Sử dụng tin sinh học trong xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt từ arabitopsis

BÁO CÁO TIN SINH HỌC Đề tài: Sử dụng tin sinh học xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt từ Arabitopsis Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Hiền MSSV: 20174669 Giảng viên: Nguyễn Văn Cách Tìm kiếm liệu NCBI Tìm kiếm dịng gen chịu nhiệt từ arabidopsis NCBI Lựa chọn dịng gen chịu nhiệt có arabidopsis ( Trên gen khác nhau) Đọc thông tin báo Các thông tin có đó: Chiều dài đoạn gen SOURCE: nguồn gen 3.AUTHORS: Tác giả viết TITLE: Tiêu đề viết ORIGIN: Trình tự nucleotide đoạn gen So sánh đoạn gen Clustal Omega để tìm vùng bảo thủ Vùng nhập Fasta để so sánh Giao diện Clustal Omega So sánh đoạn gen Clustal Omega để tìm vùng bảo thủ Kết sau so sánh đoạn gen chọn So sánh đoạn gen Clustal Omega để tìm vùng bảo thủ • Sau so sánh ta có nhận xét: - Cả gen có độ tương đồng cao => Abidopsis gen chịu nhiệt tìm thấy nhiều vị trí khác - Ta lựa chọn vùng bảo thủ từ Nu số 180 đến 2119 để làm khuôn cho phản ứng PCR Sử dụng Blast Primer để thiết kế mồi Vị trí bắt mồi Chiều dài sản phẩm PCR Nhiệt độ cho phản ứng PCR Sử dụng Blast Primer để thiết kế mồi Sau thiết kế mồi, chương trình cho ta đoạn mồi với độ tối ưu giảm dần từ tới Chạy PCR ảo với đoạn mồi vừa tìm Mã FASTA TT mồi xi TT mồi ngược • Với lựa chọn cặp mồi thứ để chạy PCR • Mồi xi: AAGGGCAGGACTTGGT AGGG Mồi ngược: GCATCAGTGACTGCCAA AGC Kết chạy PCR • PCR Products results • >636 bp product from linear template U13949.1 Arabidopsis thaliana heat shock protein AtHSP101 (Athsp101) mRNA, complete cds, base 1926 to base 2561 (T7 - T3) • AAGGGCAGGACTTGGTAGGGCACAACAGCCAACTGGATCATTCTTATTCCTTGGACCAAC • TGGTGTTGGCAAAACTGAGCTCGCCAAGGCTCTTGCTGAGCAGCTGTTTGATGATGAAAA • CCTCTTAGTTCGGATTGATATGTCGGAATATATGGAACAACACTCTGTCTCTCGCCTCAT • TGGGGCACCACCAGGGTATGTTGGTCACGAGGAAGGTGGACAACTAACTGAGGCTGTGAG • GAGGCGACCTTATTGTGTCATACTCTTTGATGAAGTGGAGAAGGCTCATGTTGCTGTCTT • CAACACTCTGCTCCAAGTTTTGGATGATGGTCGATTGACAGACGGGCAAGGCAGGACAGT • CGATTTCAGGAACTCGGTGATAATCATGACATCAAACCTTGGTGCTGAACACCTCCTTGC • AGGGCTAACTGGGAAAGTAACAATGGAAGTGGCCCGGGACTGTGTGATGCGGGAGGTGAG • GAAACACTTCAGACCAGAGCTCTTGAACAGGCTTGACGAGATTGTGGTGTTCGACCCCCT • TTCACATGACCAGTTGAGGAAAGTAGCTCGGCTTCAAATGAAAGACGTTGCTGTCCGGCT • TGCTGAAAGAGGAGTTGCTTTGGCAGTCACTGATGC • Ta thấy sản phẩm PCR có độ dài 636bp hoàn toàn phù hợp với yêu cầu • Sau ta kiểm tra so sánh với gen có sẵn sở NCBI BLAST từ dự đốn tính chất gen cần tách dịng Kết so sánh BLAST Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Abidopsis Đặt vấn đề: • Việt Nam nước nhiệt đới nên ảnh hưởng nắng nóng tới suất trồng lớn, xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt để tăng sức chống chịu với điều kiện bất lợi • Gen AtHSP101 mã hóa cho Chaperon protein B1 (ClpB1) thuộc nhóm protein chịu nhiệt heat shock protein 100 (HSP100) có vai trị nâng cao tính chống chịu tế bào điều kiện bất lợi hạn, lạnh, nóng,… Các nghiên cứu chứng minh gen AtHSP101 biểu mạnh quan sinh sản hoa, hạt phấn, hạt 2 Vật liệu nghiên cứu: + Vector tách dòng pBluescript + Vector chuyển gen pER8 + Nụ hoa Arabidopsis Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Arabidopsis Phương pháp nghiên cứu *Tách chiết RNA tổng số khuếch đại gene từ cDNA - RNA tổng số tách từ nụ hoa Arabidopsis thaliana - cDNA sau tổng hợp sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen AtHSP101 với cặp mồi đặc hiệu - Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose tinh Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Arabidopsis *Gắn vào vector tách dòng • Sử dụng vector nhân dòng pBluescript • Sản phẩm PCR nhân gen AtHSP101 vector tách dòng pBluescript cắt đồng thời hai enzyme đặc hiệu • Sản phẩm cắt sau tinh ghép nối enzyme T4 ligase • Sản phẩm ghép nối sau biến nạp vào tế bào E.coli DH5α khả biến theo phương pháp sốc nhiệt 42oC • Tế bào biến nạp nuôi qua đêm 37oC mơi trường LB Xây dựng phương án tách dịng gen chịu nhiệt Arabidopsis *Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp • Tế bào tái tổ hợp sàng lọc PCR với cặp mồi đặc hiệu từ khuẩn lạc • Tế bào tái tổ hợp ni tăng sinh, tách plasmid để kiểm tra đoạn chèn enzyme cắt hạn chế giải trình tự gen • Trình tự gen sau kiểm tra cách so sánh với trình tự gen gốc ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Arabidopsis * Gắn vào vector chuyển gen • Vector biểu pER8 sử dụng để chuyển gen AtHSP101 vào trồng.Vector pER8 cắt đồng thời enzyme đặc hiệu sau ghép nối enzyme T4 DNA ligase • Sản phẩm ghép nối chuyển vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α ni cấy mơi trường LB • Để chuyển vào trồng, plasmid tái tổ hợp chuyển vào tế bào vi khuẩn Vị trí chèn gen AtHSP101 ... kiểm tra so sánh với gen có sẵn sở NCBI BLAST từ dự đốn tính chất gen cần tách dịng Kết so sánh BLAST Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Abidopsis Đặt vấn đề: • Việt Nam nước nhiệt đới... chuyển gen pER8 + Nụ hoa Arabidopsis Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Arabidopsis Phương pháp nghiên cứu *Tách chiết RNA tổng số khuếch đại gene từ cDNA - RNA tổng số tách từ nụ hoa... trình tự gen gốc ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST Xây dựng phương án tách dòng gen chịu nhiệt Arabidopsis * Gắn vào vector chuyển gen • Vector biểu pER8 sử dụng để chuyển gen AtHSP101 vào trồng.Vector