Nghiên cứu khai thác các gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối coptotermes gestroi

MỞ ĐẦU L‎ý chọn đề tài Trong bối cảnh kinh tế giới bước vào toàn cầu hóa, biến động giới ảnh hưởng tới quốc gia, có Việt Nam Trong vài năm trở lại thị trường xăng dầu biến động, tăng giá liên tục, ảnh hưởng không nhỏ tới kinh tế nước ta Theo dự đoán nhà khoa học, trữ lượng loại nhiên liệu hóa thạch giới cạn kiệt dần vòng vài chục năm tới Thế giới bị lệ thuộc nhiều vào dầu khí, nhiều nước giới tìm cách phát triển nguồn nhiên liệu thay thế, phải kể đến nhiên liệu sinh học Cũng nhiều quốc gia khác, việc sử dụng lượng gió, lượng mặt trời, lượng từ nguồn sinh khối giải pháp xem xét áp dụng Việt Nam Và số nhiên liệu thay đó, cồn sinh học (bio - ethanol) lên ứng cử viên sáng giá nhất, đáp ứng tiêu chuẩn dễ sản xuất, giá rẻ “thân thiện” với môi trường Cồn sinh học sản xuất phương pháp lên men sản phẩm hữu có chứa hàm lượng carbonhydrate cao loại ngũ cốc chứa tinh bột chuyển hóa thành đường đơn (ngô, lúa mì, lúa mạch, gạo, ) hay loại cỏ chứa lignocellulose ( rơm, rạ, bã mía, gỗ, trấu, ) Là nước nông nghiệp, Việt Nam đứng hai giới xuất gạo chất thải nông nghiệp rơm rạ, cỏ, lá,vv nguyên liệu tự nhiên có sẵn cánh đồng hoa màu Ước tính hàng năm có khoảng 3040 triệu rơm rạ, triệu trấu bị bỏ Gần đây, Thủ Tướng Chính Phủ định số 177/2007/QD-TTg phê duyệt kế hoạch cho phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn đến năm 2025 Trong đó, nghiên cứu, sản xuất ứng dụng nhiên liệu sinh học nhấn mạnh Tuy nhiên, giá thành sản xuất cồn sinh học từ phế phụ phẩm nông nghiệp Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh cao, nguyên nhân cho chưa có nguồn enzyme chuyển hóa nhanh, hiệu lignocellulose thành đường đơn dùng lên men cồn Vì vậy, mục tiêu trước mắt phải tìm nguồn enzyme có đặc điểm tốt để dùng cho chuyển hóa lignocellulose Mối động vật chân khớp có khắp nơi tiêu hóa lignocellulose hiệu Ngoài enzyme phân giải hemicellulose có từ thân mối, vi sinh vật cộng sinh ruột mối đóng vai trò đáng kể làm tăng hiệu chuyển hóa lignocellulose Do đó, ruột mối xem nguyên liệu tiềm để khai thác gen mã hóa enzyme phân giải lignocellulose cho định hướng nghiên cứu ứng dụng [9] Metagenomic phương pháp nghiên cứu metagenom – vật liệu di truyền tồn mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm genom nhiều cá sống môi trường [9] Metagenomic sử dụng rộng rãi thành công giới gần 40 năm qua [23] Một số tác giả sử dụng kỹ thuật metagenomic xây dựng thư viện DNA tách chiết thành công số dòng hemicellulose phương pháp metagenomic từ môi trường khác mẫu đất [10], cỏ trâu bò [6] hay phân thỏ [8] Dựa vào lợi metagenomic, thực đề tài “Nghiên cứu khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi” Mục tiêu nghiên cứu Tách chiết, tinh thành công DNA metaganome hệ vi sinh vật ruột mối dùng cho giải trình tự metagenome khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh Chương - TỔNG QUAN TÀI L‎IỆU 1.1 Sơ lược loài mối Mối thuộc Cánh (Isoptera), lớp Côn trùng (Insecta), loài côn trùng có đời sống xã hội, mối sống thành tập đoàn, hình thành từ hàng trăm hàng triệu thành viên [14] Mối có khả tiêu hóa lignocellulose, có hemicellulose làm nguồn lượng có ích Khả có nhờ phần vào sinh vật cộng sinh ruột mối, sinh vật tiết enzyme cellulase, hemicellulase thủy phân hoàn toàn lignocellulose thành đường [12] Có khoảng 2600 loài mối giới, chúng thường phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Theo kết nghiên cứu loài mối Việt Nam “Viện phòng trừ Mối bảo vệ công trình” (2009) có tổng số 141 loài mối thuộc họ, phân họ 38 giống mối tìm thấy Việt Nam, 120 loài số chúng định danh đầy đủ tên khoa học, 21 loài chưa định danh 1.2 Sơ lược loài mối Coptortermes gestroi Coptotermes gestroi (Isoptera: Rhinotermitidae ) loài đặc hữu khu vực Đông Nam Á, phổ biến nơi ấm áp, lượng mưa cao, độ cao thấp khu vực đông dân Hiện khu vực phân bố chúng lan rộng đến nhiều nơi khác giới [15] Giống loài mối mọt khác, loài C gestroi chia làm cấp chính: mối chúa, mối lính mối thợ Mối thợ có trách nhiệm nuôi dưỡng tổ chăm sóc mối khác Mối lính có trách nhiệm bảo vệ an ninh cho tổ Bề ngoài, mối lính C gestroi có thóp trán, có cặp lông gần mép thóp Mối lính lớn mối thợ, màu trắng đục, đầu hình trứng, phân đoạn trước bụng có màu nâu đậm Cơ thể mối thợ nhỏ hơn, mập Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh màu trắng đục Mối chúa có chức sinh sản liên tục thể lớn nhiều so với mối khác Coptotermes gestroi loài mối nguy hiểm, gây hại Chúng tiêu thụ tất vật liệu có chứa liglocellulose, từ gỗ, giấy vải Chúng khoan lỗ vật liệu cao su, nhựa xốp để tìm kiếm thức ăn Chúng công sống cách tiêu thụ tâm gỗ làm suy yếu, đổ Chúng sống lòng đất xây dựng tổ thông qua khe, vết nứt đất Chúng ăn gỗ từ bên bên ngoài, để lại lớp màng mỏng bề mặt sàn mảng phồng rộp [25] Theo số nghiên cứu, chiết xuất protein thô từ C gestroi thu hiệu lượng enzyme khoảng pH rộng enzyme có hoạt tính nhiều loại polysaccharides tự nhiên chứa nhiều liên kết glycosidic Phương pháp phân tích protein xác định thành công 55 loại protein khác phân loại thành 29 họ CAZy Dựa tổng số peptide xác định, phần lớn thành phần tìm thấy C gestroi digestome enzyme cellulose , enzyme thủy phân xylan, mannan, pectin enzyme phân hủy tinh bột Phân tích proteomic toàn diện sưu tập đầy đủ enzym thủy phân từ mối bao gồm cellulase (GH1, GH3, GH5, GH7, GH9 CBM 6), hemicellulases (GH2, GH10, GH11, GH16, GH43 CBM 27) pectinaza (GH28 GH29 ) [25] Hình 1.1 : Loài mối Coptotermes gestroi Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh 1.3 Sơ lược Metagenomics Metagenomics phương pháp nghiên cứu metagenom - vật liệu di truyền tồn mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm genom nhiều cá sống môi trường [9] Đây lĩnh vực tương đối nghiên cứu di truyền cho phép nghiên cứu vi sinh vật không qua nuôi cấy phòng thí nghiệm nghiên cứu đặc tính sinh lí di truyền vi sinh vật môi trường tự nhiên 1.4 Tổng quan lignocellulose Lignocellulose thành phần cấu trúc thực vật thân gỗ thực vật khác cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, tìm thấy lignocellulose thực vật hay chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp chất thải rắn thành phố Thành phần chủ yếu lignocellulose cellulose (38-50%), hemicellulose (20-32%) lignin (15-25%) [2, 23] Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc thành tế bào thực vật 1.4.1 Cellulose Cellulose hợp chất hữu có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật Cellulose glucan không phân nhánh, cấu tạo đơn phân β-D-glucose liên kết với liên kết Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh β-1,4-glycoside, khác biệt cellulose phân tử carbohydrate phức tạp khác [1] (Hình 1.3) Hình 1.3: Công thức hóa học cellulose Các mạch cellulose liên kết với nhờ liên kết hydro liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc tinh thể vô định hình Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp tinh bột glycogen Cellulose có cấu trúc bền khó bị thủy phân Người động vật enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa cellulose, cellulose giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy cellulose có vai trò điều hòa hoạt động hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn cỏ gia súc, động vật nhai lại động vật nguyên sinh ruột mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất phân hủy cellulose Vì chúng sử dụng cellulose làm thức ăn 1.4.2 Lignin Lignin phức hợp chất hóa học phổ biến tìm thấy hệ mạch thực vật, chủ yếu tế bào, thành tế bào thực vật Lignin đại phân tử, có khối lượng phân tử lớn 10.000 đvC, cấu trúc không gian chiều, phức tạp, vô định hình, có cấu trúc nhiều vòng thơm, có đặc tính không ưa nước khó phân hủy Vì vậy, enzyme phân giải lignin có vai trò quan trọng chu trình vận chuyện cacbon trái đất [3] Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh Trong enzyme oxidase phân hủy lignin, enzyme có hoạt tính mạnh ligninase manganese peroxidase [3], [10] Lignin polyphenol có cấu trúc mở, cấu thành từ đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-pcourmary alcohol (Hình 1.4) Hình 1.4: Các đơn vị lignin Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose với cellulose Độ bền hóa học liên kết phụ thuộc vào chất liên kết, cấu trúc hóa học lignin gốc đường tham gia liên kết Cấu trúc hóa học lignin dễ bị thay đổi điều kiện nhiệt độ cao pH thấp điều kiện trình tiền xử lý nước Ở nhiệt độ phản ứng cao 200oC, lignin bị kết khối thành phần riêng biệt tách khỏi cellulose [2] Trong dinh dưỡng động vật, lignin đáng quan tâm không bị tiêu hóa enzyme thể vật chủ Lignin liên kết với nhiều polysaccharide protein màng tế bào ngăn trở trình tiêu hóa hợp chất gỗ [25] Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh 1.4.3 Hemicellulose Hemicellulose chiếm khoảng 20-32% tổng sinh khối lignocellulose thực vật Hemicellulose loại polymer phức tạp phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân Hemicellulose chứa đường carbon gồm glucose, mannose galactose đường gồm xylose arabinose Thành phần hemicellulose β – D xylopyranose, liên kết với liên kết β -(14) Hình 1.5: Một số thành phần cấu tạo nên hemicellulose Cấu tạo hemicellulose phức tạp đa dạng tùy vào nguyên liệu, nhiên có vài điểm chung gồm: - Mạch hemicellulose cấu tạo từ liên kết β -(14) - Xylose thành phần quan trọng - Nhóm phổ biến nhóm acetyl O – liên kết với vị trí - Mạch nhánh cấu tạo từ nhóm đơn giản, thông thường disaccharide trisaccharide Sự liên kết hemicellulose với polysaccharide khác với lignin nhờ mạch nhánh Cũng hemicellulose có mạch nhánh nên tồn dạng vô định hình dễ bị thủy phân Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh Hemicellulose polysaccharide màng tế bào tan dung dịch kiềm có liên kết chặt chẽ với cellulose, ba sinh khối tự nhiên Cùng với cellulose lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững thực vật Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose L-arabinose liên kết với thành phần khác nằm liên kết glycoside [1] Hemicellulose chứa axit 4-Omethylglucuronic, axit D-galacturonic axit glucuronic Trong đó, đường Dxylose, L-arabinose, D-glucose D-galactose phổ biến thực vật thân cỏ ngũ cốc Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose thực vật thân cỏ lại có lượng lớn dạng liên kết phân nhánh phụ thuộc vào loài loại mô loài phụ thuộc vào độ tuổi mô Tùy theo thành phần hemicellulose có chứa monosaccharide mà có tên tương ứng manan, galactan, glucan xylan Các polysaccharide manan, galactan, glucan hay xylan chất phổ biến thực vật, chủ yếu thành phần màng tế bào quan khác gỗ, rơm rạ,… Trong loại hemicellulose, xylan polymer thành tế bào thực vật gốc D-xylopyranose kết hợp với qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, nguồn lượng dồi thứ hai trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm trục chuỗi bên Các gốc thay chủ yếu khung xylan gốc acetyl, arabinosyl glucuronosyl Các nhóm có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị không hóa trị với lignin, cellulose polymer khác Cấu tạo, số lượng vị trí xylan loài thực vật khác khác Xylan tồn dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan gỗ cứng (Hình 1.6), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan gỗ mềm Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh (Hình 1.7) , hay thành phần cấu tạo xylan axit D-glucuronic, có ete 4-O-methyl arabinose loài ngũ cốc [5] Hình 1.6: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan gỗ cứng Hình 1.7: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan gỗ mềm 1.5 Tổng quan enzyme thủy phân hemicellulose Hemicellulase enzyme thủy phân, xúc tác phân giải hemicellulose, cấu tạo từ đường khác nhau, gốc nối với liên kết β-1,3; β-1,4; β-1,6 glycoside Hemicellulase thường tồn dạng Nguyễn Thu Phương 10 Lớp K35C – Sinh M DNA metagenome kb Hình 3.5: Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật sống ruột mối DNA metagenome thu có kích thước nguyên vẹn, có bị lẫn với số tạp chất, DNA RNA không mong muốn 1: DNA metagenome M: thang chuẩn DNA kb Với quy trình tách chiết này, DNA metagenome vi khuẩn ruột mối tách chiết thành công, có kích thước cao băng DNA kb thang DNA chuẩn (Hình 3.5) Tuy nhiên, băng DNA metagenome có số băng DNA RNA khác không mong muốn Hơn nữa, sản phẩm tách chiết có tạp chất axit humic thành phần cần loại bỏ khỏi mẫu DNA metagenome DNA metagenome thu sau tách cần tiến hành tinh phương pháp troughing [11] nhằm loại bỏ tạp chất axit humic có mẫu DNA, để bảo toàn kích thước DNA metagenome nguyên vẹn (Hình 3.6) M Nguyễn Thu Phương 29 Lớp K35C – Sinh Hình 3.6: Ảnh điện di sản phẩm tinh DNA metagenome hệ vi sinh vật sống cộng sinh ruột mối phương pháp troughing Băng DNA metagenome thu có kích thước nguyên vẹn 1: DNA metagenome tinh Troughing M: Thang chuẩn DNA kb DNA metagenome tách chiết phương pháp ổn định, không bị phân cắt Để so sánh định tính mức độ lẫn tạp DNA mối mẫu DNA vừa tách, tinh DNA metagenome kỹ thuật Troughing, sau chuẩn lượng DNA metagenome phương pháp tách cũ phương pháp tách nồng độ Dùng mồi đặc hiệu cho gen mã hóa riboxom 16S ti thể mối để khuếch đại điều kiện kết thấy sau 25 chu kỳ, gen có kích thước 425 bp tổng hợp với băng sáng rõ nét mẫu sử dụng khuôn DNA metagenome tách phương pháp cũ có sử dụng CTAB kit QIAamp Trong mẫu có chứa DNA metagenome tách phương pháp mới, đoạn gen kích thước 428 bp khuếch đại với lượng hẳn (Hình 3.7) Nguồn metagenomic DNA tách chiết với lượng lớn gửi giải trình tự metagenome nguồn kinh phí từ đề tài khác để tiếp tục khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ vi khuẩn ruột mối DNA metagenome tách chiết phương pháp có kích thước hoàn thiện, hàm lượng thu lớn Tuy nhiên, mẫu lần nhiều RNA Nguyễn Thu Phương 30 Lớp K35C – Sinh phân đoạn khác Vì vậy, bước cần thực tinh chế lại DNA metagenome để loại bỏ tạp chất DNA tạp có mẫu M Bps Hình 3.7: Khuếch đại đoạn DNA nằm gen ti thể mã hóa ribosome 16S mối 1: Sản phẩm khuếch đại gen từ khuôn metagenomic DNA tách chiết nghiền mẫu 2: Sản phẩm khuếch đại gen từ khuôn metagenomic DNA vi sinh vật phân tách theo phương pháp tách DNA genome vi khuẩn Sambrook 3.2 Phân tích sơ kết giải trình tự metagenome Giải trình tự genomes hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối thực theo phương pháp metagenomics sequencing sau: Hệ genome tinh giải trình tự toàn hệ thống máy giải trình tự Illumina’s HiSeq (BGI, Hồng Kông) để kho liệu thô Toàn liệu thô có kích thước 5,618.21 M bp loại bỏ trình tự đọc có chất lượng không tốt, chứa "N" thu liệu có chất lượng tốt 5,431.60 M bp Các đoạn trình tự sau so sánh tương đồng để lắp ghép thành trình tự liên tục Các trình tự gọi contig (Hình 3.8) Nguyễn Thu Phương 31 Lớp K35C – Sinh Hình 3.8: Ví dụ cách xếp trình tự để tạo thành contig Các đoạn contig có kích thước khác Chủ yếu đoạn có kích thước khoảng 500 bp sau giảm dần Đáng ý có lượng lớn contig có kích thước từ 2000 bp trở lên Các đoạn chứa gen hoàn chỉnh Nguyễn Thu Phương 32 Lớp K35C – Sinh Hình 3.9: Phân bố kích thước đoạn contig Sau phần mềm Soapalignier trình tự thư viện so sánh tương đồng với contig để tìm đoạn đọc có chất lượng cao, mang toàn gen hay mang vùng gen chức Chỉ số PE số lượng đoạn trình tự có đầu tận tương đồng với đoạn trình tự khác đầu tận xác Những đoạn trình tự có đầu hai đầu không (các lỗi xảy trình giải trình tự nên đoạn trình tự DNA tương đồng với contig) gọi đoạn SE Dựa số K (phân tích thống kê) chọn 18,709,714 trình tự PE tổng số 54,316,028 (Bảng 1) Nguyễn Thu Phương 33 Lớp K35C – Sinh Bảng 1: Các đoạn đọc sử dụng cho lắp ghép Tổng số PE SE trình tự Tỉ lệ (%) 18,709,714 3,063,638 54,316,028 40.09 3.3 Khai thác gen mã hóa enzyme hemicellulase Hình 3.10: Biểu đồ thể % nhóm enzyme tham gia thủy phân lignocellulose tổng số enzyme tham gia vào đường phân Biểu đồ cho thấy nhóm enzyme tham gia thủy phân lignocellulose chiếm phần nhỏ tổng số enzyme tham gia vào trình đường phân, đồng nghĩa với nhóm enzyme thủy phân hemicellulose Sử dụng phầm mềm MetaGeneAnnotator, tìm ra contig mã hóa cho protein chức Trong tổng số 290000 ORF (khung đọc mở mã hóa cho protein chức năng), lọc 8508 ORF (2.93%) có chức liên quan đến trình trao đổi carbohydrate Tuy nhiên, số ORF này, có 441(5.18%) đoạn ORF chưa xác định thuộc nhóm enzyme, protein có 584 ORF (6.88%) mã hóa cho cellulase, hemicellulase, Nguyễn Thu Phương 34 Lớp K35C – Sinh lại số lượng lớn enzyme khác (7924 ORF) tham gia trình chuyển hóa đường Các ORF nhóm vi khuẩn cộng sinh ruột mối Điều cho thấy hệ vi sinh vật ruột mối có khả sử dụng nhiều nguồn cacbon khác tạo nguồn lượng lớn để mối sử dụng Số ORF thuộc nhóm enzyme mã hóa cho hemicellulase gồm loại:alphagalactosidase, alpha-glucuronidase, alpha-N-arabinofuranosidase, arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinosidase, endo-1,4-beta-xylanase, mannan endo-1,4beta-mannosidase, xylan 1,4-beta-xylosidase (bảng 2): Bảng 2: Sự đa dạng enzyme thủy phân hemicellulose hệ vi sinh vật ruột mối STT Mã EC Hemicellulase mã hóa từ gen L‎ack L‎ack L‎ack Complete both Total 5'-end 3'-end ends 3.2.1.22 alpha-galactosidase 20 22 26 77 3.2.1.139 alpha-glucuronidase 20 3.2.1.55 11 14 29 69 3.2.1.99 12 3.2.1.8 endo-1,4-beta-xylanase 10 27 3.2.1.78 mannan endo-1,4-betamannosidase 1 3.2.1.37 xylan 1,4-beta-xylosidase 12 16 11 48 Total 130 145 205 584 alpha-N15 arabinofuranosidase arabinan endo-1,5-alpha-Larabinosidase Nguyễn Thu Phương 104 35 Lớp K35C – Sinh Đồ thị hóa bảng ta có (hình 3.11): Hình 3.11 Sự đa dạng enzyme thủy phân hemicellulose hệ vi sinh vật ruột mối Bảng 2, hình 3.11 cho ta thấy, số ORF mã hóa cho hemicellulase số ORF mã hóa cho enzyme alpha-galactosidase chiếm tỉ lệ lớn (29,73%), tiếp alpha-N-arabinofuranosidase chiếm tỉ lệ 26,64% Sau kết thúc trình xử lý, phân tích liệu, khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối C gestroi (Bảng 3): Nguyễn Thu Phương 36 Lớp K35C – Sinh Bảng 3: Các gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối C gestroi STT Mã gen Termite-2_GL0070950 Termite-2_GL0076873 Tên gen aguA aguA Termite-2_GL0080470 Termite-2_GL0005721 Termite-2_GL0050278 Termite-2_GL0071480 Termite-2_GL0095952 Termite-2_GL0109301 10 Termite-2_GL0114552 Termite-2_GL0120095 11 Termite-2_GL0123535 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Termite-2_GL0125198 Termite-2_GL0001262 Termite-2_GL0067868 Termite-2_GL0072252 Termite-2_GL0073471 Termite-2_GL0076106 Termite-2_GL0090776 Termite-2_GL0091901 Termite-2_GL0092519 Termite-2_GL0093723 Termite-2_GL0104795 Termite-2_GL0106554 Termite-2_GL0112518 Termite-2_GL0010336 Termite-2_GL0021085 Termite-2_GL0024829 Termite-2_GL0028245 Termite-2_GL0051579 Termite-2_GL0072752 Termite-2_GL0074253 Termite-2_GL0074257 Termite-2_GL0074258 Termite-2_GL0075126 Termite-2_GL0075711 Termite-2_GL0076016 Termite-2_GL0079057 Termite-2_GL0085651 Termite-2_GL0107923 40 Termite-2_GL0017317 41 42 Termite-2_GL0005720 Termite-2_GL0024062 aguA alpha-glucuronidase E3.2.1.22B, galA, rafA alpha-galactosidase E3.2.1.22B, galA, rafA alpha-galactosidase E3.2.1.22A, melA alpha-galactosidase E3.2.1.22B, galA, rafA alpha-galactosidase E3.2.1.22A, melA alpha-galactosidase E3.2.1.22B, galA, rafA alpha-galactosidase E3.2.1.22A, melA alpha-galactosidase E3.2.1.22B, galA, rafA alpha-galactosidase E3.2.1.22B, galA, rafA alpha-galactosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.37, xynB xylan 1,4-beta-xylosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase E3.2.1.55, abfA alpha-N-arabinofuranosidase mannan endo-1,4-betaE3.2.1.78 mannosidase E3.2.1.8, xynA endo-1,4-beta-xylanase E3.2.1.8, xynA endo-1,4-beta-xylanase Nguyễn Thu Phương Hoạt tính alpha-glucuronidase alpha-glucuronidase 37 Mã enzyme 3.2.1.139 3.2.1.139 3.2.1.139 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.22 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.78 3.2.1.8 3.2.1.8 Lớp K35C – Sinh 43 Termite-2_GL0046968 E3.2.1.8, xynA endo-1,4-beta-xylanase 3.2.1.8 Bảng cho thấy, kết khai thác thành công 43 trình tự mã hóa cho nhóm enzyme tham gia thủy phân hemicelluloses alphagalactosidase, alpha-glucuronidase, alpha-N-arabinofuranosidase, arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinosidase, endo-1,4-beta-xylanase, mannan endo-1,4beta-mannosidase, xylan 1,4-beta-xylosidase KẾT L‎UẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT L‎UẬN Nguyễn Thu Phương 38 Lớp K35C – Sinh Với kết thu trình thực đề tài, rút số kết luấn sau: • Đã tách chiết thành công DNA metagenome vi sinh vật cộng sinh ruột mối đủ chất lượng cho giải trình tự • Đã khai thác 43 trình tự mã hóa cho nhóm enzyme tham gia thủy phân hemicellulose KIẾN NGHỊ • Khai thác gen mã hóa enzyme có đặc tính quý, thủy phân hiệu hemicellulose từ trình tự khai thác Nguyễn Thu Phương 39 Lớp K35C – Sinh TÀI L‎IỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga ( 2004), “Hình thái-giải phẫu học thực vật” , NXB Đại học Sư phạm, Hà Nội, 57-58 Hồ Diên Vĩnh (2012), “ Nghiên cứu tạo thư viện metagenome từ vi khuẩn cộng sinh ruột mối dùng cho việc sàng lọc enzym tham gia thủy phân lignocellulose”, Đại học Khoa học tự nhiện, Hà Nội Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), “Tương lai ứng dụng enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 23, 75-85 Tài liệu nước Bronnenmeier K, Meissner H, Stocker S, Staudenbauer WL (1995), “alpha-D-glucuronidases from the xylanolytic thermophiles Clostridium stercorarium and Thermoanaerobacterium saccharolyticum”, Microbiology, 141 ( Pt 9):2033-40 Shallom D., Shoham Y (2013), “Microbial hemicellulases”, Current Opinion in Microbiology, 219–228 Duan CJ, Xian L, Zhao GC, Feng Y, Pang H, Bai XL, Tang JL, Ma QS, Feng JX (2009), “Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens”, J Appl Microbiol , 107(1): 245-56 de Sanctis D, Inácio JM, Lindley PF, de Sá-Nogueira I, Bento I (2010), “New evidence for the role of calcium in the glycosidase reaction of GH43 arabinanases”, FEBS J, 277(21):4562-74 Nguyễn Thu Phương 40 Lớp K35C – Sinh Feng Y, Duan CJ, Pang H, Mo XC, Wu CF, Yu Y, Hu YL, Wei J, Tang JL, Feng JX (2007), “Cloning and identification of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum and characterization of the expressed cellulases”, Appl Microbiol Biotechnol, 75(2):319-28 Franco Cairo JP, Leonardo FC, Alvarez TM, Ribeiro DA, Büchli F, Costa-Leonardo AM, Carazzolle MF, Costa FF, Paes Leme AF, Pereira GA, Squina FM (2011), “Functional characterization and target discovery of glycoside hydrolases from the digestome of the lower termite Coptotermes gestroi”, Biotechnol Biofuels, 4, 50 10 Gillespie DE, Brady SF, Bettermann AD, Cianciotto NP, Liles MR, Rondon MR, Clardy J, Goodman RM, Handelsman J (2002), “Isolation of antibiotics turbomycin a and B from a metagenomic library of soil microbial DNA”, Appl Environ Microbiol, 68(9): 4301-6 11 Harnpicharnchai P, Thongaram T, Sriprang R, Champreda V, Tanapongpipat S, Eurwilaichitr L (2007), “An efficient purification and fractionation of genomic DNA from soil by modified troughingmethod”, Lett Appl Microbiol, 45(4):387-91 12 He S, Ivanova N, Kirton E, Allgaier M, Bergin C, Scheffrahn RH, Kyrpides NC, Warnecke F, Tringe SG, Hugenholtz P (2013), “Comparative metagenomic and metatranscriptomic analysis of hindgut paunch microbiota in wood- and dung-feeding higher termites”, PLoS One, 8(4):e61126 13 Joseph Sambrook, David W Russell (2006), “Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform”, CSH Protoc, 2006(1) 14 Kambhampati S, Kjer KM, Thorne BL (1996), “Phylogenetic relationship among termite families based on DNA sequence of mitochondrial 16S ribosomal RNA gene”, Insect Mol Biol, 5(4):229-38 Nguyễn Thu Phương 41 Lớp K35C – Sinh 15 Li HF, Fujisaki I, Su NY (2013), “Predicting habitat suitability of Coptotermes gestroi (Isoptera: Rhinotermitidae) with species distribution models”, J Econ Entomol, 106(1):311-21 16 Nurizzo D, Nagy T, Gilbert HJ, Davies GJ (2002), “The structural basis for catalysis and specificity of the Pseudomonas cellulosa alpha-glucuronidase, GlcA67A”, Structure, 10(4):547-56 17 Prakash R, Johnston SL, Boldingh HL, Redgwell RJ, Atkinson RG, Melton LD, Brummell DA, Schröder R (2012), “Mannans in tomato fruit are not depolymerized during ripening despite the presence of endoβ-mannanase”, J Plant Physiol, 169(12):1125-33 18 Roos AA, Edlund U, Sjöberg J, Albertsson AC, Stålbrand H (2008), “Protein release from galactoglucomannan hydrogels: influence of substitutions and enzymatic hydrolysis by beta-mannanase”, Biomacromolecules, 9(8):2104-10 19 Sanchez-Silva L, López-González D, Villaseñor J, Sánchez P, Valverde JL (2012), “Thermogravimetric-mass spectrometric analysis of lignocellulosic and marine biomass pyrolysis”, Bioresour Technol, 109:163-72 20 Shallom D, Belakhov V, Solomon D, Gilead-Gropper S, Baasov T, Shoham G, Shoham Y (2002), “The identification of the acid-base catalyst of alpha-arabinofuranosidase from Geobacillus stearothermophilus T-6, a family 51 glycoside hydrolase”, FEBS Lett, 514(2-3):163-7 21 Shallom D, Shoham Y (2003), “Microbial hemicellulases”, Curr Opin Microbiol, 6(3):219-28 Nguyễn Thu Phương 42 Lớp K35C – Sinh 22 Spanton SG, Prestwich GD (1981), “Chemical self-defense by termite workers: prevention of autotoxication in two rhinotermitids”, Science, 214(4527):1363-5 23 Valenzuela L, Chi A, Beard S, Orell A, Guiliani N, Shabanowitz J, Hunt DF, Jerez CA (2006), “Genomics, metagenomics and proteomics in biomining microorganisms”, Biotechnol Adv, 24(2), 197-211 24 Warnecke F, Luginbühl P, Ivanova N, Ghassemian M, Richardson TH, Stege JT, Cayouette M, McHardy AC, Djordjevic G, Aboushadi N, Sorek R, Tringe D, Madejska SG,Podar J, Kirton K, Mikhailova M, Martin HG, Kunin V, Dalevi D, Szeto E, Salamov A, Barry E, Platt N, Kyrpides NC, Matson EG, Ottesen EA, Zhang X,Hernández M, Murillo C, Acosta LG, Rigoutsos I, Tamayo G, Green BD, Chang C, Rubin EM, Mathur EJ, Robertson DE, Hugenholtz P, Leadbetter JR (2007), “Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite”, Nature, 450(7169):560-5 Tài liệu web: 25 http://tainguyenso.vnu.edu.vn/xmlui/handle/123456789/2522 Nguyễn Thu Phương 43 Lớp K35C – Sinh [...]... hơn như nhiên liệu sinh học nhờ các enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối có một ý nghĩa rất lớn Do đó, vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối là rất cần thiết Trong nghiên cứu này, DNA metagenome của các sinh vật trong ruột mối được tách chiết và tinh sạch thành công nhờ sự kết hợp các phương pháp truyền... metagenome này được giải trình tự và so sánh trình tự gen với các trình tự gen ngân hàng quốc tế và từ đó sẽ khai thác gen Để nghiên cứu vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối C gestroi chúng tôi đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: 1 Tách DNA metagenome của vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối 2 Tinh sạch DNA metagenome của vi sinh vật. .. phức hệ vi sinh vật ruột mối Vi sinh vật trong ruột mối có tới 99% là các vi sinh vật không nuôi cấy được Do đó để phân lập được gen từ các vi sinh vật này đặc biệt là các gen từ Nguyễn Thu Phương 24 Lớp K35C – Sinh vi khuẩn, đề tài đã tiếp cận phương pháp mới đó là metagenomics Phương pháp này cho phép tách hệ gen tổng số (metagenome) của hệ vi sinh vật trực tiếp từ môi trường sống của nó mà không thông... vào các vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Những sinh vật này tiết ra các enzyme thủy phân lignocellulose thành đường, trong đó có enzyme hemicellulase Mặt khác, Vi t Nam chúng ta lại là một nước nông nghiệp, sản lượng phụ phẩm nông nghiệp chứa hemicellulose rất phong phú như rơm, rạ, bã mía, gỗ, trấu,… Vì vậy, vi c đi sâu nghiên cứu khả năng sử dụng sinh khối hemicellulose để chuyển hóa thành các. .. vật cộng sinh trong ruột mối đủ tiêu chuẩn cho giải trình tự DNA metagenome bằng máy giải trình tự thế hệ mới Ilumina 3 Khai thác gen mã hóa hemicellulase Nguyễn Thu Phương 23 Lớp K35C – Sinh 3.1 Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome 3.1 1 Thu ruột mối từ mối thợ thuộc loài Coptotermes gestroi Để thu ruột chúng tôi sử dụng mối thợ vì đây là nhóm giữ chức năng kiếm ăn cho cả tổ mối nên có hệ tiêu hóa. .. pháp nghiền để thu mẫu ruột, chắc chắn DNA metagenome có chứa lẫn nhiều DNA của mối, dẫn tới vi c khai thác gen trong vi sinh vật ruột mối không hiệu quả Do đó, chúng tôi đã cố gắng hoàn thiện phương pháp để có thể tách chiết được mẫu với lượng DNA chủ yếu từ khu hệ vi sinh ruột mối Để làm được vi c này chúng tôi có thay đổi về phương pháp tách chiết DNA từ ruột mối, cụ thể là ruột mối sau khi thu không... thời với hệ vi sinh vật trong trong ruột phong phú để phân giải được các vật chất hữu cơ có nguồn gốc hemicellulose mà mối ăn vào [22] Trong tổ mối ta gặp nhiều nhất là mối thợ và mối lính, đặc điểm phân biệt chúng là mối lính có đầu đen, mình thuôn nhọn còn mối thợ thì đầu thường trắng hơn và mình tròn hơn [22] (Hình 1.1) Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi dùng một phương pháp để thu mẫu ruột mối đó... khuếch đại gen từ khuôn là metagenomic DNA của vi sinh vật được phân tách theo phương pháp tách DNA genome vi khuẩn của Sambrook 3.2 Phân tích sơ bộ kết quả giải trình tự metagenome Giải trình tự genomes của hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối được thực hiện theo phương pháp metagenomics sequencing như sau: Hệ genome đã được tinh sạch được giải trình tự toàn bộ bằng hệ thống máy giải trình tự Illumina’s... M 1 2 Hình 3.4: DNA metagenome tách từ hệ vi sinh vật ruột mối theo phương pháp kết hợp dùng CTAB và kit tinh sạch trên gel agarose 1: DNA metagenome vi sinh vật ruột mối tách theo phương pháp sử dụng PAC 2: DNA metagenome vi sinh vật ruột mối tách theo phương không dùng PAC, sử dụng kit tinh sạch DNA M: Thang chuẩn DNA 1 kb Nguyễn Thu Phương 27 Lớp K35C – Sinh Mặc dù DNA metagenome được tách chiết... tiếp đó là alpha-N-arabinofuranosidase chiếm tỉ lệ 26,64% Sau khi kết thúc quá trình xử lý, phân tích dữ liệu, chúng tôi đã khai thác được các gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối C gestroi (Bảng 3): Nguyễn Thu Phương 36 Lớp K35C – Sinh ... hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối C gestroi (Bảng 3): Nguyễn Thu Phương 36 Lớp K35C – Sinh Bảng 3: Các gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối C gestroi. .. ý nghĩa lớn Do đó, vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối cần thiết Trong nghiên cứu này, DNA metagenome sinh vật ruột mối tách chiết tinh... metagenome giải trình tự so sánh trình tự gen với trình tự gen ngân hàng quốc tế từ khai thác gen Để nghiên cứu vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh