổn định 13 sau 15 nhiệt độ phòng, mẫu chuẩn ổn định nhiệt độ phòng * Áp dụng phương pháp mẫu viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul, kết % hàm lượng so với nhãn cystin vitamin B6 mẫu Cystine B6 Bailleul 101,6% 97,6% 3.2.1.3 Xây dựng phương pháp định lượng methionin paracetamol chế phẩm * Quy trình xử lý mẫu Xác định khối lượng trung bình viên Cân xác khoảng 1,03 g thuốc nang (tương ứng với 100 mg methionin 500 mg paracetamol) vào bình định mức 50 mL Thêm 30 mL NaOH 0,01%, lắc định mức vừa đủ NaOH 0,01 % Trộn hỗn hợp bình định mức, sau cho vào ống ly tâm Đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút vòng 10 phút Hút dịch xylanh, sau lọc qua màng lọc 0,45 µm vào cốc có mỏ Hút xác 0,50 mL dịch lọc trên, cho vào bình định mức 25,0 mL, định mức vừa đủ MP, thu dung dịch mẫu thử A (dùng cho định lượng methionin) Hút xác 2,00 mL dung dịch A vào bình định mức 10,0 mL, định mức vừa đủ MP, thu dung dịch mẫu thử B (dùng cho định lượng paracetamol); thể tích tiêm 20 µL * Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh: Cột Zorbax Rx Silica (150 x 4,6 mm; 5µm); - Pha động: hỗn hợp ACN – (acid formic 10 mM, diethylamin mM) = 60 : 40 (tt/tt); tốc độ dịng 0,6 mL/phút; - Bước sóng phát hiện: 210 nm (Met) 286 nm (Par) Một phát trình khảo sát điều kiện sắc ký có mặt dietylamin pha động làm giảm lưu giữ methionin không tác động đến lưu giữ paracetamol hai 14 pha tĩnh cyanopropyl silica; làm tăng tính cân xứng pic methionin paracetamil hai pha tĩnh * Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Q2(R1) cho kết độ phù hợp hệ thống đảm bảo; chọn lọc với chất phân tích; tuyến tính khoảng nồng độ định lượng (20-60 ppm với hai chất phân tích); độ lặp lại ngày khác ngày (RSD từ 0,8-1,1%); độ đảm bảo ba mức nồng độ (độ thu hồi 98,1-101,7%) Hình 3.36 Kết thẩm định độ ổn định phương pháp: Ảnh hưởng chung yếu tố khảo sát (a); ảnh hưởng lên hàm lượng Met (b);ảnh hưởng lên tR Met (c); ảnh hưởng lên độ cân xứng pic Met (d) Kết phân tích độ ổn định phương pháp theo mơ hình Plackett Burman – linear (Hình 3.36) cho thấy thời gian lưu, độ cân xứng pic % hàm lượng methionin paracetamol bị tác động thay đổi cột, thay đổi nhỏ % ACN, nồng độ acid formic, nồng độ diethylamin * Áp dụng phương pháp mẫu viên nang mềm Pasafe, kết % hàm lượng so với nhãn paracetamol methionin 99,8% 98,7% 3.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng acid amin thơm huyết tương HILIC-MS/MS 15 * Điều kiện MS: Chất phân tích phát detector MS/MS với nguồn ion hoá ESI(+); mảnh khối lựa chọn (ion mẹ ion định lượng/ion định tính) chất có m/z là: tryptophan 205,1à118,1/146,0; phenylalanin 166,1 103,1/77,2; tyrosin 182,1 165,0/136,0; phenylalanin d5 171,1 106,1/107,1 * Khảo sát mẫu pha mẫu chuẩn: Khảo sát albumin huyết người 4% PBS, albumin huyết bò 1% PBS, nước muối sinh lý NaCl 0,9%, dung dịch tiêm truyền glucose 5%, dung dịch tiêm truyền Ringer lactat, đệm phosphat PBS nước Kết cho thấy hai albumin chứa chất phân tích Mẫu chuẩn nước glucose cho thời gian lưu tyrosin khác mẫu lại mẫu huyết tương Lựa chọn đệm PBS làm * Quy trình xử lý mẫu - Mẫu chuẩn: Hút 20 µL dung dịch PBS, thêm 20 µL dung dịch hỗn hợp chuẩn 20 µL chuẩn nội (Phe-d5 10000 ppb), lắc giây, thêm 780 µL MeOH, lắc xoáy 30 giây, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm, tiêm µL - Mẫu thử (huyết tương): Lắc đều, hút 100 µL huyết tương, thêm 900 µl nước, lắc xoáy 30 giây mẫu huyết tương pha lỗng 10 lần Hút 20 µL huyết tương pha lỗng, thêm 20 µL nước, 20 µL chuẩn nội (Phe-d5 10000 ppb), lắc giây, thêm 780 µL MeOH, lắc xoáy 30 giây, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm, tiêm µL * Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh: Cột Acquity UPLC BEH Amide 130A (150 x 2,1 mm; 1,7 µm) (Waters), tiền cột Acquity UPLC BEH VanGuard 130A (5 x2,1 mm; 1,7 µm) (Waters); - Pha động: hỗn hợp HCOOH 0,1% ACN HCOOH 0,1% nước, tỷ lệ 85:15 (tt/tt), tốc độ dòng 0,3 ml/phút; 16 * Khoảng nồng độ định lượng: từ khoảng 100-30000 ppb, phân tích mẫu huyết tương người bình thường, người mắc bệnh, người điều trị bệnh * Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn FDA Kết cho thấy độ phù hợp hệ thống đảm bảo, chọn lọc với chất phân tích (Hình 3.48), độ tuyến tính đảm bảo khoảng nồng độ 130-40000 ppb; 140-43000 ppb 100-30000 ppb với tryptophan, phenylalanin tyrosin (trọng số 1/x2); độ xác (% tìm lại trung bình từ 101,8-112,8%,RSD < 7%); hiệu suất xử lý mẫu ba chất phân tích IS khoảng 91,1-104,8%; ảnh hưởng mẫu nằm khoảng -9,9 đến 1,6% với Phe, -8,9 đến 5,2% với Trp -14,2 đến -2,7% với Tyr; dung dịch gốc ổn định sau ngày -20oC; mẫu huyết tương huyết tương thêm chuẩn ổn định sau chu kỳ đông, rã đơng (%C cịn lại từ 87,6%-113,5%) ổn định sau ngày -20oC (%C lại từ 91,6-114,4%); mẫu sau xử lý ổn định sau 9h nhiệt độ phòng (%C lại từ 93,8%-112,0%); ảnh hưởng pha lỗng giới hạn (% tìm lại khoảng 100,4%-113,7%, RSD