ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI E. COLI VÀ COLIFORMS BẰNG MÀNG PETRIFILM TRÊN MẪU HẢI SẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI E COLI VÀ COLIFORMS BẰNG MÀNG PETRIFILM TRÊN MẪU HẢI SẢN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ NGHĨA Khóa học : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI E COLI VÀ COLIFORMS BẰNG MÀNG PETRIFILM TRÊN MẪU HẢI SẢN Hướng dẫn khoa học TS NGUYỄN TIẾN DŨNG Tháng 07/2012 Sinh viên thực NGUYỄN THỊ NGHĨA LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường - Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh cho phép tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ có điều kiện làm nghiên cứu tốt Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Tiến Dũng, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu khoa học Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học quan tâm, tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Xin chân thành cảm ơn đến thầy tận tình bảo truyền lại kiến thức, kinh nghiệm quí giá lĩnh vực công nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn công ty 3M hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi nghiên cứu đề tài Và cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tơi, người thân gia đình tơi, người nuôi dưỡng, âm thầm theo dõi, động viên giúp đỡ tơi hồn thành tốt năm đại học Bên cạnh tơi nhận nhiều giúp đỡ, cổ vũ, động viên bạn tập thể lớp DH08SH bạn Nguyễn Thị Hồng Trâm gắn bó tơi suốt đề tài cho tơi có động lực để vượt qua lúc khó khăn Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Nghĩa i TÓM TẮT Mục tiêu đề tài đánh giá hiệu lực quy trình phân tích đồng thời E coli Coliforms màng Petrifilm EC sản xuất công ty 3M – Mỹ Các chủng vi sinh vật dùng cho việc đánh giá phân lập từ mẫu cá thương phẩm chợ địa bàn quận Thủ Đức - Tp Hồ Chí Minh Việc đánh giá hiệu lực thực theo hướng dẫn tiêu chuẩn ISO 16140:2003 Mười hai chủng Coliforms nhiễm tự nhiên mẫu thủy sản phân lập để sử dụng cho trình đánh giá Quá trình phân lập định danh thực theo quy trình ISO 3832:2006 Độ đặc hiệu phương pháp phân tích Coliforms thực phẩm phương pháp sử dụng màng Petrifilm đánh giá Quá trình tiến hành với 12 chủng Coliforms phân lập Kết đánh giá cho thấy nuôi cấy khoảng 24 giờ, dòng Coliforms khơng thuộc lồi E coli nuôi cấy trên màng Petrifilm EC có khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, bên cạnh khuẩn lạc có bọt khí, chủng thuộc lồi E coli có khuẩn lạc màu xanh, có bọt khí bên cạnh Tất dòng Coliforms khảo sát cho kết phù hợp với đặc điểm mô tả nhà sản xuất Quá trình đánh giá xác định giới hạn phát (LOD) phương pháp dùng màng Petrifilm EC phân tích mẫu thủy sản CFU/g, với độ tin cậy 95% giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 12 CFU/g Trong phương pháp ISO 4832:2006, sử dụng môi trường VRB ( Violet red bile agar) LOD 12 CFU/g LOQ 36 CFU/g Kết chứng tỏ phương pháp sử dụng màng Petrifilm EC có độ nhạy phát cao so với phương pháp sử dụng môi trường VRB agar Độ xác phương pháp đánh giá thông qua độ lặp lại Kết đánh giá cho thấy độ lặp lại phương pháp sử dụng màng Petrifilm EC tốt so với phương pháo nuôi cấy môi trường VRB agar Đề tài thử nghiệm phân tích 20 mẫu thủy sản đồng thời phương pháp sử dụng màng Petrifilm EC phương pháp theo hướng dẫn ISO 3832:2006 Kết cho thấy khả định lượng Coliforms hai phương pháp tương đương ii SUMMARY The objective of the research was to assess the effectiveness of the analysis E coli and Coliforms on the same Petrifilm EC plate was manufactured by 3M Company - United States The microorganisms used for the evaluation was isolated from samples of commercial fish in the markets in Thu Duc district – Ho Chi Minh city The effective assessment was made under the guidance in ISO 16140:2003 Isolated 12 strains of Coliforms in naturally infected fish samples were use for the evaluation process The process of isolation and identification shall comply with the process of ISO 3832:2006 Evaluated the specificity of analytical methods Coliforms in part by method using Petrifilm plate The process was conducted with 12 strains of Coliforms have been isolated as above Evaluation results show that when grown in about 24 hours, Coliforms no streams of the species E coli when cultured on Petrifilm EC plate colonies red to deep red, next to gas bubbles colonies, the strains of the species E coli colonies blue, bubble side All of the Coliforms used in this study showed the same characteristics were all the survey results in accordance described by the manufacturer The evaluation process also identified the limit of detection (LOD) of the Petrifilm EC plate method used when analyzing the sample of fish is CFU / g, with 95% confidence level the limit of quantitation (LOQ) of this method is 12 CFU/g Meanwhile, for the ISO 4832:2006 method, using VRB (Violet red bile agar) medium, the LOD was 12 CFU/g and the LOQ was 36 CFU/g This result demonstrates how to use Petrifilm EC plate sensitive detection method than using VRB agar medium The accuracy of the method was essessed through the repeatability The assessment results also showed that the repeatability of the method using Petrifilm EC plate was better than the method culture on VRB agar medium Project also analyzed 20 aquatic delirium samples simultaneously using the method of Petrifilm EC plate and the method following guidance from of ISO 3832:2006 The results showed the ability Coliforms quantitation of the two methods are equivalent iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1 Yêu cầu 1.2 Nội dung Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Coliforms/E coli 2.1.1.Tổng quan Coliforms 2.1.2 Tổng quan E coli 2.1.2.1 Lịch sử 2.1.2.2 Phân loại 2.1.2.3 Đặc điểm hình dạng, ni cấy tính chất sinh hóa tltk 2.2 Các phương pháp phát E coli/ Coliforms 2.2.1 Phương pháp truyền thống 2.2.2 Phương pháp dùng màng Petrifilm 2.3 Tổng quan thẩm định phương pháp 10 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.2 Vật liệu 12 3.2.1.Dụng cụ thiết bị 12 3.2.1.1 Dụng cụ 12 3.2.1.2 Thiết bị 12 3.2.2 Hố chất mơi trường .12 iv 3.2.2.1 Hoá chất 12 3.2.3.2 Môi trường 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 3.3.1 Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân 13 3.3.2 Phương pháp phân lập 13 3.3.3 Phương pháp xác định độ đặc hiệu 15 3.3.4 Phương pháp xác định giới hạn định lượng dịch khuẩn pha loãng mẫu gây nhiễm .16 3.3.5 Phương pháp xác định độ lặp lại 18 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết phân lập chủng Coliforms 21 4.2 Kết xác định độ đặc hiệu 23 4.3 Kết xác định giới hạn định lượng 27 4.3.1 Xác định giới hạn định lượng dịch khuẩn pha loãng .27 4.3.2 xác định giới hạn định lượng mẫu gây nhiễm 31 4.4 Kết xác định độ lặp lại 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI : Brain Heart Infusion Broth BGBL : Brilliant Green Bile Lactose Salt EC : Escherichia coli Broth EMB : Eozin Methyl Blue LSB : Lauryl Sulfate Broth MR-VP : Methyl Red – Voges Proskauer NA : Nutrient agar IMViC : Indol, Methyl red, Voges Proskauer, Citrate SPW : Saline Peptone Water TSA : Tryptic Soy Agar VRB : Violet Red Bile E coli : Escherichia coli CFU : Colony forming unit LC : CriticalLevel LOQ : Limit of Quantification LOD : Limit of Detection VSV : vi sinh vật SS : Salmonella-Shigella p–DMABA : p – Dimethylaminobenzaldehyde MPN : Most Probable Number PF : Petrifilm AOAC : Association of Official Analytical Chemists BAM : Bacteriological Analytical Manual FDA : Food and Drug Administration U.S : United States vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Biểu sinh hóa chủng Coliforms Bảng 2.2 Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp vi sinh vật 11 Bảng 4.1 Biểu sinh hóa chủng Coliforms 21 Bảng 4.2 Mô tả khuẩn lạc màng Petrifilm EC môi trường VRB 24 Bảng 4.3 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích màng Petrifilm EC 27 Bảng 4.4 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích môi trường VRB 28 Bảng 4.5 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích màng Petrifilm EC 31 Bảng 4.6 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích mơi trường VRB 31 Bảng 4.7 Xác định độ lặp lại mẫu cá ngừ 34 Bảng 4.8 Kết phân tích mẫu màng Petrifilm EC môi trường VRB 34 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Coliforms bắt màu xanh kính hiển vi điện tử Hình 2.2 E coli bắt màu hồng kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Hệ thống MPN/g(ml) nồng độ pha loãng liên tiếp Hình 2.4 Cách sử dụng hệ thống Petrifilm 3M Microbiology 10 Hình 3.1 Phương pháp pha lỗng theo dãy thập phân 13 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chủng Coliforms 15 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chủng Coliforms 16 Hình 3.4 Sơ đồ xác định giới hạn định lượng/giới hạn phát mẫu dịch khuẩn pha loãng 18 Hình 3.5 Sơ đồ xác định độ tái lập độ lặp lại 19 Hình 3.6 Sơ đồ phân tích mẫu 20 Hình 4.1 Kết biểu sinh hóa E coli test IMiVC 22 Hình 4.2 Kết biểu sinh hóa Enterobacter test IMiVC 22 Hình 4.3 Kết biểu sinh hóa Citrobacter test IMiVC 23 Hình 4.4 Kết biểu sinh hóa Klebsiella test IMiVC 23 Hình 4.5 Chủng K1 VRB màng Petrifilm EC 25 Hình 4.6 Chủng En6 VRB màng Petrifilm EC 25 Hình 4.7 Chủng C1 VRB màng Petrifilm EC 26 Hình 4.8 Chủng E2 VRB màng Petrifilm EC 26 Hình 4.9 Khuẩn lạc chủng En6 màng Petrifilm mơi trường VRB 30 Hình 4.10 Khuẩn lạc chủng E2 màng Petrifilm 33 Hình 4.11 Khuẩn lạc chủng E2 môi trường VRB 33 viii Bảng 4.4 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích mơi trường VRB Chủng Coliforms En6 E2 Giá trị tới hạn ước lượng LC (CFU/ml) 6 Giá trị ngưỡng S0 (CFU/ml) 3,63 3,63 Giới hạn phát LOD (CFU/ml) 12 12 Giới hạn định lượng (CFU/ml) 36 36 Trên màng Petrifilm EC, với tiêu chí chọn mật độ phát theo hướng dẫn ISO 16140:2003, qua bảng 4.3 màng Petrifilm EC với chủng En6 mật độ gây nhiễm cho khả phát tương ứng tỉ lệ 2/6 3/6 CFU/ml, với chủng E2 CFU/ml Do mật độ gây nhiễm phù hợp để phát E coli CFU/ml để phát Enterobater CFU/ml Từ kết tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp màng Petrifilm tính tốn theo bảng 4.3 Ước tính mức độ dương tính xấp xỉ 50% chủng En6 (CFU/ml), chủng E2 (CFU/ml) Trên màng cấy mật độ ngưỡng tới hạn LC hai chủng khác dẫn đến giá trị giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ hai chủng phân tích khác đáng kể, dựa vào bảng 4.3 chủng En6 có giá trị LOD CFU/ml, LOQ 12 CFU/ml, chủng E2 có LOD 12 CFU/ml, LOQ 36 CFU/ml Sự khác nhau mơi trường đơng khơ màng Petrifilm EC ảnh hưởng khác đến khả tăng sinh chủng Coliforms khác Tương tự môi trường VRB, với hai chủng En6 E2 mật độ gây nhiễm cho tỉ lệ phát tương ứng 2/6 3/6 CFU/ml Do mật độ gây nhiễm phù hợp với hai chủng En6 E2 CFU/ml Kết tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp phân tích mơi trường VRB trình bày bảng 4.4 Theo bảng 4.4 ước tính mức độ dương tính xấp xỉ 50% hai chủng E2 En6 (CFU/ml) Ngưỡng tới hạn LC, giới hạn phát LOD , giới hạn định lượng LOQ hai chủng phân tích giống có giá trị LOD = 12 CFU/ml, LOQ = 36 CFU/ml , điều ảnh hưởng môi trường nuôi cấy VRB chủng chủng Coliforms khác 28 Tuy nhiên giá trị LC, LOD, LOQ phương pháp phân tích màng Petrifilm phương pháp phân tích truyền thống có chênh lệch chủng En6 theo bảng 4.3 4.4 Sự chênh lệch mơi trường phương pháp phân tích truyền thống có chất ức chế lại phát triển vi sinh vật, q trình cấy có xâm nhiễm số vi sinh vật khác cạnh tranh với chủng gốc Ở phương pháp phân tích màng Petrifilm q trình cấy nhanh, bị ảnh hưởng yếu tố bên ngồi, mơi trường chọn lọc đặc hiệu với chủng Coliforms nên khả định lượng cao môi trường dễ dàng nhận biết diện chủng E coli chủng Coliforms khác dựa vào khả sinh màu sắc đặc trưng màng Petrifilm, có lẫp tạp chủng vi sinh vật khác dễ phát Ở phương pháp phân tích truyền thống mơi trường VRB, q trình thử nghiệm phải qua nhiều giai đoạn, dễ bị ảnh hưởng yếu tố bên ngồi, màu sắc chủng Coliforms mơi trường VRB tương tự gần với màu môi trường nên khó nhận biết bị tạp nhiễm Qua nhận định kết hai bảng 4.3 4.4 khảo sát hai chủng En6, E2 tiến hành song song môi trường VRB dùng phương pháp truyền thống màng Petrifilm EC phương pháp phân tích màng Petrifilm EC có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thấp nghĩa khả phát khả định lượng phương pháp mật độ vi sinh vật thấp cao hơn, cho kết phân tích cao đáng tin cậy 29 Hình 4.9 Khuẩn lạc chủng En6 màng Petrifilm môi trường VRB (1) – (4): màng Petrifilm, (5) – (8): môi trường VRB 30 4.3.2 Xác định giới hạn định lượng mẫu gây nhiễm Thí nghiệm tiến hành khảo sát loại mẫu: cá ngừ tươi Trước gây nhiễm, mẫu kiểm tra khẳng định mẫu trắng tức khơng bị nhiễm chủng Coliforms Qua q trình khảo sát trước phân tích thức, chọn mật độ gây nhiễm thích hợp tỷ lệ phát mong muốn 30 CFU, 60 CFU, 200 CFU Việc gây nhiễm thực vào 10 g mẫu loại pha loãng Từ kết phụ lục bảng 2, chọn mật độ vi sinh vật phù hợp tính tốn giá trị theo bảng 4.5 4.6 Bảng 4.5 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích màng Petrifilm EC Chủng Coliforms En6 E2 Giá trị tới hạn ước lượng LC (CFU/10 g) 30 30 Giá trị ngưỡng S0 (CFU/10 g) 18,2 18,2 Giới hạn phát LOD (CFU/g) 6 Giới hạn định lượng (CFU/g) 20 20 Bảng 4.6 Kết giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích mơi trường VRB Chủng Coliforms En6 E2 Giá trị tới hạn ước lượng LC (CFU/10 g) 60 60 Giá trị ngưỡng S0 (CFU/10 g) 36,3 36,3 Giới hạn phát LOD (CFU/g) 12 12 Giới hạn định lượng (CFU/g) 36 36 Trên màng Petrifilm EC, qua bảng 4.5 ước tính mức độ dương tính xấp xỉ 50% chủng En6 chủng E2 30 CFU/10 g Kết khảo sát cho thấy loại mẫu đem phân tích có ảnh hưởng đến tốc độ phát triển chủng E2 màng Petrifilm EC, dịch khuẩn pha lỗng ngưỡng tới hạn LC chủng E2 thấp so với chủng En6 Do giá trị LC, LOD, LOQ khảo sát thí nghiệm cho kết phân tích cao Mặc khác điều kiện mơi trường mẫu không phù hợp với phát triển chủa chủng En6, bên cạnh mẫu có số vi sinh vật khác mẫu gây nhiễm ức chế lại chủng En6 31 Trên môi trường VRB, bảng 4.8 ước tính mức độ dương tính xấp xỉ 50% chủng En6 E2 60 CFU/10 g Trong phương pháp loại mẫu ảnh hưởng nhiều đến kết phân tích Qua bảng 4.5 cho thấy giới hạn phát hai chủng En6 E2 phân tích màng Petrifilm EC CFU đạt yêu cầu kỹ thuật phương pháp định lượng (≤ 10 CFU/g (ml)), giới hạn phát hai chủng En6 E2 môi trường VRB 12 CFU Như phương pháp truyền thống không đáp ứng độ tin cậy kỹ thuật phương pháp định lượng, khả cho kết khơng xác cao Các giá trị LC, LOD, LOQ hai bảng 4.5 4.6 hai chủng En6 E2 phân tích phương pháp giống nhau, giới hạn định lượng loại mẫu cá ngừ màng Petrifilm EC 20 CFU/g, phương pháp truyền thống 36 CFU/g nhỏ mức cho phép mặt hàng thủy sản có gia nhiệt trước sử, theo định 2670/QĐ-BNN-QLCL, 100 CFU/ g Như vậy, áp dụng hai phương pháp để phân tíchcho loại nềnmẫu cá ngừ Tuy nhiên qua kết khảo sát bảng 4.5 thông số kỹ thuật thu màng Petrifilm EC điều kiện phân tích, mẫu màng Petrifilm EC cho kết phân tích tốt hơn, đáng tin cậy, thời gian phân tích nhanh đáng kể so với phương pháp truyền thống Ở hai bảng 4.5 4.6 Các giá trị LC, LOD, LOQ phương pháp phân tích màng Petrifilm EC phương pháp phân tích truyền thống có chênh lệch đáng kể, màng Petrifilm ngưỡng tới hạn LC 30 CFU/10 g mơi trường VRB 60 CFU/10 g Nguyên nhân mơi trường phương pháp phân tích truyền thống chứa chất ức chế lại phát triển vi sinh vật, q trình cấy có xâm nhiễm số vi sinh vật khác cạnh tranh với chủng gốc Ở phương pháp phân tích màng Petrifilm q trình cấy nhanh, bị ảnh hưởng yếu tố bên ngồi, mơi trường chọn lọc đặc hiệu với chủng Coliforms E coli nên khả định lượng cao Màng Petrifilm EC, dịch khuẩn pha loãng giá trị LC, LOD, LOQ cho kết phân tích tốt mẫu gây nhiễm theo kết khảo sát bảng 4.5 4.6, nguyên nhân bị ảnh hưởng mẫu Trên môi trường VRB, hai chủng En6 E2 đem phân tích khơng bị ảnh hưởng mẫu nên giá trị LC, LOD, LOQ có khác biệt qua bảng 4.5 4.6 32 Như mẫu gây nhiễm dịch khuẩn pha loãng khả phát định lượng màng Petrifim EC cao môi trường VRB nghĩa giới hạn phát giới hạn định lượng cao So sánh hai phương pháp màng Petrifilm EC cho kết xác độ tin cậy cao đáng kể Hình 4.10 Khuẩn lạc chủng E2 màng Petrifilm Hình 4.11 Khuẩn lạc chủng E2 môi trường VRB 33 4.4 Kết xác định độ lặp lại Độ lặp lại thực phân tích mẫu khác loại mẫu cá ngừ, thực lặp lại lần mẫu, điều kiện làm việc Từ kết phụ lục bảng 3, tính tốn giá trị theo bảng 4.7 Bảng 4.7 Xác định độ lặp lại mẫu cá ngừ Sr SrPF SrVRB Mẫu Petrifilm VRB 1,141 1,049 0,297 0,326 0,185 0,224 Mẫu Petrifilm VRB 1,465 1,413 0,053 0,038 Mẫu Petrifilm VRB 0,785 0,688 0,113 0,208 Qua mẫu phân tích cho kết bảng 4.7 mẫu màng Petrifilm cho số lặp lại tốt so với môi trường VRB Mặc dù phân tích mẫu song song hai phương pháp điều kiện thí nghiệm màng Petrifilm EC cho kết tốt hơn, có độ tin cậy cao dùng phân tích hai tiêu E coli Coliforms Sự khác biệt thành phần môi trường, tao tác chuẩn bị cấy màng Petrifilm môi trường VRB, màng Petrifilm thao tác thực nhanh nên khả bị nhiễm vi sinh vật khác từ môi trường xung quanh thấp, giảm khả cạnh tranh ức chế từ vi sinh vật 4.5 Kết phân tích mẫu Phân tích song song 20 mẫu cá ngừ môi trường VRB màng Petrifilm EC nồng độ pha loãng 10-2, đếm số khuẩn lạc xuất đĩa Bảng 4.8 Kết phân tích mẫu màng Petrifilm EC mơi trường VRB Số mẫu phân tích 10 Số khuẩn lạc đếm 10-2 VRB Petrifilm 27 34 39 45 26 30 23 30 17 26 20 35 27 30 37 48 14 19 18 31 34 Bảng 4.8 Kết phân tích mẫu màng Petrifilm EC môi trường VRB 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 16 18 19 16 16 15 14 22 27 24 18 31 31 21 28 24 21 28 35 28 Qua bảng 4.8 kết phân tích mẫu, nhận thấy môi trường VRB số lượng khuẩn lạc đếm nhỏ màng Petrifilm Như nhận định mơi trường đơng khơ màng Petrifilm EC có tính đặc hiệu chọn lọc cao với chủng Coliforms Mặc khác màng Petrifilm phân tích đồng thời E coli Coliforms dễ dàng nhận biết xuất E coli chủng Coliforms khác mẫu đem phân tích dựa vào màu sắc khả sinh hơi, mơi trường VRB dựa vào hình dạng khuẩn lạc có màu đỏ đến màu đỏ đậm có đường kính lớn 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật để đếm nên khả nhầm lẫn với vi sinh vật khác cao màu sắc vi sinh vật màu môi trường giống nên khó phân biệt, khơng đủ độ tin cậy để đánh giá thực phẩm đem phân tích có mức độ an tồn hay khơng Tuy nhiên thí nghiệm khơng thực lặp lại nên kết luận khả định lượng hai phương pháp tương đương 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình đánh giá hiệu lực qui trình phân tích đồng thời E coli Coliforms mẫu hải sản màng Petrifilm có số kết luận sau: Về độ đặc hiệu, màng Petrifilm EC chủng E coli cho khuẩn lạc màu xanh sinh nhiều, chủng Coliforms cho khuẩn lạc màu đỏ sinh nhiều hay tùy chủng khác Trên môi trường VRB chủng E coli Coliforms cho khuẩn lạc màu đỏ có đường kính từ 0,4 – mm Giới hạn phát định lượng, qua thí nghiệm thực dịnh khuẩn pha loãng mẫu gây nhiễm màng Petrifilm cho kết phân tích tốt so với môi trường VRB Độ lặp lại, qua ba mẫu phân tích thực lần lặp lại mẫu màng Petrifilm cho tính ổn định cao so với môi trường VRB Ứng dụng phương pháp màng Petrifilm đánh giá vào phân tích 20 mẫu cá ngừ khả định lượng hai phương pháp phân tích tương đương Màng Petrifilm EC cho kết phân tích cao đáng tin cậy 5.2 Đề nghị Do giới hạn thời gian làm đề tài nên số tiêu chí đánh giá phương pháp chưa thực Vì để đảm bảo tính xác cao thực đánh giá phương pháp màng Petrifilm EC, có đề nghị cho nghiên cứu sau: Khảo sát tiêu chí khác đánh giá phương pháp như: độ không đảm bảo đo, độ đúng, độ xác phương pháp Xác định thơng số kỹ thuật phương pháp nhiều chủng thu nhận từ nhiều nguồn khác nhiều mẫu khác tôm, mực v.v Dựa nội dung phân tích kết phân tích màng Petrifilm có độ tin cậy xác cao, khuyến cáo sử dụng màng Petrifilm EC để phân tích, đánh giá tiêu mẫu thực phẩm 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Dũng, 2007 Bài giảng “Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm” Trường đại học Khoa học Tự nhiên T.p Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan, 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà Xuất Nông Nghiệp Trần Cao sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thành Trung,2010 Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Lê Xuân Phương, 2007 Bài giảng “Thí nghiệm vi sinh vật học” Đồn Ngọc Tuấn, 2006 Khảo sát tình hình nhiễm E coli Coliforms nước uống, nước có gas, nước có cồn địa bàn quận Thủ Đức Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Lương Đức Phẩm, 2002 Vi sinh vật học an tồn vệ sinh thực phẩm Nhà xuất Nơng Nghiệp – Hà Nội Lê Đình Hùng,1998 Đại cương phương pháp kiểm tra vi sinh vật thực phẩm Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng khu vực III, Tp HCM Lê Việt Mẫn Lại Mai Hương, 2006 Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm Nhà xuất Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh Tiếng nước Ludwig Huber 2007, Validation and Qualification in Analytical Laboratories, InformaHealthcare, London 10 ISO 16140 2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods 11 Ronald M Atlat 2006 Handbook of Microbiologycal Media Handbook of Microbiologycal Media for Examination of Food Ronald M Atlat, Taylor and Francis Group CRC Press, London, pp: 235 -247 12 Sussman 1985 The Virulence of E Coli 37 13 Schraft H, Watterworth LA 2005 J Microbiol Methods In : Enumeration of heterotrophs, fecal Coliforms and Escherichia coli in water: comparison of 3M™ Petrifilm™ plates with standard plating procedures 60:335-342 Tài liệu từ internet 14 Nguyễn Tiến Dũng Hướng dẫn duyệt phương pháp phân tích vi sinh vật 2011 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/huong-dan-phe-duyet-phuong-phap-phan-tichvi-sinh.505424.html 16/05/2012 15 Acta Veterinaria Scandinavica 2008 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/bao-caokhoa-hoc-evaluation-of-Petrifilm-select-e-coli-count-plate-medium-todiscriminate-antim.913797.html 25/06/2012 38 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỂ NUÔI CẤY, PHÂN LẬP CHỦNG COLIFORMS/E COLI - Thuốc thử Kovac’s - Thuốc thử methyl red Isoamyl alcohol 150 ml Methyl red 0,1 g P – Dimethylaminobenzaldehyde Ethanol 95% 300 ml (p–DMABA) 10 g HCl đậm đặc 50 ml Nước cất 500 ml Cách pha thuốc thử Kovac’s: hòa tan p–DMABA dung mơi, bổ sung khuấy phần nhỏ HCl đủ lượng Thuốc thử chứa chai màu tối tránh ánh sáng 40C Có thể thay isoamyl alcohol amyl alcohol butanol Cách pha thuốc thử methyl red: hòa tan methyl red vào 300ml ethanol Thêm nước cất vào cho đủ thể tích 500 ml - Dung dịch – naphthol: Naphthol g, Acetic acid 5N 200 ml Cách pha: chuẩn bị acid acetic 5N cách cho 28,75 ml acid glacial acetic vào 71,25 ml nước cất vô trùng Trữ dung dịch chai thủy tinh màu tối - Dung dịch SPW - Môi trường EMB Pepton g/l Pepton 10 g/l Nacl 8,5 g/l Lactose g/l pH 7,0±0,2 Sucrose g/l - Môi trường TSA K2HPO4 g/l Trypticase peptone 15 g Eosin 0,4 g/l Phytone peptone g Methylen blue 0,065 g/l NaCl g Agar 13,5 g/l Agar 15 g pH 7,2±0,2 pH 7,3±0,2 - Môi trường MR – VP Broth - Môi trường canh Trypton Glucose g Peptone 10 g K2HPO4 g NaCl g Buffered peptone water - Môi trường Simmons Citrate Agar (Difco BBL) g Sodium citrate g Nước cất lít NaCl g - Môi trường VRB K2HPO4 g Dịch từ tim bò 250 g/l NH4H2PO4 g Dịch từ não dê 200 g/l MgSO4 0,2 g Proteose pepton sodium chloride 10 g/l Bromothymol blue 0,08 g Sodium chloride g/l Agar 15 g Dim – sodium phosphate 2,5 g/l Nước cất lít Dextrose g/l pH 6,8±0,2 pH 7,4±0,2 Nước cất lít - Mơi trường BHI Cao nấm men g/l Pepton g/l NaCl g/l Muối mật 1,5 g/l Lactose 10 g/l Neutral red 0,03 g/l Crystal violet 0,002 g/l Agar 18 g/l Nước cất lít Bảng Kết phát LC dịch khuẩn pha loãng Chủng Coliforms En6 E2 Lần lặp lại Tỷ lệ phát Coliforms mật độ khác CFU/ml CFU/ml 30 CFUml PF VRB PF VRB PF VRB 3/6 1/6 4/6 4/6 6/6 6/6 2/6 0/6 4/6 4/6 6/6 6/6 2/6 0/6 3/6 3/6 6/6 6/6 1/6 1/6 3/6 4/6 6/6 6/6 2/6 0/6 3/6 3/6 6/6 6/6 0/6 0/6 2/6 2/6 6/6 6/6 Bảng Kết phát LC mẫu gây nhiễm Chủng Coliforms En6 E2 Lần lặp lại Tỷ lệ phát Coliforms mật độ gây nhiễm khác 30 CFU 60 CFU 200 CFU PF VRB PF VRB PF VRB 2/6 0/6 3/6 2/6 6/6 6/6 2/6 0/6 4/6 3/6 6/6 6/6 3/6 1/6 4/6 3/6 6/6 6/6 3/6 0/6 5/6 3/6 6/6 6/6 2/6 0/6 4/6 1/6 6/6 6/6 1/6 0/6 3/6 2/6 6/6 6/6 Bảng Kết đếm khuẩn lạc xác định độ lặp lại mẫu cá ngừ Stt Mẫu Mẫu Mẫu Petrifilm VRB Petrifilm VRB Petrifilm VRB 12 27 24 51 49 35 30 11 12 11 30 28 4 12 10 32 25 5 31 27 16 13 26 24 14 10 25 24 6 ... quantitation (LOQ) of this method is 12 CFU/g Meanwhile, for the ISO 4832:2006 method, using VRB (Violet red bile agar) medium, the LOD was 12 CFU/g and the LOQ was 36 CFU/g This result demonstrates... nghiên cứu 12 3.2 Vật liệu 12 3.2.1.Dụng cụ thi t bị 12 3.2.1.1 Dụng cụ 12 3.2.1.2 Thi t bị 12 3.2.2 Hố chất mơi trường .12... colonies, the strains of the species E coli colonies blue, bubble side All of the Coliforms used in this study showed the same characteristics were all the survey results in accordance described by