THU NHẬN, NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG Phanerochaete chrysosporium VÀO E. coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THU NHẬN, NHÂN DỊNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG Phanerochaete chrysosporium VÀO E coli Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LÊ THỊ HUỲNH TRÂM Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THU NHẬN, NHÂN DỊNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG Phanerochaete chrysosporium VÀO E coli Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN XUÂN ĐỒNG LÊ THỊ HUỲNH TRÂM Tháng 6/2013 LỜI CẢM ƠN Vậy bước đến vạch cuối đường Đại học ngày hơm nay, để hồn thành luận văn này, chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Xuân Đồng định hướng ý tưởng nghiên cứu cho tôi, giúp đỡ kiến thức chun mơn, tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp chỉnh sửa luận văn Tôi cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM anh chị phịng Cơng nghệ Vi sinh tạo điều kiện, hỗ trợ kinh phí thiết bị để tơi thực đề tài Tôi chân thành cảm ơn bạn Tùng ủng hộ, động viên hỗ trợ suốt thời gian làm đề tài; bạn Tiên, Linh, Đơng,… nhiệt tình giúp tơi tơi lúc khó khăn Và cuối cùng, hết, từ đáy lòng cảm ơn ba mẹ sinh con, nuôi dạy khôn lớn, bên con, động viên, tạo điều kiện tốt tinh thần vật chất để trở thành ngày hôm Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2013 Lê Thị Huỳnh Trâm i TÓM TẮT Cùng với phát triển xã hội, nhu cầu lượng người ngày tăng dẫn đến thiếu hụt nhiên liệu Trong đó, nhiên liệu hóa thạch, nguồn lượng nay, dần cạn kiệt gây nhiều tác động xấu đến mơi trường Do đó, ethanol sinh học, nguồn lượng có nguồn gốc từ thiên nhiên khơng gây ô nhiễm môi trường, nhiều nước sản xuất nhằm thay nguồn nhiên liệu có Tuy nhiên quy trình sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ cịn nhiều khó khăn tốn chi phí, đặc biệt giai đoạn loại bỏ thành phần lignin Vì vậy, đề tài giai đoạn quan trọng nhằm hướng đến mục tiêu tăng khả sản xuất enzyme lignin peroxidase, từ nâng cao hiệu việc loại bỏ lignin, tạo điều kiện thuận lợi cho quy trình sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ Trong nghiên cứu này, nhận thấy nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium lồi có hệ enzyme phân giải lignin hồn chỉnh, nên hai dịng P chrysosporium BKM-F 1767 LG17 kiểm tra diện gen mã hóa enzyme LiPH8 hệ gen chúng phương pháp PCR Sau đó, ni cấy hai dịng môi trường hạn chế nitrogen tạo điều kiện cho biểu mRNA mã hóa cho enzyme LiPH8 Sử dụng phương pháp RT-PCR để thu nhận cDNA mã hóa cho enzyme LiPH8 hai dòng cDNA gắn chèn vào vector biểu pPIC9K Sau đó, plasmid tái tổ hợp pPIC9K mang gen LIPH8 biến nạp vào E coli DH5α Kết PCR giải trình tự cho thấy hai dịng mang gen mã hóa cho enzyme LiPH8, tương đồng gen LIPH8 dòng LG17 lên đến 98% so với trình tự gen LIPA NCBI cDNA LIPH8 mã hóa enzyme LiPH8 dịng BKM-F 1767 phân lập thành công từ RNA tổng số không nhận thấy khác biệt trình tự acid amin cDNA LIPH8 mã hóa với trình tự gen LIPA mã hóa Ngồi ra, chưa thu nhận cDNA LIPH8 dòng LG17, nên gen TH-LIPH8 tiến hành tổng hợp nhân tạo dựa theo trình tự DNA dịng LG17 Đoạn gen tối ưu hóa trình tự DNA nhằm biểu tốt hệ thống biểu Pichia pastoris Plasmid pIDTSmart-TH-LIPH8 mang gen LIPH8 tổng hợp biến nạp thành cơng vào E coli DH5α Sau tạo dịng thành cơng E coli DH5α mang plasmid biểu pPIC9K chứa gen TH-LIPH8 ii SUMMARY “Isolating, cloning gene encoding enzyme lignin peroxidase H8 from white-rot fungus Phanerochaete chrysospoirum into E coli” Along with the development of society, the increase of energy demands lead to fuel shortage Particularly, fossil fuels, the major source of energy today, are being depleted and cause many negative effects on environment Hence, many countries are producing bioethanol, a new energy source, which originates in nature and doesn’t cause pollution, to replace the existing fuel sources However, the bioethanol production process from rice straw not only faces many difficulties but it also costs a lot of money, especially in removing lignin Therefore, this thesis is an important period in our main target It is increasing efficiency of lignin peroxidase production, that helps improve the lignin removal, creating convenient conditions for bioethanol production process from rice straw In this study, realising Phanerochaete chrysosporium has a complete lignin degrading system, so two strains P chrysosporium BKM-F 1767 and LG17 was checked the presence of gene encoding LiPH8 in their genome by applying PCR method Next, these strains were cultured under nitrogen-limited condition to stimulate expression of mRNA encoding LiPH8 LIPH8 cDNA was isolated from RNA by using RT-PCR technique, and then it was ligated to pPIC9K expression vector Plasmid recombination pPIC9K containing LIPH8 gene was transformed into E coli DH5α The result of PCR reaction and sequencing showed that gene encoding LiPH8 presents in genome of both strains BKM-F 1767 and LG17, when compared with nucleotide sequence of LIPA gene in NCBI, similar to LIPH8 gene of LG17, and LIPA gene is up to 98% LIPH8 cDNA was isolated from total RNA of BKM-F 1767 and there is no difference between amino acid sequence encoded by LIPH8 cDNA and that by LIPA gene In addition, because LIPH8 cDNA of LG17 hasn’t been isolated yet, TH-LIPH8 gene was synthesised basing on nucleotide sequence from DNA of LG17 and changed to optimized expression in Pichia pastoris Plasmid pIDTSmart-THLIPH8 containing LIPH8 gene synthesised was cloned into E coli DH5α Plasmid recombination pPIC9K bringing TH-LIPH8 gene was also cloned into E coli DH5α iii Keywords: Phanerochaete chrysosporium, lignin degration system, lignin peroxidase H8 gene, molecular iv biology, cloning MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan lignocellulose lignin .3 2.1.1 Cấu tạo đặc điểm lignocellulose 2.1.2 Đặc điểm lignin .4 2.1.2.1 Cấu tạo vai trò lignin 2.1.2.2 Loại bỏ lignin sản xuất ethanol sinh học 2.2 Hệ enzyme phân giải lignin 2.2.1 Manganese peoxidase, MnP (EC 1.11.1.13) 2.2.2 Laccase (EC 1.10.3.2) 2.2.3 Lignin peroxidase, LiP (EC 1.11.1.14) 2.3 Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium .8 2.4 Hệ gen mã hóa enzyme lignin peroxidase P chrysosporium 10 2.4.1 Trình tự gen LIP 11 2.4.2 Vùng mã hóa 11 2.4.3 Trình tự mở đầu 12 2.4.4 Cấu trúc intron .12 2.4.5 Trình tự điều hịa 13 v 2.4.6 Gen LIP loài nấm khác .14 2.5 Ứng dụng lignin peroxidase .14 2.6 Một số nghiên cứu tạo dịng gen mã hóa enzyme lignin peroxidase 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu 18 3.2.1 Chủng vi sinh vật 18 3.2.2 Enzyme dùng phản ứng .18 3.2.3 Kit phân tích mẫu 18 3.2.4 Vector biến nạp vào E coli DH5α 18 3.2.5 Mồi dùng phản ứng PCR 19 3.2.6 Hóa chất .20 3.2.7 Các thang chuẩn 20 3.2.8 Môi trường 21 3.3 Phương pháp thực 22 3.3.1 Khảo sát hoạt tính enzyme LiP P chrysosporium 22 3.3.2 Kiểm tra diện gen LIPH8 mã hóa cho enzyme LiPH8 hệ gen hai dòng P chrysosporium BKM-F 1767 LG17 23 3.3.3 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 P chrysosporium .24 3.3.4 Tạo dịng cDNA LIPH8 mã hóa LiPH8 tế bào E coli DH5α 26 3.3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-LIPH8 26 3.3.4.2 Biến nạp plasmid pPIC9K-LIPH8 vào tế bào E coli DH5α .28 3.3.4.3 Chọn lọc dòng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp .29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Hoạt tính enzyme LiP P chrysosporium 31 4.2 Kiểm tra diện gen LIPH8 mã hóa cho enzyme LiPH8 hệ gen hai dòng P chrysosporium BKM-F 1767 LG17 33 4.3 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 P chrysosporium 35 4.3.1 Tách chiết RNA tổng số P chrysosporium BKM-F 1767 LG17 35 4.3.2 Thu nhận cDNA mã hóa gen LIPH8 36 4.4 Tạo dòng cDNA LIPH8 gen TH-LIPH8 vào E coli DH5α 41 vi 4.4.1 Sàng lọc dòng E coli DH5α mang gen TH-LIPH8 phương pháp PCR khuẩn lạc 41 4.4.2 Tạo dòng E coli DH5α mang vector biểu pPIC9K chứa gen LIPH8 TH-LIPH8 P chrysosporium 44 4.4.2.1 Sàng lọc dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 pPIC9K-LIPH8 phương pháp PCR khuẩn lạc 44 4.4.2.2 Kiểm tra dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 enzyme cắt giới hạn 46 4.4.2.3 Kiểm tra dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 giải trình tự 47 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 Tài liệu tham khảo 51 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate cDNA Complementary deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid FPLC Fast protein liquid chromatography LB Luria-Bertani LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase mRNA messenger ribonucleic acid MEA Malt Extract Agar MEB Mineral Salts Broth MSB Malt Extract Broth NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosome ribonucleic acid tRNA Transfer ribonucleic acid UniProt Universal Protein Resource viii ... tài ? ?Thu nhận, nhân dòng gen mã hóa enzyme lignin peroxidase H8 từ nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium vào E coli? ?? nhằm mục đích nghiên cứu nâng cao hiệu sản xuất enzyme LiP để ứng dụng vào. .. tài - Thu nhận cDNA mã hóa enzyme LiPH8 P chrysosporium - Nhân dịng thành cơng gen mã hóa enzyme LiPH8 vào E coli 1.3 Nội dung thực Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme LiP hai dòng nấm mục trắng. .. CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THU NHẬN, NHÂN DỊNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG Phanerochaete chrysosporium VÀO E coli Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS