Tách dòng gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển quảng trị

Những nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi.Những nghiên cứu về vi sinh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI

TÁCH DÒNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN TỪ VI SINH

VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG TRỊ

Giáo viên hướng dẫn 1: PGS.TS Phạm Việt Cường

Giáo viên hướng dẫn 2: NCS Trần Thị Hồng

Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Thương

Lớp : 13-01

KHOA CÔNG NGH

KHÓA LU

TÁCH DÒNG GEN

VẬT LIÊN K

Giáo viên hướng dẫn 1: PGS.TS Ph

Giáo viên hướng dẫn 2: NCS Tr

Sinh viên thực hiện :

Lớp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI

TÁCH DÒNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN T

T LIÊN KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG TR

n 1: PGS.TS Phạm Việt Cường

n 2: NCS Trần Thị Hồng

n : Đỗ Thị Thương : 13-01

Hà Nội- 2017

N TỪ VI SINH

NG TRỊ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trường Viện Đại Học

Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã dạy

dỗ em trong suốt 4 năm học tại trường, và trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm báo cáo tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Phạm Việt Cường- Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung- Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam và NCS Trần Thị Hồng, người đã trực tiếp hướng dẫn em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, các anh chị, cán

bộ Trung tâm công nghệ sinh học Phân tử Nghĩa Đô- Viện Nghiên cứu Khoa học miền Trung đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian em thực tập

Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập để em hoàn thành bài luận văn này!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Đỗ Thị Thương

MỤC LỤC

1.3.2 Chất ức chế protease (protease inhibitor- PI) 11

1.3.2.2 Cấu trúc và tính chất của chất ức chế protease 13

1.3.2.3 Cơ chế tác động của chất ức chế protease 14 1.4 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước 15

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ vi sinh vật liên kết hải

2.3.2 Phương pháp điện di trên gel agarose

2.3.6 Phương pháp biến nạp sản phẩm PCR vào tế bào khả biến E Coli

2.3.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E Coli 34

2.3.8 Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn 35

2.3.9 Xác định trình tự gen bằng máy tự động 36

3.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị

38 3.2 Khuyếch đại gen ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên biển

3.3.4 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 43

3.3.5 Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI 44

3.3.6 Trình tự nucleotid gen ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải

E.coli Escherichia coli

ETDA Ethylene Diamine Tetra- acetic Acid

IPTG Isopropylthio- β- D- galactoside

PI Protease Inhibitor (chất ức chế protease)

Taq Thermus aquaticus

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh Hải miên 4 Hình 1.2: Cấu tạo của protease 8 Hình 1.3: Cấu trúc không gian của protease 8 Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pCR®2.1…………21 Hình 3.1: Điện di đồ DNA tổng số của VSV-HM 39 Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi 667 39 Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm thôi gel của HM9-QT trên gel agarose 1% 41 Hình 3.4: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli Top 10F’ 42 Hình 3.5: Kết quả tách DNA plasmid 43 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm cắt bởi enzym giới hạn 44 Hình 3.7: Kết quả blast gen HM9-QT trên ngân hàng quốc tế NCBI……….45

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease 12

Bảng 2.1: Tên hóa chất và hãng sản xuất trong thí nghiệm 22

Bảng 2.2: Tên thiết bị máy móc và hãng sản xuất trong thí nghiệm 25

Bảng 2.3: Thành phần phản ứngPCR 30

Bảng 3.1: Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ AND (µg/ml) của các mẫu nghiên cứu 38

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Môi trường biển rất đa dạng, người ta tính được rằng vi khuẩn biển cực

kỳ nhiều, đạt mật độ đến 106/ml nước biển, và là sinh khối biển và các chất trao đổi nhiều nhất Môi trường biển, gồm cả lớp dưới bề mặt, người ta tin là chứa khoảng 3,67x1030 vi sinh vật và với gần 71% bề mặt trái đất của 361 triệu km2 được bao phủ bởi đại dương, môi trường này là khu vực rộng lớn tiềm năng của đa dạng vi sinh vật và công nghệ sinh học có thể khai thác hay

“công nghệ sinh học xanh”

Trong môi trường biển, vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ,

độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ những vi sinh vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh hóa đa dạng cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong các điều kiện đó Như vậy có thể khai thác các enzymes do vi sinh vật biển tổng hợp có các hoạt tính xúc tác sinh học khác thường, có khả năng hoạt động dưới các điều kiện cực đoan

Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào Những nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật

vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi.Những nghiên cứu về vi sinh vật liên đới hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước biển, và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên Rất nhiều sản phẩm của hải miên được cho là thực tế do vi khuẩn liên đới sinh ra

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 2

và rất nhiều báo cáo đã chứng minh giả thuyết này Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt là vi sinh vật liên kết với các cơ thể khác bởi mối tương tác giữa chúng khá phức tạp Hơn nữa, nếu khai thác hải miên để tách chiết các hoạt chất thì nguồn nguyên liệu có hạn này sẽ bị mất đi nhanh chóng, khó phục hồi và gây hủy hoại môi trường

Vì vậy cần phải có phương pháp mới nhằm phát hiện và có thể thu được các hợp chất hoạt tính sinh học lượng lớn Phần lớn các báo cáo về phát hiện và tách chiết các chất có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế khối u cũng như ức chế protease là từ những chủng vi sinh vật nuôi cấy được

Hiện nay, Serine protease inhibitors là một trong những thành viên quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ nhiều nhất trong họ protease inhibitors.Chúng hoạt động như một tác nhân điều hòa (modulator) và tham gia vào rất nhiều quá trình phân giải các protein quan trọng, liên kết hóa trị với protein đích và bất hoạt chúng Vì vậy việc tìm kiếm các chất ức chế protease mới gợi sự quan tâm mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực.Vi sinh vật biển là một trong những nguồn giàu nhất các hợp chất có hoạt tính sinh học và hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu Sự đa dạng của vi sinh vật liên kết hải miên biển

và các đặc trưng của môi trường biển đã góp phần tạo ra các nguồn gen mới trong đó có cả các gen ức chế serine protease Các hợp chất ức chế serine protease mã hóa bởi các gen này có thể có những đặc tính duy nhất và có tiềm năng ứng dụng trong chữa trị bệnh

Xuất phát từ đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Tách dòng gen ức chế

protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị

2 Mục tiêu của đề tài

Tách dòng thành công gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị

3 Ý nghĩa của đề tài

Góp phần tìm kiếm nguồn gen ức chế protease gây bệnh phục vụ cho y học

4 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA của vsv liên kết với hải miên

- Nhân dòng gen mã hóa các protein có hoạt tính ức chế protease từ DNA tách chiết

- Gắn gen vào vector tách dòng thích hợp theo Kit

- Giải trình tự gen đã tách dòng thành công

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 4

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về hải miên

Hải miên (sponge) là những động vật sống rất lâu và rất ổn định Chúng

đã tồn tại 700-800 triệu năm với vận tốc sinh trưởng khác nhau ở các nhóm khác nhau Chúng là động vật không xương sống đa bào, ăn lọc sống bám chủ yếu vào nền biển, nhưng cũng có loài nước ngọt Trong số khoảng 15.000 loài hải miên, chỉ có 1% sống trong môi trường nước ngọt Hải miên không có mô thực sự, nhưng có các loại tế bào khác nhau với các chức năng khác nhau và cùng nhau thực hiện các chức năng bình thường của cơ thể

Hình1.1: Hình ảnh Hải miên

Hải miên là “mỏ vàng” về khía cạnh đa dạng các chất trao đổi thứ cấp được phát hiện trong những năm gần đây Hải miên sản xuất các chất trao đổi thứ cấp để xua đuổi và ngăn cản các loài ăn thịt, cạnh tranh không gian với các loài không cuống khác và để liên lạc, chống lại sự nhiễm bệnh Hải miên

có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều loại bệnh Trong

số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển được mô tả, hơn 30% từ hải miên[22][23] Nhưng nồng độ các chất hoạt tính sinh học trong mô hải miên rất thấp Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh

vật có thể chiếm 50% thể tích của hải miên, và con số này cao hơn 2-3 lần vi sinh vật có trong nước biển.Ở Việt Nam, hải miên đã biết 160 loài, gặp nhiều

ở vùng biển phía Nam, nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo[34] Hải miên là động vật thân lỗ hay còn gọi là bọt biển là một ngành động vật đa bào nguyên thủy Thường sống dưới biển có cấu trúc tế bào tách biệt

Cơ thể động vật thân lỗ có hình cốc gồm các tế bào động vật đa bào sớm nhất, phát triển từ các tập đơntế bào Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên thủy nhất, có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan bên trong, hay khả năng vận động Chúng đã từng được xem là đã tách ra từ các động vật khác trước đây Các tế bào của chúng khác biệt nhưng trong hầu hết các trường hợp không được tổ chức thành các mô riêng biệt

Hai thành phần hóa học chủ yếu của loài hải miên là các axit béo không

no và các hợp chất steroid Trongđó đáng quan tâm nhất là hợp chất béo không no bị brom hóa Các hợp chất này thể hiện nhiều đặc tính như: kháng

vi sinh vật, gây độc tế bào, một số còn ức chế enzym HIV protease[35]

1.2 Khái quát về vi sinh vật liên kết hải miên

Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi khuẩn liên đới hải miên bền vững theo không gian và thời gian Nhưng một số tác giả khác lại thay đổi giả thuyết này, ví dụ: mặc dù Cymbastela concentrica có cộng đồng vi sinh vật ít thay đổi giữa các khoảng cách địa lý nhỏ nhưng cộng đồng sinh vật của Cymbastela concentrica vùng

ôn đới khác với cộng đồng vi sinh vật Cymbastela concentrica từ nước vùng nhiệt đới của Australia[24]

Hải miên được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò của những vi sinh vật này thay dổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 6

sinh với hải miên Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S

rRNA gene sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người

ta nhận thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên có hơn 25phyla, trong

đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia Các quần thể khác sống trong hải miên gồm fungi và

microalgae Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống trong

virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola[6][7] Có 2 con đường để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một

là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên đới thông qua giao

tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa vi khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) [25][26]

Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và sản sinh các chất trao đổi thứ cấp Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên đới với hải miên là các nhà sản xuất gốc, các hợp chất họa tính sinh học Bằng chứng thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là Flaulkner và cs, xác định

vị trí của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải miên Theonella swinhoei Với mục đích này, quần thể tế bào được tách bằng ly tâm và nghiên cứu bằng hóa học Bằng cách đó có thể định vị được cytotoxic macrolide swinholide A và peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và

vi khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng [27][28]

Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa được hiểu rõ Người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do

vi khuẩn liên kết với nó sinh ra Ví dụ diketopiperazines của Tedania

ignisđược cho là sản phẩm trao đổi chất của Micrococcus sp liên kết với hải miên Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P.clavata

được nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin

Vi sinh vật liên kết với hải miên biển có vai trò chủ yếu trong việc bảo

vệ vật chủ chống lại các loài ăn thịt do chúng sản sinh ra các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn quang hợp cố định cacbon cung cấp đến gần 50% nhu cầu cacbon cho hải miên Ngoài ra, có quan hệ cộng sinh với vi khuẩn quang hợp giúp hải miên nhận được một số sản phẩm từ quá trình quang hợp như glycerol Ngược lại, vi khuẩn sẽ được cung cấp giá thể và cơ chất từ hải miên mà nó có quan hệ 16 cộng sinh[33] Một số vi sinh vật được cho là sinh các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo

vệ vật chủ Các chức năng khác như loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất có hại Đổi lại hải miên làm cho vi sinh vật có thể nhận được ánh sáng mặt trời, chỗ ẩn náu khỏi các loài săn mồi, cơ chất để bám và cung cấp dinh dưỡng

Người ta đã chứng minh được rằng vi sinh vật liên kết với hải miên sản sinh các chất có hoạt tính sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, ức chế miễn dịch…và cũng có hoạt tính chữa bệnh tim, hô hấp

và tiêu hóa[29]

1.3 Protease và chất ức chế protease

1.3.1 Protease

1.3.1.1 Giới thiệu chung

Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme là các enzyme có khả năng thủy phân các liên kết peptide của protein thành các đoạn peptide ngắn hơn và các acid amin[36]

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 8

Protease là nhóm phổ biến và đa dạng trong các enzyme và có tất cả sinh vật sống, nấm, vi khuẩn, virus, sinh vật nguyên sinh, thực vật và động vật protease là nhóm lớn nhất với hơn 560 chủng đã được biết đến[9]

Cơ chế thủy phân như sau: thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và có thể trở thành hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, khi đó sự thay đổi cấu trúc phân tử thao hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzyme chuyển sang trạng thái hoạt động[37]

Protease cần thiết cho các vi sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa )

và động vật ( gan, dạ dày bê…) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất[37][38]

Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng

Hình 1.2: Cấu tạo của

protease

Hình 1.3: Cấu trúc không

gian của protease

1.3.1.2 Phân loại protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)[36]

Sơ đồ phân loại protease

Protease được chia làm hai loại endopeptidase và exopeptidase

• Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác hoạt động thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra môt amino acid hoặc một dipeptide

Aspartic proteinase Metallo proteinase

+ Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong TTHĐ và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính vào hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm[30]:

- Protease acid: pH 2- 4

- Protease trung tính: pH 7- 8

- Protease kiềm: pH 9- 11

1.3.2 Chất ức chế protease (protease inhibitor- PI)

1.3.2.1 Khái niệm và phân loại

Khái niệm: Chất ức chế protease là những chất có tác dụng ức chế hoạt động của protease ở những mức độ khác nhau

Phân loại:

a Dựa vào nguồn gốc của chất ức chế protease

- Chất ức chế tổng hợp như FOY- 305[11], các chất tương tự pepstatin,

- Chất ức chế protease có nguồn gốc động vật như aprotinin, hirustatin,

- Chất ức chế có nguồn gốc thực vật như amastatin, E-64, bestatin[8]

b Dựa vào các nhóm protease bị ức chế[2][8]

- Serin protease inhibitor như leupeptin, antipain, chymostatin, elastatina,

- Cystein protease inhibitor như E- 64,

- Aspartic protease inhibitor như pepstatin, hydropeptatin,

- Metallo protease inhibitor như bestatin, amastatin, actinonin, histagin,

Trong đó các chất ức chế loại serine protease được chú ý nghiên cứu nhiều nhất

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 12

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease[3][4][5][9]

A PI động vật Aprotinin Tụy, mang tai, phổi,gan

của động vật

Chymotrypsin, trypsin,

B PI thực vật Kunitz trypsin

inhibitor

C PI vi sinh vật

D PI tổng hợp Saquinavir Nhân cấu trúc:

NHCH(R)CH(OH)CH2NR

HIV protease (Serin protease)

(Serin protease)

1.3.2.2 Cấu trúc và tính chất của chất ức chế protease

PI là chất ức chế đặc hiệu có nhiều bản chất khác nhau nhưng các PI có bản chất protein được nghiên cứu ứng dụng nhiều hơn cả Trong phân tử của chất ức chế protease có một phần tương tác đặc hiệu, kết hợp trực tiếp với trung tâm hoạt động của protease bị nó ức chế, gọi là trung tâm phản ứng Gốc acid amin có vai trò quan trọng nhất trong tương tác đặc hiệu với enzym gọi là acid amin của trung tâm phản ứng, kí hiệu là acid amin PI, liên kết peptid tương ứng –P I-P’I gọi là liên kết peptid của trung tâm phản ứng thường nằm trên bề mặt của phân tử PI trong vùng có cầu disunfua Bản chất gốc P1 phản ánh tính đặc hiệu của PI Acid amin P1 của chát ức chế trypsin thường là lysin hoặc arginin của Chymotrypsin là methionin hoặc leucin Ngoài acid amin PI, các acid amin lân cận cũng có ảnh hưởng quan trọng đến tính đặc hiệu của chất ức chế

Phân tử PI có thể có 1, 2, 3 hay nhiều trung tâm phản ứng Nếu chỉ có một trung tâm phản ứng gọi là chất ức chế một đầu hay đầu đơn, nếu có hai trung tâm phản ứng- chất ức chế hai đầu hay đầu kép, và nếu có nhiều trung tâm phản ứng- chất ức chế nhiều đầu Các PI hai đầu hay nhiều đầu có thể kết hợp đồng thời hai hay nhiều phân tử protease, các enzym này có thể có tính đặc hiệu giống nhau hoặc khác nhau[1] Mỗi một chất ức chế protease thường

có tác dụng ức chế đặc hiệu một hoặc một số protease

Cho đến nay, chúng ta đã tìm ra hơn 100 chất ức chế protease trong tự nhiên được tách ra từ nhiều tổ chức khác nhau của vi khuẩn, thực vật, động vật Những PI này ức chế thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, ngăn cản cơ chất tiếp cận với vị trí xúc tác tại trung tâm hoạt động của enzym suốt quá trình diễn ra sự cản trở Kích cỡ của chúng cũng đa dạng từ 50 đoạn acid amin (như chất ức chế trypsin ở thận bò) tới 400 đoạn acid amin(như chất ức chế alpha-proteinase) Những chất ức chế serin được nghiên cứu và biết đến nhiều

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 14

nhất Gần đây, một bước tiến lớn đã hình thành nghiên cứu ức chế tự nhiên của cystatine Trong khi đó, những hiểu biết về chất ức chế cả aspatyl và metallo đều rất hạn chế Vì vậy nghiên cứu chất ức chế protease vẫn còn nhiều vấn đề cần được quan tâm tìm hiểu đặc biệt đối với chất ức chế aspatyl protease và metalloprotease[16]

1.3.2.3 Cơ chế tác động của chất ức chế protease

Một số chất ức chế protease thường có tác dụng ức chế đặc hiệu một hoặc một số protease Tất cả các chất ức chế protease đều hoạt động theo cơ chế gần giống nhau Chúng ngăn cản hoạt động của enzyme protease trong phạm vi tế bào người hay những vi sinh vật Protease vi sinh vật cần thiết cho quá trình trưởng thành và sinh sản Khi các PI gắn vào enzym này, những vi sinh vật mới vẫn có thể rời tế bào nhưng chúng không thể lây nhiễm sang tế bào khác được Vì vậy sẽ ngăn cản được sự lây lan vi sinh vật trong cơ thể[10] Chất ức chế protease tác dụng theo hai cách sau[2][21]

- Ức chế hoạt động của các protease bởi phản ứng tương tác protein- protein

- Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào trung tâm hoạt động của các protease

Quá trình ức chế protease của các chất ức chế cũng chính là sự tương tác giữa enzym và chất ức chế theo một cơ chế phổ biến- cơ chế chuẩn giống

cơ chất Chất ức chế (I) kết hợp với enzym (E) theo cách tương tự như cơ chất kết hợp với enzym, nghĩa là có sự tương ứng về câu trúc không gian của trung tâm phản ứng chất ức chế và trung tâm hoạt động enzym theo kiểu “ổ khóa”

và “chìa khóa” Có thể biểu diễn tương tác theo sơ đồ sau:

E+ I ↔E- I ↔E+ I

Phức hợp E-I được hình thành rất nhanh và thường phân ly rất chậm thành enzym tự do cũng chất ức chế dạng ban đầu hoặc dạng hiệu chỉnh I Trong dạng hiệu chỉnh, liên kết – PI- P’I- bị thủy phân, phức E- I khá bền ở

pH trung tính nhưng dễ bị phân ly ở pH acid ở pH thích hợp cho hoạt động của protease trong phức E- I, nó lại có thể xúc tác cho sự tái tổng hợp liên kết –PI- P’I- Dùng phương pháp đặc hiệu có thể xác đinh bản chất acid amin đầu

N vào đầu C, từ đó biết được bản chất acid amin PI Việc nghiên cứu về chất

ức chế protease rất cần thiết cho việc tìm ra những thuốc mới ứng dụng trong điều trị Tác động của PI từng bệnh sẽ theo những cơ chế khác nhau Việc nghiên cứu và xác định rõ vai trò của PI trong việc phát triển của bệnh là rất cần thiết Nhìn chung, PI ứng dụng trong điều trị hoạt động của protease theo

ba cơ chế chính là:

- Ức chế sự thủy phân protein thành acid amin, ngăn cản sự tổng hợp nên protein mới, cơ chế này được thấy rõ nhất trong điều trị virus và bảo quản thực phẩm

- Ức chế hoạt động của protease mà có vai trò trong phát triển bệnh hay nguyên nhân gây di căn tế bào ung thư và bảo quản thực phẩm

- Chất ức chế protease có vai trò quan trọng trong cơ thể (các PI sinh lý) như trong quá trình đông máu, cầm máu , từ đó dưa ra thuốc aprotinin điều trị xuất huyết

PI có mặt trong hầu hết các tổ chức tự nhiên và ở bất kì tổ chức nào cũng đóng vai trò quan trọng nhất định Tìm hiểu rõ vai trò đó của PI sẽ rất quan trọng trong ứng dụng của chúng sau này[36][37]

1.4 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 16

1.4.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Gần 40 năm, chất ức chế protease được xem như chất không tốt về dinh dưỡng Mãi đến năm 1980, Dr Walter Troll thuộc trường Đại học Y khoa (NewYork University Midical Center) đã khám phá rằng đậu nành nguyên sơ

có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển ở các loài động vật

do tác dụng của chất ức chế protease Tiếp theo đó, nhiều nhà khoa học đã khảo sát và thử nghiệm về chất ức chế protease từ đậu nành trong phòng thí nghiệm và thấy rằng nó có tác dụng chống lại sự phát triển của mầm ung thư kết tràng (colon), ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và ung thư miệng[40] Năm 1987, Viện Ung Thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute)

đã nhận thấy vai trò quan trọng của chất ức chế protease như một loại thuốc chữa bệnh ung thư Chúng ngăn cản sự tác động của một số genes di truyền gây nên chứng ung thư Ngoài ra chúng còn có tác dụng bảo vệ các tế bào cơ thể không cho hư hại, gây nên bởi môi trường xung quanh như tia nắng phóng

xạ, các gốc tự do, chất có thể tấn công DNA[32]

7/11/2002, tại NewYork, theo một nghiên cứu gần đây thì chất ức chế protease tiết ra từ bạch cầu (Secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI) được tìm thấy trong nước đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa lây truyền HIV/AIDS qua sữa mẹ[14] Các báo cáo trước đây cho thấy SLPI

có khả năng bảo vệ tế bào không bị nhiễm HIV trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, nồng độ SLPI trong nước bọt ở trẻ sơ sinh có ảnh hưởng đến nguy cơ lây truyền HIV-1 từ mẹ sang con hay không thì chưa được nghiên cứu Tiến sĩ Carey Farquhar, thuộc trường Đại học Washington ở Seattle và cộng sự đang tiến hành nghiên cứu đo nồng độ của SLPI trong các mẫu nước bọt từ 188 trẻ

sơ sinh của các bà mẹ nhiễm HIV Các mẫu nước bọt này lấy lúc mới sinh và lúc 1, 3, 6 tháng tuổi [31]

Năm 2006, Coralie E và cộng sự (Viện Hóa sinh học, Đại học Washington, Mỹ) đã công bố đề tài nghiên cứu về Kunitz- một chất ức chế cysteine protease tinh chế từ Cauli và Arabidopsis Đề tài này đã nghiên cứu

về trình tự gen tổng hợp chất ức chế Kunitz và kiểm tra hoạt động của chúng trong một số môi trường khác nhau[41]

Năm 2009, Simone Susser và cộng sự tại viện nghiên cứu Schering- plough, Đức đã công bố kết quả ngiên cứu chất ức chế protease đối với bệnh nhân bị viêm gan C

Năm 2015, các nhà khoa học của trường Đại học Haidelberg, Đức đã công bố nghiên cứu về các chất ức chế serprin A3N có thể làm giảm đau thần kinh bằng cách ức chế tế bào T có nguồn gốc từ bạch cầu elastste

Đến nay, các chất ức chế protease đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn Có thể nói không ở tổ chức sống nào là không tồn tại các chất ức chế protease và nhiều chất ức chế protease đã được tổng hợp nhân tạo Một số công trình nghiên cứu ứng dụng của chất ức chế protease vào các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như:

“ Sử dụng các chất ức chế protease trong xét nghiệm hiện kháng nguyên” của Thurgau, Viện Công nghệ sinh học tại Đại học Constance, Kreuzlingen, Thụy Sĩ

“Hoạt động kháng virus của các chất ức chế protease chống lại Toxoplasma gondii” Bộ môn Ký sinh trùng, Viện Y học Nhiệt đới, Pedro Kouri, Havana, Cuba

“Phân lập chất ức chế Pepsin từ rễ cây Anchusa strigosa” của Sở Khoa học sinh học, Khoa học, Đại học Jordan, Amman, Jordan

“Nghiên cứu về một số chất ức chế protease aspartic quy định tổng hợp protease nội sinh trong giai đoạn vận động nảy mầm hạt giống Vigna radiate”

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 18

của phòng Khoa học Sinh hóa, phòng thí nghiệm và hóa chất quốc gia, Ấn Độ

do Aarohi Kulkarni, Mala Rao thực hiện

Hiện nay, khoảng 32 chất ức chế protease hiện đang sử dụng trong lâm sàng và ít nhất 9 chất nữa đang được triển khai Phần lớn các chất ức chế protease báo cáo cho đến nay là tổng hợp hóa học được thiết kế dựa trên cấu trúc Các chất ức chế protease cũng được tìm thấy trong các nguồn tự nhiên,

ví dụ Miraziridine A, chất ức chế cathepsins B và L được phân lập từ hải

miên biển Theonella mirabilis

Ngoài ra, đã phân lập được từ chủng vi khuẩn Micromonospora sp RV115, liên kết hải miên Aplysina aerophoba (Croatia) có hoạt tính chống

khối u, chống oxy hóa và hoạt tính ức chế protease [32]

Ba chủng vi khuẩn được phân lập từ hải miên Jaspis sp, có hoạt tính ức

chế protease Ba chủng này ức chế serine protease (subtilisin), metalloprotease (thermolysin) và dịch chiết thô của vi khuẩn gây bệnh

S.aureus và P.aeruginosa chủng SAB S-2 tương đồng với Providencia dựa trên trình tự 16S SAB 17- Paracoccus Chủng SAB S-21- Bacillus sp Vi

khuẩn biển Alteromonas sp, sinh chất ức chế protease marinostatin

Pseudomonas sagamiensis cũng sinh chất ức chế protease Abdelmohsen và cộng đã tách được Diazepinomomicin từ chủng Micromonospora sp, RV115 liên kết hải miên Aplisina aerophoba (Croatia) có hoạt tính không những

kháng khối u phổ rộng mà còn có khả năng chống oxy hóa và ức chế protease Một sản phẩm tự nhiên khác có hoạt tính ức chế protease là các dẫn xuất của

tetromycin, tetromycins 1-4 được tách từ xạ khuẩn Streptomyces axinellae Po1001T liên kết hải miên Axinella polypoides của biển Mediterranean Các

sản phẩm tự nhiên này có hoạt tính ức chế một vài cystein proteases

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, vấn đề nghiên cứu của chúng ta còn gặp nhiều khó khăn với nhiều nguyên nhân khách quan như kinh phí, nhân lực, việc tìm hiểu và nghiên cứu chất ức chế protease cũng chỉ mới bắt đầu

Một số luận văn, đề tài, báo cáo khoa học cũng nghiên cứu về chất ức chế protease trên khía cạnh điều trị bệnh ung thư hoặc phương pháp tách chiết hoặc sử dụng thực phẩm chứa các chất ức chế protease vào đời sống như[41]: Luận văn “Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị” do Tạ Thị Ngọc Hoan của trường Đại Học Dược Hà Nội năm 2006 Luận văn “Polyphenol và hoạt độ ức chế của một số serine proteinase

từ thân, hạt gôc Vang (Caesalpinia sappan L) và một số cây thuốc khác” Tác giả Nguyễn Minh Thắng – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội

“ Nghiên cứu điều tra các chất ức chế proteinase ở các phần khác nhau của thân và hạt cây Tô mộc (Caesalpinia sappan L)” Do Hoàng Thu Hà và Phạm Thị Trân Châu thực hiện công bố ngày 29 tháng 10 năm 2008 Công trình này nghiên cứu tác dụng của dịch chiết từ các phần khác nhau của thân

và hạt cây Tô mộc (C.sappan) đến hoạt độ của một số loại proteinase[42].Nghiên cứu “Hoạt tính ức chế pepsin và protease HIV-1 của cao chiết

và hoạt tính Acid maslinic từ dược liệu” do Nguyễn Văn Dũng và cộng sự phòng thí nghiệm trọng điểm Công Nghệ Enzym và Protein công bố năm

2015

Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chương trình nghiên cứu giám sát đa dạng sinh học động vật biển, đặc biệt là sự hợp tác lâu năm của Viện hàn lâm Khoa học Nga và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nhằm thu thập mẫu vật tại các vùng biển Việt Nam

Tuy nhiên, các nghiên cứu về hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và chưa có nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật liên đới hải miên cũng như phát hiện các chất ức chế protease từ hệ vi sinh vật này

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 20

tạo dòng Trong số các loại vector hiện nay thì plasmid được sử dụng rộng rãi nhất Về chức năng, người ta chia vector thành hai loại lớn là vector tạo dòng (cloning vector) và vector biểu hiện (expression vector)

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCR®2.1 để tách dòng gen mã hoá PI thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên

VectorpCR ® 2.1

Đây là một trong các vector có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector

đã được cắt mở vòng do có hai đầu dính, mỗi đầu có một base Thimin.Vector

pCR ® 2.1 có kích thước 3,9kb, được thiết kế có gắn một operon chuyển hoá

đường lactoza là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này

là gen cấu trúc mã hoá cho β-galactosidase có vùng đa cắt với 17 vị trí cắt cho

các enzyme giới hạn: EcoRI, Hind III, Nsi I.KpnI, SacI, BamHI, SpeI, BstX I, EcoR V, NotI, AvaI, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I Trong đó EcoR I và BstX I

có hai vị trí cắt các enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt Với vị trí vùng cắt

gắn đa vị như vậy, sản phẩm β-galactosidase có thể được tạo ra (nếu vector

không được gắn đoạn ngoại lai) hoặc không được tạo ra (nếu vector gắn đoạn ngoại lai) Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao Ngoài ra, vector pCR®2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin với nồng độ ức chế tối thiểu

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pCR®2.1

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 22

PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

Vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị

2.2 Vật liệu, hóa chất và môi trường nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu hải miên được thu thập từ vùng biển Quảng Trị

- Kit tách DNA ZR Soil Microbe DNA MiniprepTMcủa Zymo; GeneJet gel Extraction Kit của Thermo Scientific; TA cloning kit của Invitrogen; GeneJET Plasmid Miniprep Kit của Thermo Scientific

2.2.2 Hóa chất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

Bảng 2.1: Tên hóa chất và hãng sản xuất sử dụng trong thí nghiệm

Tên hóa chất Hãng sản xuất Tên hóa chất Hãng sản xuất