Nghiên cứu điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose sử dụng vi sinh vật

Chính từ mối lo ngại đó, trong gần 20 năm qua, các nhà khoa học đã nghiên cứu, lựa chọn và tìm ra phương pháp sản xuất các loại đường chức năng có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như:

Trang 1

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Vũ Nguyên Thành

Sinh viên thực hiện: Trương Thị Tú Anh

Lớp: K20 - 1302

Hà Nội – 2017

Trang 2

Viện đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học

Trương Thị Tú Anh - 1302

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình tới

PGS TS Vũ Nguyên Thành đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những kiến thức chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo Bộ môn đã động viên chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn ThS.Nguyễn Thanh Thủy và ThS.Cao Xuân Bách và các anh chị làm việc tại Trung tâm Vi sinh vât Công nghiệp – Viện Công nghiệp Thực phẩm đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người

đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu

Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa luận của em không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo của thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được đầy

đủ và hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên Trương Thị Tú Anh

Trang 3

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Đường Isomaltulose 4

1.1.1 Cấu trúc của Isomaltulose 4

1.1.2 Tính chất của đường Isomaltulose 5

1.1.3 Enzyme chuyển hóa sucrose thành isomaltulose 6

1.2 Đặc điểm sinh hóa 8

1.2.1 Khả năng tiêu hóa 8

1.2.2 Sự trao đổi chất 9

1.2.3 Vai trò và chức năng của đường Isomaltulose 11

1.3 Tình hình sản xuất đường Isomaltulose trên thế giới 12

1.4 Tình hình sản xuất Isomaltulose ở Việt Nam 13

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu 13

2.1.1 Chủng giống 14

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.3 Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu 15

2.2 Máy móc, thiết bị 16

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật 17

Trang 4

2.3.2 Nhuộm tế bào vi khuẩn Gram 17

2.3.3 Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose 18

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa sucrose thành isomaltulose 19

2.4 Các phương pháp phân tích 22

2.4.1 Phương pháp xác định đường khử bằng DNS 22

2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 25

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh enzyme chuyển hóa hiệu suất cao

27

3.2 Đặc điểm hình thái và phân loại vi khuẩn 32

3.3 Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose 34

3.3.1 Thời gian chuyển hóa 35

3.3.2 Ảnh hưởng của pH trong quá trình chuyển hóa 36

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ quá trình chuyển hóa 38

3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 39

3.4 Quy trình sản xuất isomaltulose trong phòng thí nghiệm 41

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 Kết luận 43

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Trang 5

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

PCA Plate count agar

SPY Sucrose peptone yeast extract

rpm Revolutions Per Minute

DNS Dinitrosalicylic acid

WHO World Health Organization

HPLC High Performance Liquid Chromatography

GI Glycemic Index

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Danh sách mẫu và các chủng vi khuẩn sinh isomaltulose 14

Bảng 2 Tỉ lệ pha đệm axit axetic 20

Bảng 3 Tỉ lệ pha đệm sodium phosphate 21

Bảng 4 Pha nồng độ đường của đường chuẩn 23

Bảng 5 Hình thái tế bào của các chủng được lựa chọn khảo sát 33

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ chuyển hóa của sucrose dưới tác dụng của sucrose 5

Hình 2 Công thức cấu tạo của Isomaltulose 6

Hình 3 Đồ thị đường chuẩn Isomaltulose 24

Hình 4 Đồ thị đường chuẩn 26

Hình 5 So sánh nồng độ đường khử tổng sản phẩm theo DNS của 23 chủng ISB và CBS 28

Hình 6 Kết quả phân tích nồng độ glucose, isomaltulose, sucrose của 23 chủng ISB và chủng CBS theo HPLC 29

Hình 7 Sơ đồ cây phân loại các chủng chuyển hóa sucrose thành isomaltulose 31

Hình 8 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng chủng vi khuẩn 33

Hình 9 Thí nghiệm khảo sát theo thời gian lấy mẫu tại các thời điểm: 0h, 1h, 2h,3h,4h,5h,6h,12h,24h 35

Hình 10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH tại pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 37

Hình 11 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bao gồm 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C 38

Hình 12 Thí nghiệm khảo sát với các nồng độ cơ chất bao gồm 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 39

Hình 13 Hiệu suất chuyển hóa sucrose thành isomaltulose 40

Hình 14 Quy trình công nghệ sản xuất isomaltulose từ sucrose 41

Trang 8

Trương Thị Tú Anh - 1302 1

MỞ ĐẦU

Theo cảnh báo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), cho đến nay, có khoảng

1 tỷ trong số gần 7 tỷ người trên thế giới bị thừa cân, trong đó có 400 triệu người mắc bệnh béo phì Bên cạnh béo phì do yếu tố di truyền thì lối sống, những tiện ích của xã hội hiện đại như dành nhiều thời gian xem truyền hình, chơi video game, sử dụng máy tính liên tục, dành ít thời gian tập thể dục khiến người ta ít vận động thể lực Bên cạnh đó còn cả những nguyên nhân như chế độ dinh dưỡng không hợp lý, ngày nay mọi người có xu hướng thích

đồ ăn nhanh hay các loại bánh kẹo chứa nhiều chất béo sẽ làm các chất béo tích tụ trong cơ thể đó là những nguyên nhân chính Tỉ lệ béo phì và thừa cân đang tăng lên đột ngột tại các quốc gia nghèo hơn, chứ không chỉ tại các nước giàu và dự báo trước một gánh nặng các bệnh mãn tính như tiểu đường, tim, huyết áp, ung thư, loãng xương Mỗi năm, chi phí chữa béo phì chiếm từ 2% đến 8% ngân sách dành cho y tế của mỗi quốc gia này

Đối với bệnh tiểu đường, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho là “Cơn sóng thần tàn phá sức khỏe toàn cầu” Tuy Việt Nam không phải là nước có tỉ lệ mắc bệnh tiểu đường lớn nhất thế giới nhưng là nước có bệnh tiểu đường phát triển nhanh nhất thế giới Hiện có khoảng 4,8 triệu người mắc bệnh tiểu đường và con số này sẽ tăng lên 7 đến 8 triệu người vào năm 2025, đó là khuyến cáo từ Viện nghiên cứu Chiến lược phòng chống bệnh tiểu đường ở

Việt Nam

Chính từ mối lo ngại đó, trong gần 20 năm qua, các nhà khoa học đã nghiên cứu, lựa chọn và tìm ra phương pháp sản xuất các loại đường chức năng có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như: chống bệnh tiểu đường, chống béo phì, không gây sâu răng, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu hóa Điển hình là các loại đường chức năng: mannitol, sorbitol, xylitol,

Trang 9

galactose, isomalulose, xylo-oligosacarit, v.v Trong đó isomaltulose là một loại đường chức năng đang được nhiều nhà nghiên cứu chú ý bởi ưu điểm chính của loại đường này là không gây ra những tác dụng phụ như các loại đường hóa học và có nhiều lợi ích cụ thể cho cơ thể con người cùng với một

số đặc tính ưu việt hơn Đặc biệt gần đây người ta đã chứng minh rằng isomaltulose còn tốt cho chức năng của não, tăng bộ nhớ

Hiện nay, isomaltulose đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm Đi đầu trong sản xuất những sản phẩm này là tập đoàn Südzucker của Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu Ngoài

ra, Cerestar (thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui (Nhật) cũng là các công

ty lớn sản xuất isomaltulose Isomaltulose công nghiệp được sản xuất từ sucrose qua phản ứng đồng phân hoá bởi enzyme sucrose isomerase Công nghệ sản xuất isomaltulose phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là sử dụng tế

bào cố định của Protaminobacter rubrum

Nhận thấy tính thực tiễn đó, với mong muốn nâng cao hiệu suất chuyển hóa và giảm chi phí sản xuất isomaltulose từ đường mía (sucrose) vì Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn nguyên liệu đường sucrose dồi

dào Vậy nên trong đề tài này chúng tôi tập trung "Nghiên cứu điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose nhờ vi sinh vật"

Trang 10

Nội dung nghiên cứu:

- Chọn được chủng có hiệu suất chuyển hóa sucrose thành isomaltulose

với hiệu suất 85-90%

- Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose

- Xây dựng qui trình sản xuất isomaltulose trong phòng thí nghiệm

Mục tiêu:

Sản xuất được đường thế hệ mới - Isomaltulose từ đường sucrose (đường mía) bằng cách sử dụng chế phẩm enzyme sucrose isomerase được sinh từ chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam

Trang 11

1 TỔNG QUAN 1.1 Đường Isomaltulose

Isomaltulose còn được biết đến với tên thương mại Palatinose, giống như sucrose (đường ăn) nó có thể được tiêu hóa thành glucose và fructose Trong khi sucrose glucose và fructose được liên kết với một liên kết gọi là α-1,2 glycosidic, trong isomaltulose liên kết là α-1,6 glycosidic nên isomaltulose được người và động vật tiêu thụ chậm Khi so sánh với sucrose, isomaltulose phóng thích glucose vào máu với tốc độ chậm, điều này dẫn đến cung cấp năng lượng cân bằng và kéo dài hơn dưới dạng glucose Isomaltulose có trong mật ong tự nhiên và chiết xuất mía đường, có vị tương tự như sucrose với độ ngọt khoảng 42% so với sucrose [2] Isomaltulose có thể được sử dụng trong

đồ uống, các sản phẩm ngũ cốc, các sản phẩm sữa dựa trên, bánh kẹo, các sản

phẩm bánh, mứt cam, súp, nước sốt và món tráng miệng và còn là một thành

phần trong mỹ phẩm, và thuốc men

Enzyme và nguồn của isomaltulose đã được phát hiện ở Đức vào năm

1950 Đến năm 1957, nhà sinh hóa Weidenhagen Sudzucker đã đã phát hiện

ra cách sản xuất isomaltulose từ vi khuẩn Protaminobacter rubrum và thành

công kết tinh một loại đường đôi được tinh chế tự nhiên từ củ cải đường [5]

1.1.1 Cấu trúc của Isomaltulose

Tên hoá học của isomaltulose là 6-O-α-Dglucopyranosyl-D-fructofuranose (CAS 13718-94-0), là một đồng phân của sucrose Isomaltulose được sản xuất từ sucrose thông qua chuyển hóa enzyme trong đó liên kết 1,2-glycosid giữa glucose và fructose được thay thế bằng liên kết 1,6-glycosid

Sucrose (α1-β2) (không khử) Isomaltulose (α1-6) (đường

Trang 12

[glucose]

[fructose]

Sucrose isomerase

khử)

[glucose] [fructose]

Hình 1 Sơ đồ chuyển hóa của sucrose dưới tác dụng của sucrose

1.1.2 Tính chất của đường Isomaltulose

Isomaltulose có tính chất vật lí và cảm quan gần giống với sucrose, có giá trị năng lượng như sucrose Độ nhớt của cả hai loại dịch đường là tương tự Isomaltulose nóng chảy ở nhiệt độ thấp (123-124°C) So với sucrose, isomaltulose khó thủy phân hơn phụ thuộc vào pH Isomaltulose (dung dịch 10%) ổn định trong hơn 30 phút khi ủ ở pH 1.0 ở 95°C, trong khi đó sucrose (dung dịch 10%) gần như được thủy phân hoàn toàn trong cùng điều kiện [8] Ngoài ra, isomaltulose cho thấy caramel hóa ít hơn trong quá trình xử lý nhiệt hơn sucrose, vì nhiệt độ nóng chảy thấp hơn và sự ổn định cao hơn của liên kết glycosid [8] Isomaltulose tham gia vào các phản ứng màu nâu của Maillard Giống như sucrose, nó được tiêu hóa hoàn toàn và cung cấp cùng một lượng calo khoảng 4 kcal nhưng với dòng năng lượng kéo dài so với sucrose (160-185°C) Nhìn chung, tính chất hoá lý của isomaltulose cho phép thay thế sucrose trong hầu hết thức ăn ngọt [6] Hình 2 biểu diễn công thức cấu tạo và một số thông số vật lý của isomaltulose

Trang 13

Hình 2 Công thức cấu tạo của Isomaltulose

1.1.3 Enzyme chuyển hóa sucrose thành isomaltulose

Isomaltulose được tạo thành bởi sự sắp xếp lại liên kết α-1,2 glycosidic thành α-1,6 glycosidic dưới sự xúc tác của enzyme sucrose-isomerase [10] Nhiều enzyme sản xuất isomaltulose vi khuẩn đã được tinh chế và đặc trưng

Bao gồm các dạng tự nhiên của enzyme từ Ervinia rhapontici NX-5, Ervinia

sp D12, Serratia plymuthica ATCC15928, Klebsiella sp., Pseudomonas

NCPPB 1578, dạng tái tổ hợp các enzyme từ E rhapontici DSM 4484

(GenBank accession No AAK28735 1), E rhapontici NX-5(ADJ56407.2),

(ACO05018.1), Protaminobacter rubrum CBS 574.77 (CAF32985.1),

Isomaltulose CAS: 13718-94-0

Công thức phân tử: C12H22O11·H2O Khối lượng phân tử: 360.3

Nhiệt độ nóng chảy: 123-124 °C Biểu hiện bên ngoài: Tinh thể trắng

Trang 14

(AAP57083.1), Klebsiella planticola UQ14S (AAP57085.1) và Klebsiella

sp LX3 (AAK82938.1)

Sucrose isomerase của P rubrum gồm 628 axit amin, khối lượng phân

tử 69,8 kDa Bởi vì sự khác biệt đáng kể trong trình tự và tính chất enzyme, sucrose isomerase với các tên gọi khác nhau được sử dụng để phân biệt gen

sucrose isomerase trong các vi sinh vật khác nhau: smuA cho P rubrum, PalI cho Erwinia, Klebsiella, Enterobacter; sim cho P dispersa và mutB cho isomerase sucrose-trehalulose của P mesoacidophila Trong thiên nhiên,

isomaltulose có lẽ đóng vai trò giúp vật chủ cạnh tranh giành nguồn dinh dưỡng với các vi sinh vật khác trong môi trường giàu sucrose bởi phần lớn vi sinh vật không có khả năng sử dụng isomaltulose Ngoài ra, isomaltulose còn

có khả năng ức chế enzyme invertase của nấm men và do vậy hạn chế việc sử dụng đường sucrose trong môi trường

Enzyme sucrose isomerase (SI) (EC 5.4.99.11) (còn gọi là isomaltulose synthase) chịu trách nhiệm chuyển hóa sucrose thành isomaltulose lần đầu

tiên được tách chiết từ Protaminobacter rubrum bởi Weidenhagen và Lorenz

năm 1957 Isomaltulose tồn tại với số lượng rất nhỏ trong tự nhiên và rất khó

để được tổng hợp hóa học Vì vậy Isomaltulose được tạo thành bởi sự sắp xếp lại liên kết α-1,2 glycosidic thành α-1,6 glycosidic dưới sự xúc tác của enzym sucrose-isomerase Hiện nay sản xuất isomaltulose công nghiệp vẫn được

thực hiện sử dụng tế bào cố định của Protaminobacter rubrum Sucrose

isomerase ngoài ra còn được tìm thấy ở nhiều vi sinh vật khác, trong đó có

MX-45, Enterobacter sp FMB-1 [11] Chủng công nghiệp Protaminobacter rubrum

CBS 574.77 (CBS) là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy ý, không di chuyển và

Trang 15

hình que Isomaltulose đã được các nhà khoa học nước Nhật Bản nghiên cứu

từ những năm 1980 để xem xét độ an toàn Đến năm 1985, chúng được kết luận là sản phẩm tiêu dùng an toàn và chính phủ đã phê duyệt sử dụng Isomaltulose vào công nghệ thực phẩm và đồ uống

1.2 Đặc điểm sinh hóa

Quá trình tiêu hóa và trao đổi chất trong các nghiên cứu in vitro cho thấy

isomaltulose có thể bị thủy phân bởi các enzym đường ruột, nhưng tốc độ chậm lại đáng kể so với sucrose Isomaltulose sử dụng niêm mạc ruột non ở người như là một nguồn enzyme, việc bổ sung sucrose dẫn đến sự phóng thích glucose cao gấp sáu lần so với sau khi bổ sung một lượng isomaltulose

Các thí nghiệm in vivo cho thấy isomaltulose gần như được thủy phân hoàn

toàn và hấp thu vào ruột non [6]

1.2.1 Khả năng tiêu hóa

Các nghiên cứu in vitro cho thấy disaccharidase đường ruột từ các loài khác nhau có thể thủy phân isomaltulose, nhưng tỷ lệ này chậm so với các loại đường như sucrose hoặc maltose

Trong nghiên cứu trên chuột cống [9, 12] Vmax cho sự thủy phân của isomaltulose bằng các màng ngoài của màng nhầy là 2- 4% so với Vmax đối với maltoza và 11-12% so với sucrose Enzyme đường ruột đồng nhất từ heo trưởng thành thủy phân isomaltulose với tỷ lệ 2-5% so với maltose và 10-20%

so với sucrose Trong các nghiên cứu sử dụng niêm mạc ruột non ở người nhỏ như là nguồn enzyme, isomaltulose đã được thủy phân với Vmax = 8 so với maltose, và 26-45% so với 11% như sucrose [6]

Các phức hợp sucrose / isomaltase, như đã được làm sạch từ ruột chuột và người, thấy thủy phân isomaltulose trong ruột với tỉ lệ gần như đồng nhất

Trang 16

Phức hệ glucoamylase / maltase của chuột và người không thể thủy phân isomaltulose Ở lợn, isomaltulose được cắt bằng đường sucrase / isomaltase ở ruột cũng như glucoamylase / maltase Các nghiên cứu tiếp theo chỉ ra rằng, trong ruột non ở người, thủy phân isomaltulose được xúc tác bởi isomaltase,

vì nhiệt không hoạt hóa của isomaltase, trong khi hoạt tính sucrose hầu như không bị ảnh hưởng bởi quá trình xử lý nhiệt [6]

Các nghiên cứu với liều lặp lại đã được thực hiện ở lợn với một tổ chức tái

tổ chức ở cuối ruột cũng như ở heo không định tính, để theo dõi quá trình tiêu hóa enzyme trong ruột non riêng biệt với quá trình lên men ở ruột già Mặc dù liều lượng tương đối cao (20% isomaltulose hoặc sucrose trong khẩu phần) không có sự khác biệt rõ rệt giữa chuyển hóa giữa sucrose và isomaltulose Ở chuột, chỉ có một lượng nhỏ chất phóng xạ có thể tìm thấy trong phân và nước tiểu sau khi uống liều uống đơn(lên đến 0,5 g / kg thể trọng) của isomaltulose

[6] Các nghiên cứu in vivo với chuột và lợn đã chỉ ra rằng isomaltulose hầu

như được thủy phân hoàn toàn và hấp thu vào ruột non

1.2.2 Sự trao đổi chất

Do quá trình thủy phân chậm trong suốt quá trình đi tiêu hóa, tăng đường huyết, fructose và insulin sau khi uống isomaltulose chậm hơn so với sucrose Điều này đã được tìm thấy trong cả hai đối tượng khỏe mạnh và bệnh tiểu đường [6] Điều này làm cho isomaltulose một đường đầy hứa hẹn cho người

bị tiểu đường và những người bị các chứng bệnh tiền tiểu đường như kháng insulin hoặc hội chứng chuyển hóa

Trong các nghiên cứu thử nghiệm trên động vật và người đã chỉ ra rằng isomaltulose được chuyển hóa và bài tiết qua nước tiểu

Trang 17

Sau khi truyền tĩnh mạch cho chó (2 g / con), bài tiết isomaltulose qua đường tiểu (83% liều dùng) và sucrose (76%), cho thấy rằng chỉ có một phần nhỏ các đường này được chuyển hóa Isomaltulose tiêm tĩnh mạch (tiêm bắp, 0.5 g / kg thể trọng trên 90 phút) làm tăng glucose trong máu và nồng độ insulin trong bệnh tiểu đường streptozotocin nhẹ và bình thường Ở chuột và chó,isomaltulose trong ruột ít nhất một phần bị thủy phân Sau khi truyền tĩnh mạch isomaltulose ở chó (5,5 mg / kg thể trọng / phút trong 90 phút), nồng độ đường huyết và insulin trong huyết tương tăng trong vòng 15 phút sau khi truyền bắt đầu Mức isomaltulose tiếp tục gia tăng cho đến khi kết thúc truyền dịch, và song song với sự tăng lên của isomaltulose và fructose trong nước tiểu, trong khi fructose trong huyết tương không bị ảnh hưởng Theo dõi đến

120 phút sau khi bắt đầu, vẫn ở mức cơ bản không có dấu hiệu tăng triglycerid máu [6]

Từ những kết quả trên có thể thấy rằng ở ruột chuột và chó isomaltulose bị thủy phân Sau khi dùng isomaltulose cho người (0,5g), hơn 88% liều được tìm thấy là disaccharide còn nguyên vẹn trong nước tiểu, cho thấy hầu như không có hệ thống nào có sự trao đổi chất, 65% liều được bài tiết trong vòng 2,5 giờ sau khi dùng [6]

Vì isomaltulose cho thấy cung cấp glucose máu ổn định ở mức đường huyết thấp và tương ứng với cấu hình insulin, việc uống isomaltulose có liên quan đến sự oxy hóa chất béo được cải thiện so với các carbohydrate thực phẩm thông thường Như vậy, isomaltulose có thể làm tăng lượng chất béo được sử dụng như năng lượng và do đó giúp ngăn ngừa tăng cân và sức đề kháng [6]

Trang 18

Ngoài ra, trái ngược với sucrose, isomaltulose được lên men và ức chế hiệu quả sự hình thành glucans không hòa tan trong nước, cho thấy nó đặc biệt thích hợp để dùng thay thế sucrose [6]

Một nghiên cứu in vitro và in vivo sinh hóa và độc tính ở nhiều loài khác

nhau, trong đó cả con người, đã được tiến hành để đánh giá sự an toàn của isomaltulose để sử dụng như một đường không gây ung thư Kết quả nghiên

cứu in vivo và in vitro cho thấy isomaltulose dần dần được tiêu hóa hoàn toàn

trong ruột non Glucose và đường fructose được hấp thụ và chuyển hóa Do

sự phân hủy và hấp thu hoàn toàn, ngay cả liều cao đường uống của isomaltulose không gây khó chịu đường tiêu hóa Đường glucose trong máu

và đáp ứng insulin chậm hơn có thể đặc biệt thuận lợi cho những bệnh tiểu đường và tình trạng tiền tiểu đường [6]

Các nghiên cứu về độc tính và con người không tiết lộ các tác dụng phụ.Vì vậy các nhà khoa học đã kết luận rằng việc sử dụng isomaltulose như một loại đường khác có thể không gây nguy hiểm cho sức khoẻ [6]

1.2.3 Vai trò và chức năng của đường Isomaltulose

Isomaltulose đóng vai trò dự trữ carbohydrate hoặc cung cấp năng lượng

cho P rubrum Isomaltulose được đánh giá là một sự thay thế hợp lí cho

sucrose bởi rất nhiều ưu điểm:

- Không gây hại cho răng vì các vi khuẩn răng miệng không thể phân hủy được loại đường này

- Không gây ảnh hưởng đáng kể tới nồng độ đường và insulin trong máu, giúp ổn định đường huyết

- Isomaltulose là loại đường “chậm” có chỉ số đường huyết thấp (GI:32, thấp tương đương với đậu nành, sữa chua trái cây)

Trang 19

- Duy trì độ ngọt trong thực phẩm lên men và đồ uống

- Không hút ẩm như sucrose và lactose, do vậy thực phẩm chứa isomaltulose bền và ổn định hơn

- Kích thích sự phát triển của Bifidobacteria có ích trong hệ vi sinh vật của ruột người

- Có lợi cho sức khỏe con người, tốt cho chức năng não và làm chậm quá trình lão hóa

1.3 Tình hình sản xuất đường Isomaltulose trên thế giới

Hiện nay nhu cầu thay thế việc sử dụng sucrose bằng một loại đường khác ngày càng gia tăng do những ảnh hưởng không tốt của nó tới sức khoẻ con người Đường isomaltulose được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm

và dược phẩm Nhu cầu sử dụng isomaltulose ước tính khoảng 3.000 tấn/năm Tại các nước Châu Âu, đi đầu trong sản xuất những sản phẩm này là tập đoàn Südzucker của Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu, với thương hiệu Palatinose do Beneo-Palatinit, với 2 sản phẩm là Palatinose™ (kẹo cao su, nước tăng lực, bột dinh dưỡng, bánh quy, chocolate, kem…) và galenIQ™ (dược)

Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hòa Kỳ (FDA) đã công nhận an toàn và phê chuẩn sử dụng sản phẩm Palatinose (Isomaltulose) vào tháng 3/2006 Sau đó FDA còn tài trợ để phát triển việc dùng đường Isomaltulose thay đường mía trong sản xuất chế biến một số thực phẩm

Ở các nước Châu Á, Cerestar (thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui (Nhật) cũng là các công ty lớn sản xuất các chế phẩm của isomaltulose

Ngoài ra, tại Hàn Quốc các nhà khoa học đã nghiên cứu chủng

Trang 20

với hiệu suất trên 90% Chủng Klebsiella sp LX3 có khả năng chuyển hóa

trên 99% sucrose thành sản phẩm chứa trên 87% isomaltulose Tại Malaysia: Đại học Y khoa Putra Malaysia đã nghiên cứu về vai trò của isomaltulose trên trẻ em Họ cho nhóm trẻ tham gia nghiên cứu uống sữa tăng cường loại đường này Kết quả nhận được là trẻ em gia tăng nhận thức và tập trung học tập một cách đáng kể Vì vậy các nhà nghiên cứu nước này khuyến khích người dân dùng đường isomaltulose trong các sản phẩm để giúp trẻ tăng nhận thức Tại Trung Quốc, các nhà nghiên cứu đã khẳng định lợi ích chống sâu răng của isomaltulose Hệ thống quy định trong luật của Trung Quốc cho thấy chất ngọt trong thực phẩm có chứa từ 70% isomaltulose trở lên sẽ đủ điều kiện ghi trên nhãn mác dòng chữ “không gây sâu răng”

1.4 Tình hình sản xuất Isomaltulose ở Việt Nam

Isomaltulose mới xuất hiện ở Việt Nam trong vài năm gần đây nhưng thực

tế nhiều người dân đã biết đến loại đường này Một số công ty kinh doanh thực phẩm đang giới thiệu chào hàng sản phẩm này với mục đích ăn kiêng giảm cân, phòng ngừa tiểu đường, hỗ trợ trẻ em phát triển trí não…Phổ biến nhất là các công ty sản xuất sữa họ đã nắm bắt cơ hội để phát triển như nhãn hàng Dutch Lady thuộc công ty FrieslandCampina Việt Nam đưa ra dòng sản phẩm Dutch Lady Gold có bổ sung isomaltulose giúp cung cấp năng lượng dài lâu cho não

Đường isomaltulose đã được nghiên cứu ở Viện Công nghiệp Thực phẩm, hiệu suất chuyển hóa sucrose thành hỗn hợp isomaltulose đạt xấp xỉ 80%

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

Trang 21

2.1.1 Chủng giống

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các chủng bao gồm 23 chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa sucrose thành isomaltulose trong bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm và 01 chủng tiếp nhận từ sưu tập giống CBS (Hà Lan)

Bảng 1 Danh sách mẫu và các chủng vi khuẩn sinh isomaltulose

Stt Loại mẫu Địa điểm lấy mẫu Chủng phân lập

được

23, ISB 24, ISB25,

Trang 22

Stt Loại mẫu Địa điểm lấy mẫu Chủng phân lập

được

ISB26, ISB27, ISB28, ISB29, ISB30, ISB31

9 Phân sâu đục thân cây Vên

Vên (Cây chủ Anisoptera

Xén tóc vàng Colosterna

Heller) và sâu đục thân

cây Dầu Rái (Cây chủ

Roxb, Sâu hại: Xén tóc

vàng)

Trạm lâm nghiệp Bầu Bàn, Bến Cát, Bình Dương

ISB33, ISB36, ISB38, ISB39, ISB41

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất dùng trong môi trường phân lập, nuôi cấy và lên men

Sucrose; yeast extract; agar; peptone; CH3COOH; CH3COONa;

NaH2PO4.1H₂O; Na2HPO4.12H₂O

Hóa chất dùng để xác định hình thái tế bào, dạng Gram

Crystal violet; ethanol 95%; Ammonium oxalate; Iodine; KI; Acetone; Safranin O

2.1.3 Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu

Trang 23

Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 15 phút

Môi trường chuyển hóa sucrose

Sucrose 200 g

Đệm phosphate pH 7,0 (0,1M) 1000 ml

Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 15 phút

2.2 Máy móc, thiết bị

Box cấy BioblockScientific, Pháp

Cân điện tử Precisa, Thụy Điển

Kính hiển vi quang học Eclipse E600, Nikon, Nhật

Lò vi sóng LG, Hàn Quốc

Máy đo pH Toledo, Anh

Máy lắc ổn nhiệt Eppendorf, Đức

Máy ly tâm cao tốc Heraeus - Sepatech

Nồi hấp thanh trùng Himayatoko, Nhật

Tủ lạnh giữ giống Electrolux, Thụy Điển

Tủ nuôi cấy Sanyo, Nhật

Tủ sấy Sanyo, Nhật

Trang 24

Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppendorf, ống Falcon, Pipetman, đầu côn các loại, que cấy các loại

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật

Giống vi khuẩn được nuôi trên thạch đĩa PCA, sau 24h ở 30°C Chọn khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều cấy sang thạch nghiêng PCA nuôi 24h ở 30°C

2.3.2 Nhuộm tế bào vi khuẩn Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào

• Hóa chất

- Dung dịch tím kết tinh (crystal violet - C25N3H30Cl)

- Dung dịch Iod (Iodline)

- Dung dịch tẩy màu: ethanol 95%

- Dung dịch nhuộm bổ sung: Safranin O

• Các bước tiến hành

- Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản

Dùng que cất vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí,

hơ nhanh viết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính

Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên trên vết bôi 1-2 giọt cồn 95° Đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây Cố định vết bôi nhằm 3 mục

Trang 25

địch: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn

- Bước 2: Nhuộm màu

1 Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước

2 Nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước

3 Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước

4 Nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút, rửa nước, để khô Lần nhuộm này cả 2 nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nê đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (nhuộm fuchsin)

2.3.3 Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose

- Giống vi khuẩn được nuôi trên thạch đĩa PCA, sau 24h ở 30°C, chọn khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều cấy sang thạch nghiêng PCA

- Sau 24h ở 30°C, cấy 2 vòng qua cấy vào 20ml môi trường SPY

- Nuôi qua đêm ở 30°C chế độ lắc 150 rpm

- Ly tâm 5000 rpm trong 30 phút ở 10°C

- Sinh khối được rửa 2 lần, đầu tiên rửa bằng nước muối sinh lý sau đó tiếp tục rửa bằng đệm phosphate pH 7 (0,1 M)

Chuyển toàn bộ sinh khối đã rửa vào dung dịch sucrose 20%, lượng tế bào

sẽ chuyển hóa dung dịch sucrose trong 24h ở 40°C

Trang 26

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa sucrose thành isomaltulose

Các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa như nhiệt độ,

pH, nồng độ cơ chất, thời gian được khảo sát Thí nghiệm khảo sát thời gian

và nồng độ cơ chất được tiến hành phản ứng trong 24h để đảm bảo các phản ứng đạt hiệu suất tối đa Các thí nghiệm kháo sát pH và nhiệt độ được tiến hành phản ứng trong điều kiện còn dư cơ chất (20% cơ chất trong 30 phút) để

so sánh giữa các chủng

2.3.4.1 Thời gian phản ứng

Thí nghiệm được tiến hành với các dịch nuôi cấy sinh enzyme trong vòng 24h để khảo sát quả trình chuyển hóa sucrose thành isomaltulose của các chủng vi khuẩn ISB và CBS

- Giống được nuôi trong bình tam giác 1L môi trường SPY Sau 24h ở 30°C Ly tâm 5000 rpm trong 30 phút ở 10°C Rửa sinh khối

- Chia sinh khối vào các ống Falcon 50 ml phản ứng với dịch sucrose 20% Tiến hành nuôi cấy ở các nhiệt độ 40°C Lấy mẫu theo các mốc giờ: 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 12h, 24h ly tâm thu dịch trong và phân tích nồng độ đường khử tạo thành

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Thí nghiệm được tiến hành với các nhiệt độ nuôi cấy sinh enzyme khác nhau để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh enzyme

- Giống được nuôi trong bình tam giác 1L môi trường SPY Sau 24h ở 30°C Ly tâm 5000 rpm trong 30 phút ở 10°C Rửa sinh khối và bảo quản sinh khối trong đệm phosphate pH 7 (0,1 M) ở -20°C

Định dạng
Số trang	53
Dung lượng	1,79 MB