Theo phương án tách dòng gen lựa chọn, hãy thiết kế primer và xây dựng phương án thực hiên tách dòng gen

Họ tên: Mai Thị Miên MSSV: 20174939 Lớp: KTSH-02 GVHD thí nghiệm: GS Nguyễn Văn Cách BÁO CÁO THÍ NGHIỆM: TIN SINH HỌC ĐỀ TÀI: Theo phương án tách dòng gen lựa chọn, thiết kế primer xây dựng phương án thực hiên tách dòng gen Bài thực hành em lựa chọn tách dòng gen interleukin-6 Canis lupus familiaris (chó nhà) Em muốn tách dịng gen interleukin-6 chó nhà mà chưa biết trình từ đoạn gen nên dựa vào sở liệu trực tuyến NCBI, EBI,… để dự đoán Bước 1: Truy cập vào sở liệu trực tuyến (NCBI) để tìm lồi, chủng có gen interleukin-6 mà có đặc điểm tính trạng, thuộc tính, gần gũi với chó nhà Khi tìm kiếm NCBI, hiển thị nhiều kết với lồi có gen mã hóa interleukin-6 Em chọn lọc gen interleukin-6 lồi gần gũi với chó nhà sau: + Canis familiaris interleukin-6 ( IL-6) mRNA, complete cds – MAM 08-DEC1995 với trình tự gen FASTA: >U12234.1 Canis familiaris interleukin-6 (IL-6) mRNA, complete cds GCCCTCGAGCCCACCAGGAACGAAAGAGAGCTCCATCTGCCCTCCAGGACCCCAGCTATGAACTCCCTCT CCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGC AGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTG ATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAG ACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCA ATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTTTCAGCTACACCTG AATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATGAGTACCAAGATCC TGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACCCAACCACAGACGC CAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGCGTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGG AGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAGCCTGGGCATCTAAGATTGC TGTAGTTCATGGGCATTCCTTTCTCCAGTCAGAAACCTGTGCAGTGGGCACAAAACTTATGTTGTTCTCT GTGAGGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACACTATTTTAATTATTTTTAATTTATTGATATTTAAATATG TGATATGGAGTTAATTTATATAAGTAATAGATATTTATATTTTTTATGAAGTGCCACTTGAAATATTTTA TGTATTCATTTTGAAAAAGTTAACGTAAAATGCTATGCGGCTTGAATATCCTCGATGTTTCGGAGCCAGG TCATTTCTTGGAATGTGTAGGTTTACCTCAAATACATGGCTAACTTATGCATATTTTTAAAAGAAATATT TATACTGTGTTTATATAATGTTTAAATTGTTTTTATACCAATAAACACCTTTTT + Canis familiaris interleukin-6 ( IL-6) mRNA, complete cds – MAM 17-JUL2000 với trình tự gen FASTA: >AF275796.1 Canis familiaris interleukin-6 (IL-6) mRNA, complete cds ATGAACTCCCTCTCCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCC CGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAA AGTGGAAGAACTGATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTT AACAAGTGTGAAGACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAG ATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTT TCAGCTACACCTGAATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATG AGTACCAAGATCCTGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACC CAACCACAGACGCCAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGGCTGAAGCACACAACAATTCA CCTCATCCTGCGGAGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAG + Canis lupus familiaris interleukin (IL-6), mARN MAM 28-APR-2020 với trình tự gen FASTA: >NM_001003301.1 Canis lupus familiaris interleukin (IL6), mRNA GCCCTCGAGCCCACCAGGAACGAAAGAGAGCTCCATCTGCCCTCCAGGACCCCAGCTATGAACTCCCTCT CCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGC AGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTG ATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAG ACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCA ATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTTTCAGCTACACCTG AATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATGAGTACCAAGATCC TGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACCCAACCACAGACGC CAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGCGTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGG AGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAGCCTGGGCATCTAAGATTGC TGTAGTTCATGGGCATTCCTTTCTCCAGTCAGAAACCTGTGCAGTGGGCACAAAACTTATGTTGTTCTCT GTGAGGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACACTATTTTAATTATTTTTAATTTATTGATATTTAAATATG TGATATGGAGTTAATTTATATAAGTAATAGATATTTATATTTTTTATGAAGTGCCACTTGAAATATTTTA TGTATTCATTTTGAAAAAGTTAACGTAAAATGCTATGCGGCTTGAATATCCTCGATGTTTCGGAGCCAGG TCATTTCTTGGAATGTGTAGGTTTACCTCAAATACATGGCTAACTTATGCATATTTTTAAAAGAAATATT TATACTGTGTTTATATAATGTTTAAATTGTTTTTATACCAATAAACACCTTTTT + Vulpes vulpes interleukin mRNA, complete cds, MAM 15-MAY-2007 >EF543193.1 Vulpes vulpes interleukin mRNA, complete cds ATCTGCCCTCCAGGACCCCAGCTATGAACTCCCTCTCCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGT GATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGT CTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTCATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGA GAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAGACAGCAAGGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACA TCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGA ATCACTACCGGTCTTACGGAGTTTCAGCTACACCTGAATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGG AAAATGCCAAGTCTGTGCACACGAGTACCAAGATCCTGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCA GGATGAAGTGACCACTCCGGACCCAACCAGAGACGCCAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGCCGCAGAATGAG TGGCTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGGAGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGCCTGAGGG CTGTTCGGATAATGTAGCCTGGGCATCTAAGATTGCTGTAGTTCATGGGC + Felis catus interleukin (IL6), mRNA, MAM 10-MAY-2020 >NM_001009211.2 Felis rúcatus interleukin (IL6), mRNA GACTCCAGCCATGACCTTCCTCTCCACAAGCGCCTTCAGTCCACTCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTG GTGGTGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGGAGGAGATGCCACCTCAAATAGACTACCACTCA CCTCTGCAGACAAAATGGAAGAACTCATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAAAAAGGAGAT GTGTGACAACTATAACAAATGTGAGGACAGCAAGGAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAATCTTCCGAAA CTGGCAGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCCTGACAAGAATCACTACTG GTCTTCAGGAGTTTCAGATATACCTGAAATTCCTCCAGGACAAGTATGAGGGTGATAAGGAAAATGCCAA GTCTGTGTACACCAGTACTAACGTCCTGCTCCAGATGCTGAAGCGTAAGGGAAAGAATCAGGATGAGGTA ACCATCCCTGTCCCAACCGTAGAAGTTGGCCTGCAGGCTAAGCTGCAGTCACAGGAAGAGTGGCTGAGGC ATACAACAATTCACCTCACCCTTCGAAGGCTGGAGGACTTCCTTCAGTTCAGCCTCAGGGCTGTTCGGAT AATGTAACCTGGGCATCTAAGATTGCTGTAGTTCACGGGCATTCCTTTCTCTGGTCAGAAACCTGTCCAC TGGGCATGTAACTGATGTTGTTCTCTGTGAAGAACGAAAAGTATGAGCGTTA + Bos taurus interleukin (IL6), mRNA , MAM 19-JUN-2020 >NM_173923.2 Bos taurus interleukin (IL6), mRNA CCAGGAACGAAAGAGAGCTCCATCTGCCCTCCAGGAACAGCTATGAACTCCCGCTTCACAAGCGCCTTCA CTCCATTCGCTGTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGACTTCTGCTTTCCCTACCCCGGGTCCCCTGGG AGAAGATTTCAAAAATGACACCACCCCAGGCAGACTACTTCTGACCACTCCAGAGAAAACCGAAGCTCTC ATTAAGCGCATGGTCGACAAAATCTCTGCAATGAGAAAGGAGATATGTGAGAAGAATGATGAGTGTGAAA GCAGCAAGGAGACACTGGCAGAAAATAAGCTGAATCTTCCAAAAATGGAGGAAAAGGACGGATGCTTCCA ATCTGGGTTCAATCAGGCGATTTGCTTGATCAGAACCACTGCTGGTCTTCTGGAGTATCAGATATACCTG GACTACCTCCAGAACGAGTATGAGGGAAATCAGGAAAATGTCAGGGATTTGAGGAAAAATATCAGAACAC TGATCCAGATCCTGAAGCAAAAGATCGCAGATCTAATAACCACTCCAGCCACAAACACTGACCTGCTGGA GAAGATGCAGTCTTCAAACGAGTGGGTAAAGAACGCAAAGATTATCCTCATCCTGAGAAACCTTGAGAAT TTCCTGCAGTTCAGCCTGAGAGCTATTCGGATGAAGTAGCTGGGGCTCCCATGATTGTGGTAGTTCCTGG GCATTCCCTCCTCTGGTCAGAAACCTGTCCACTGGGCACACAACTTATGTTGTTCTCTATGAAGAACTAA AAGTATGAGCGTTAGGACACTATTTTATCTTTAATTTATTGATATTTAAATATGTGATTTTGAGTTAATT TATATACATGATAAGTATTTATATTTTTATGAAGTGCCACTTGAAATATTTTATGTATTTGGTTTGAAAA AGTAACGTAAAAATGGCTATGTGGCTTGAATGTCCTTATTGTTTTGGAGACAAATCATTTCTTGAAATGT GTAGGCTTACCTCAAAAAATTTGCTAACTTATGCATATTTTTAAAGGCATATTTATATTGTATTTATATA ATGTTTAGGCTGTTTTTATAACAATAAACTTCTTTTTTAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA Bước 2: Sử dụng chương trình phân tích cấu trúc chuỗi CLUSTAL OMEGA để tìm kiếm vùng có cấu trúc đặc biệt, phân tích mức độ tương đồng phân ly chuỗi, dự đoán cấu trúc chuỗi xếp tương quan theo quan hệ tiến hóa Trong vùng bảo thủ sử dụng để thiết kế mồi Ta copy trình từ gen bên vào phần mềm CLUSTAL OMEGA để chạy kết thu kết sau: Kết cho thấy chuỗi gen có nhiều vùng bảo thủ vùng phân ly (vùng có dấu * vùng bảo thủ, cịn khơng có dấu * vùng sai khác chuỗi) Dựa vào thời gian công bố gần đặc điểm tính trạng tương đồng với lồi mà em nghiên cứu tách dịng  chọn chuỗi NM_001003301.1 để làm khuôn ảo Bước 3: Thiết kế mồi Sử dụng phần mềm PRIMER BLAST để thiết kế mồi Copy trình tự gen FASTA NM_001003301.1 vào khung, sau lựa chọn + vùng bảo thủ đầu từ nucleotit 85- đến nucleotit 143 + vùng bảo thủ cuối từ nucleotit 350 đến nucleotit 408 Điều chỉnh thông số PRIMER BLAST ( kích thước sản phẩm PCR, nhiệt độ, ) cho phù hợp hình đây: Kết chạy PRIMER BLAST tạo 10 đoạn mồi khác hình sau: Yêu cầu đoạn mồi: + Độ dài từ 18-24bp + Nhiệt độ bắt mồi hai mồi không chênh lệch độ C + Tỉ lệ GC: 40-60%, tối ưu 50-55% Thông thường cặp mồi tối ưu nhất, để kiểm tra xem cặp mồi có phù hợp khơng ta thực q trình PCR ảo Bước 4: PCR ảo phần mềm SMS PCR Ta copy trình tự gen FASTA NM_001003301.1 vào khung cho đoạn mồi xuôi mồi ngược sau: Sử dụng cặp mồi là: T7: 5’ TGCTCCTGGTGATGGCTACT 3’ T3: 5’ CCACAAGACCGGTAGTGATTCT 3’ Sản phẩm PCR thu có kích thước 309bp trình tự gen sau: PCR Products results >309 bp product from linear template NM_001003301.1 Canis lupus familiaris interleukin (IL6), mRNA, base 95 to base 403 (T7 - T3) TGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGG ATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTGATTA AGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGT GTGAAGACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAA AAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCG GTCTTGTGG Bước 5: So sánh sản phẩm PCR phần mềm BLAST để dự đốn đặc tính sản phẩm dựa vào mối tương quan cấu trúc tính trạng Cấu trúc gen giống tính trạng giống không xảy đột biến Sản phẩm PCR có cấu trúc tương đồng với Canis familiaris interleukin-6 Mrna, AF275796.1 Như dựa vào AF275796.1 để dự đốn tính chất lồi mà nghiên cứu Bước 6: Thực tách dịng gen đích Ta lựa chọn vecto tách dòng pUC57 sứ dụng enzym giới hạn Ndel EcoRV Vị trí để cắt mở vòng vecto tách dòng enzym giới hạn lacZ, đồng thời lacZ gen thị để nhân biết gen đích gắn vào thành cơng khơng Tạo phản ứng nối gen đích + vecto tách dòng + DNA ligase  tạo vecto tách dòng tái tổ hợp Bước 6: Biến nạp vào tế bào chủ Tế bào chủ chọn để biến nạp E.coli DH5𝛼 đem nuôi cấy điều kiện thích hợp Bước 7: Lựa chọn chủng tái tổ hợp: chọn khuẩn lạc, nuôi môi trường LB lỏng, thu nhận tế bào mang vecto tái tổ hợp NHẬN XÉT: - Bài thực hành tin sinh cho sinh viên hiểu biết thêm thao tác sở liệu trực tuyến (NCBI, EBI, ) biết sử dụng vào mục đích để phục vụ cho cơng việc nghiên cứu học tập lớp - Bài thực hành lựa chọn phương án tách dịng gen kết tốt cịn sai sót bước làm, em hiểu bước cần làm tách dòng từ gen ban đầu chưa biết cấu trúc - Bước quan trọng phương án tách dịng gen tìm trình tự gen để làm khn ảo phù hợp lồi, chủng phải gần gũi, có tính trạng tương đồng với lồi mà nghiên cứu ... sử dụng vào mục đích để phục vụ cho công việc nghiên cứu học tập lớp - Bài thực hành lựa chọn phương án tách dịng gen kết tốt cịn sai sót bước làm, em hiểu bước cần làm tách dòng từ gen ban... dựa vào AF275796.1 để dự đốn tính chất lồi mà nghiên cứu Bước 6: Thực tách dịng gen đích Ta lựa chọn vecto tách dòng pUC57 sứ dụng enzym giới hạn Ndel EcoRV Vị trí để cắt mở vịng vecto tách dòng. .. nghiên cứu tách dòng  chọn chuỗi NM_001003301.1 để làm khuôn ảo Bước 3: Thiết kế mồi Sử dụng phần mềm PRIMER BLAST để thiết kế mồi Copy trình tự gen FASTA NM_001003301.1 vào khung, sau lựa chọn