Sàng lọc hoạt tính enzyme cellulase của vi nấm phân lập từ nước biển ven bờ thuộc tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI NẤM PHÂN LẬP TỪ NƯỚC BIỂN VEN BỜ THUỘC TỈNH KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thu Thủy Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Lộc Mã số sinh viên: 57131647 Khánh Hòa – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI NẤM PHÂN LẬP TỪ NƯỚC BIỂN VEN BỜ THUỘC TỈNH KHÁNH HÒA GVHD: TS Phạm Thu Thủy SVTH: Lê Thị Hồng Lộc MSSV: 57131647 Khánh Hòa – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Sàng lọc hoạt tính enzyme cellulase vi nấm phân lập từ nước biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hòa” trình bày luận văn hồn tồn trung thực, khách quan Kết phần đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hòa dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thủy chủ nhiệm đề tài Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn xác rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày…tháng…năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Hồng Lộc I LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực luận văn, tơi ln nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp này, xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp đại học Đ c biệt, tơi xin bày t lịng biết ơn sâu s c đến giáo viên hư ng dẫn TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang trực tiếp hư ng dẫn, giúp đỡ truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm qu báu suốt trình thực luận văn Tôi c ng g i lời cảm ơn chân thành t i PGS TS Nguyễn Văn Duy toàn thể Qu thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học Bộ mơn Sinh học tận tình giúp đỡ Đ c biệt cảm ơn chị Trần Thị Châu Loan, anh Phạm Bảo Khoa chị Huỳnh Thị Bích Mai, c ng bạn Nhóm Nghiên cứu Vi sinh đồng hành giúp đỡ suốt q trình thực luận văn Tơi ln biết ơn gia đình, bạn bè động viên hỗ trợ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày…tháng…năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Hồng Lộc II MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ VII DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT X PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi nấm biển 1.1.1 Tổng quan nấm mốc .3 1.1.1.1 Đ c điểm hình thái cấu tạo nấm mốc 1.1.1.2 Sinh trưởng dinh dưỡng nấm mốc 1.1.1.3 Sinh sản nấm mốc 1.1.2 Tổng quan nấm men .6 1.1.2.1 Đ c điểm hình thái cấu tạo tế bào nấm men .6 1.1.2.2 Sinh trưởng dinh dưỡng nấm men 1.1.2.3 Sinh sản nấm men 1.1.3 Khả sinh hoạt chất sinh học vi nấm 1.2 Tổng quan enzyme cellulase 1.2.1 Gi i thiệu enzyme cellulase 1.2.2 Đ c điểm chế tác dụng enzyme cellulase .10 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme cellulase 11 1.2.3.1 Nồng độ enzyme 11 1.2.3.2 Nồng độ chất 11 1.2.3.3 Nhiệt độ 12 III 1.2.3.4 pH 13 1.2.3.5 Ion kim loại 13 1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme cellulase 14 1.2.4.1 Thực vật động vật 14 1.2.4.2 Vi sinh vật .14 1.2.5 Một số ứng dụng cellulase 16 1.2.5.1 Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 16 1.2.5.2 Trong công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học 17 1.2.5.3 Trong kỹ thuật di truyền .17 1.2.5.4 Trong x l môi trường 17 1.2.6 Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase từ vi sinh vật biển 17 1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase gi i 18 1.2.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase Việt Nam 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.2 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng .21 2.3 Hóa chất 22 2.4 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 26 2.5 Bố trí thí nghiệm phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme CMCase chủng VN15M 26 IV 2.5.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon đến trình sinh tổng hợp enzyme CMCase chủng VN15M 27 2.5.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến trình sinh tổng hợp enzyme CMCase chủng VN15M 28 2.5.4 Phương pháp hoạt hóa, ni cấy bảo quản chủng vi nấm 30 2.5.4.1 Hoạt hóa chủng vi nấm 30 2.5.4.2 Nuôi l ng chủng vi nấm thu dịch enzyme thô .30 2.5.4.3 Bảo quản chủng vi nấm 30 2.5.5 Phương pháp xác định vòng phân giải chất .30 2.5.6 Nhuộm đơn quan sát hình thái tế bào vi nấm 31 2.5.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme CMCase 31 2.5.8 Phương pháp x lí số liệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Sàng lọc hoạt tính CMCase chủng vi nấm biển 35 3.2 Hình thái khuẩn lạc, tế bào chủng vi nấm có hoạt tính CMCase mạnh .37 3.3 Xác định hoạt độ chủng có hoạt tính CMCase mạnh 39 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến q trình sinh tổng hợp CMCase chủng VN15M 40 3.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon đến trình sinh tổng hợp CMCase chủng VN15M 42 3.6 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến trình sinh tổng hợp CMCase chủng VN15M 44 3.7 So sánh hoạt độ CMCase chủng VN15M v i enzyme vi khuẩn enzyme thương mại 46 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC VI DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hệ sợi nấm mốc có khơng có vách ngăn Hình 1.2 Các hình thái tế bào khác Candida albicans Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose hệ enzyme cellulase 10 Hình 1.4 Trichoderma sp dùng cho sản xuất cellulase thương mại 15 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu 26 Hình 2.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ ni cấy chủng VN15M 27 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon chủng VN15M 28 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ chủng VN15M 29 Hình 2.5 Phản ứng thuốc th DNS 32 Hình 3.1 Kết vòng phân giải chất chủng VN15M, DW7M, HMB7M 37 Hình 3.2 Đ c điểm hình thái khuẩn lạc sợi nấm chủng VN15M 37 Hình 3.3 Đ c điểm hình thái khuẩn lạc sợi nấm chủng DW7M 38 Hình 3.4 Đ c điểm hình thái khuẩn lạc tế bào nấm men HMB7Y 39 Hình 3.5 Hoạt độ CMCase chủng vi nấm qua sàng lọc 40 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả phân giải chất CMC chủng VN15M 41 Hình 3.7 Khảo sát tối ưu nhiệt độ nuôi cấy chủng VN15M 42 Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả phân giải chất CMC chủng VN15M 43 Hình 3.9 Khảo sát tối ưu nguồn cacbon chủng VN15M 43 Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn nitơ vơ đến khả phân giải chất CMC chủng VN15M 45 VII Hình 3.11 Khảo sát tối ưu nguồn nitơ vô chủng VN15M 45 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu đến khả phân giải chất CMC chủng VN15M 46 Hình 3.13 Khảo sát tối ưu nguồn nitơ hữu chủng VN15M 46 Hình 3.14 Vịng phân giải chất CMC chủng VN15M, HCR1 enzyme LEAFCELL 47 Hình 3.15 Hoạt độ CMCase VN15M, HCR1 enzyme LEAFCELL 47 VIII KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau sàng lọc hoạt tính CMCase 86 chủng vi nấm biển từ sưu tập vi nấm biển Nhóm Nghiên cứu Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, chọn 20 chủng có hoạt tính phân giải chất CMC, chủng VN15M có hoạt tính mạnh ổn định Chủng nấm mốc Aspergillus terreus VN15M nuôi cấy môi trường l ng chứa 0,5% CMC 28oC thu nhận CMCase có hoạt độ 2,22 IU/ml Chủng Aspergillus terreus VN15M có khả sinh tổng hợp enzyme CMCase cao điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 30oC, nguồn cacbon 0,5% CMC nguồn nitơ 0,3% NaNO3 + 0,3% Tryptone Kiến nghị Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme CMCase chủng VN15M 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đàm Quang Hiếu (2015), Sàng lọc phân tích đặc tính enzyme thủy phân cellulose bền nhiệt hoạt động môi trường axit từ nấm mốc, Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Đ ng V Hồng Miên (2015), Hệ nấm mốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đ ng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên (2002), Hóa sinh cơng nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng Lương Đức Phẩm (2005), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng cộng (2006), Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân D ng cộng (1997), Vi sinh vật học (Tái lần thứ 4), NXB Giáo dục Nguyễn Minh Tân (2017), Phân lập bước đầu định danh vi nấm biển từ Vịnh Vân Phong, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Nha Trang 10 Nguyễn Thị Kim Thi (2018), Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus aculeatus, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Nha Trang 11 Nguyễn Thị Khả (2015), Giáo trình vi sinh cơng nghiệp, Trường Cao đẳng Công nghệ Kinh tế Hà Nội 12 Nguyễn Văn Bá (2005), Giáo trình mơn nấm học, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ 50 13 Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Phương Nhuệ, V Thị Hạnh Nguyên, Phạm Thị Hồng Thảo, Phạm Thanh Huyền, Phí Quyết Tiến, Lê Gia Hy (2012), “Nghiên cứu chủng xạ khuẩn HLD 3.16 có hoạt tính kháng khuẩn phân lập từ vùng ven bờ biển Việt Nam”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ 50: 579-591 14 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Công nghệ sinh học tập 3: Enzyme Ứng dụng, NXB Giáo dục 15 Trần Đông Bách (2008), Nghiên cứu sản xuất cellulase từ Aspergillus oryzea, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Cần Thơ 16 Trần Tín Phát (2017), Nghiên cứu thủy phân Polymanuronic acid từ động vật thân mềm, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Nha Trang 17 Trần Thị Châu Loan (2019), Đa dạng thành phần loài vi nấm phân lập từ nước biển ven bờ tỉnh Khánh Hòa, Luận văn Thạc sĩ (chưa bảo vệ), Trường Đại học Nha Trang 18 Trần Thị Trinh, Trần Thị Huế, Chu Đức Hà, Phạm Phương Thu, Nguyễn Văn Giang (2018), “Khảo sát số đ c tính sinh học chủng xạ khuẩn biển có khả kháng vi khuẩn gây bệnh”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 60 (10) 19 V Thị Dinh, Phan Thị Thu Nga, Hồng Trung Dỗn, Trần Liên Hà (2018), “Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ cao, thích nghi dải pH rộng, có hoạt tính cellulase cao bư c đầu ứng dụng x l nư c thải nhà máy giấy”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp số 1-2018 B TÀI LIỆU TIẾNG ANH 20 Abdel-Fatah OM, Hassan MM, Elshafei AM, Haroun BK, Alta HM, Othman AM (2011), “Physiological studies on carboxymethyl cellulase formation by Aspergillus terreus DSM 826”, Brazilian Journal of Microbiology: 01-11 21 Abu AA, Uptmoor R, Abdelmula AA, Salih M, Ordon F, Friedt W (2005), Genetic variation in sorghum germplasm from Sudan, ICRISAT, and USA assessed by simple sequence repeats, Crop Science 45: 1636-1644 51 22 Ahmed A and Bibi A (2018), “Fungal cellulase; production and applications: minireview”, International Journal of Health and Life-Sciences 4: 19-36 23 Ani AHAA (2005), Cellulase Production from Local Aspergillus sp Isolate and Assessing Some of their Properties and Applications, Ph.D Thesis, Agricultural College, Univ of Baghdad 24 Baig S and Saleem M (2012), “Production and Characterization of cellulase of Aspergillus niger by using rice husk and saw dust as subtrates”, Pakistan Journal of Botany, Pakistan 44: 377-382 25 Belén M, José MS, Noelia R, Sandra C, Attilio C, José MD (2010), “Biotechnological production of citric acid”, Brazilian Journal of Microbiology 41: 862-875 26 Bhat MK (2000), “Cellulases and related enzymes in biotechnology”, Biotechnology Advances: 355-383 27 Boraston A, Bray M, Brun E, Creagh AL, Gilkes NR, Guarna MM, Jervis E, Johnson P, Kormos J, McIntosh L (1997), The structure and function of cellulose-blindind domains, Cambridge, UK 28 Cavazzoni and Manoni (1994), “Extracellular cellulolytic complex from Morchella conica: Production and Purification”, Food Science and Technology 27: 73-77 29 Coral G, Arikan B, Unaldi MN, Guvenmes H (2002), “Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain”, Turk J Biol 26: 209-213 30 Elshafei AM, Haroun BM, Hassan MM, Abdel-Fatah OM, Atta HM, Othman AM (2008), “Properties of Extracellular Carboxymethyl Cellulase Produced by Aspergillus terreus DSM 826 using some Agricultural Wastes”, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology: 29-36 31 El-Nahrawy S, Metwally M, El-Kodoos RYA, Belal ESB, Shabana SA, El-Refai IM (2017), “Optimization of Culture Conditions for Production of 52 Cellulase by Aspergillus tubingensis KY615746”, Env Biodiv Soil Security 1: 177-189 32 Farinas CS, Damaso MCT and Couri S (2013), “Cellulase Activity Assays: A Practical Guide”, In: Vermelho AB and Couri S (eds) Method to Determine Enzymatic Activity: Bentham Science: 68-85 33 Garriga M, Almaraz M, Marchiaro A (2017), “Determination of reducing sugars in extracts of Undaria pinnatifida (harvey), algae by UV-visible spectrophotometry (DNS method)”, Actas de Ingeniería 3: 173-179 34 Ghose TK (1987), “Measurement of Cellulase Activities”, Pure and Appl Chem 59: 257-268 35 Han MJ, Kim NJ, Lee SY (2010), “Extracellular proteome of Aspergillus terreus grown on different cacbon sources”, Curr Genet: 369-382 36 Han YW, Srinivasan VR (1969), “Purification and characterization of beta-glucosidase of Alcaligenes faecalis”, J Bacteriol 100: 63-70 37 Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR., Olsson L (2005), “Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis”, Enzyme Microb Technol: 42-48 38 Johanna S, Annemarie K, Antje L, Deniz T (2016), “From Discovery to Production: Biotechnology of Marine Fungi for the Production of New Antibiotics”, Marine Drugs 14: 137-157 39 John S (2019), Fungi: Definition, Types, Characteristics and Reproduction, Science ABC 40 Jones EBG, Satinee S, Jariya S, Ali HB, Mohamed AA, Teun B, Pang KL (2015), “Classification of marine Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota and Chytridiomycota”, Fungal Diversity 73: 1-72 41 Li X, Lin W, Gao P and Chen F (1998), “Endoglucanase S, a novel endocellulase exhibiting exoglucanase activity from a newly isolated Streptomyces sp LX”, Journal of Applied Microbiology 85: 347-356 53 42 Lidia B, Marek S, Krzysztof S, Jolanta L, Malgorzata J (2014), “Trichoderma spp.- application and prospects for use in organic farming and industry”, Journal of Plant Protection Research 54 43 Maharana and Ray (2015), “Optimization and characterization of cold-active endoglucanase produced by Aspergillus terreus strain AKM-F3 grown on sugarcane bagasse”, Turkish Journal of Biology: 175-185 44 Mishra (1988), “Abundance of bacteria and fungi in seagrass and mangrove detritus”, Marine Ecology Progress Series 42: 73-78 45 Narra M, Dixit G, Divecha J, Kumar K, Madamwar D (2014), “Production, purification and characterization of a novel GH 12 family endoglucanase from Aspergillus terreus and its application in enzymatic degradation of delignified rice straw”, International Biodeterioration and Biodegradation: 150-161 46 Ogawa (1989), Animal crustaceous enzyme system of Trichoderma viride, Faculty of Agriculture, Miyazaki University, Japan 47 Pauchari PVA, More S, Sullia SB, Deshmukh S (2017), “Purification and Characterization of cellulase from a novel isolate of Trichoderma longibrachiatum”, Biofuels: 1-7 48 Picart P, Diaz P, Pastor F (2007), “Cellulase from two Penicillium sp Strains isolated from subtropical forest soil: production and characterization”, Letters in Applied Microbiology 45: 108-113 49 Prasanna HN, Ramanjaneyulu G, Rajasekhar RB (2016), “Optimization of cellulase production by Penicillium sp.”, Biotech: 162 50 Ramesh T, Kalaiselvam M (2011), “An experimental Study on Citric acid Production by Aspergillus niger Using Gelidiella acerosa as a Substrate”, Indian J Microbiol 51: 289-293 51 Rasha MS, Al-Rawi (2011), “Purification and Characterization of Cellulase from Aspergillus terreus”, J Food Industries and Nutri Sci.: 139-146 52 Robert HB, Jonas R, Bernhard S (2016), “Cellulases and beyond: the first 70 years of the enzyme producer Trichoderma reesei”, Microbial Cell Factorie 54 53 Rubeena M, Neethu K, Sajith S, Sreedevi S, Priji P, Unni KN, Sarath JMK, Jisha VN, Pradeep S, Benjamin S (2013), “Lignocellulolytic activities of a novel strain of Trichoderma harzianum”, Advances in Bioscience and Biotechnology: 214-221 54 Sadaf J, Khan N, Jahangeer S, Sohail M, Shahzad S, Ahmad A, Khan SA (2005), Screening and Characterization of Fungal Cellulases Isolated from The Native Environment Source, Department of Botany, University of Karachi 55 Sajith S, Priji P, Sreedevi S, Benjamin S (2016), “An overview on Fungal Cellulases with an Industrial Perspective”, Journal of Nutrition and Food Sciences 56 Santos TCD, Arbreu FG, Brito ARD, Pires AJV, Bonomo RCE, Franco M (2016), “Production and characterization of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger and Rhizopus sp by solid state fermentation of prickly pear”, Revista Caatinga 29: 222-233 57 Schawarz WH, Grabnitz F, Staudenbauder WL (1986), “Properties of Clostridium thermocellum endoglucanase produced in Escherichia coli”, Appl Environ Microbiol (51): 1293-1299 58 Schwarz WH (2010), “The cellulosome and cellulose degration by anaerobic bacteria”, Appl Microbiol Biotechnol 56: 634-649 59 Sohail M, Ahmad A, Khan SA (2016), “Production of cellulase from Aspergillus terreus MS105 on crude and commercially purified substrates”, Biotech: 103 60 Swathi J, Narenda K, Sowjanya KM, Satya AK (2013), “Marine fungal metabolites as a rich source of bioactive compounds”, Academic Journals 7: 184-196 61 Toor Y, Ilyas U (2014), “Optimization of cellulase production by Aspergillus ornatus by the solid state fermentation of Cicer arietinum”, American Journal of Research 2: 125-141 55 62 Trivedi N (2015), “Marine Enzymes Biotechnology: Production and Industrial Applications, Part II-Marine Organisms Producing Enzymes”, Academic press 63 Trivedi N, Reddy CRK, Lali AM (2016), “Marine Microbes as a Potential Source of Cellulolytic Enzymes”, Advances in Food and Nutrition Research 79: 27-37 64 Vyas A, Vyas D, Vyas KM (2005), “Production and optimization of cellulases on pretreated groundnut shell by Aspergillus terrreus AV49”, Journal of Scientific and Industrial Research: 281-286 65 Willis KJ (2018), State of the World’s Fungi 2018, Royal Botanic Gardens, Kew C TÀI LIỆU TỪ INTERNET 66 https://www.tutorialspoint.com/biological_classification/fungi_tissue_and_cell_ structure.asp 67 https://www.ppdictionary.com/mycology/albicans.htm 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE STT Ống thí nghiệm (TN) Mẫu tr ng 4 OD1 OD2 ODTB 0,046 0,059 0,115 0,175 0,25 0,036 0,057 0,111 0,125 0,244 0,041 0,058 0,113 0,15 0,247 Hàm lượng glucose (mg/0,5ml) 0,17 0,25 0,5 0,67 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ ĐO QUANG VÀ HOẠT ĐỘ ENZYME CMCASE CỦA VN15M, DW7M, HMB7Y Chủng ODĐC OD1 OD2 ODTB ΔOD Hàm lượng glucose (mg/0,5ml) Hoạt độ (IU/ml) DW7M HMB7Y VN15M 0,001 0,007 -0,005 0,001 0,014 0,05 0,003 0,019 0,055 0,002 0,0165 0,0525 0,001 0,0095 0,0575 0,016 0,051 0,25 0,07 0,23 2,22 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐO QUANG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ NI CẤY ĐẾN Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP ENZYME CMCASE Enzyme pha loãng lần đệm natri citrate 50 mM; pH 4,8 theo tỉ lệ enzyme : đệm Nhiệt độ nuôi cấy ODĐC OD1 OD2 25oC 28oC 30oC -0,002 0,001 0,037 0,059 0,035 0,057 0,036 0,058 -0,004 0,000 0,003 0,000 0,067 0,035 0,015 0,000 0,07 0,034 0,02 0,001 0,0685 0,0345 0,0175 0,0005 37 C 40oC 45oC o ODTB ΔOD Hàm lượng glucose (mg/0,5ml) Hoạt độ (IU/ml) 0,038 0,057 0,169 0,248 1,50 2,20 0,0725 0,0345 0,0145 0,0005 0,312 0,155 0,072 0,014 2,77 1,38 0,64 0,13 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ ĐO QUANG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ENZYME CMCASE Enzyme thu từ nguồn cacbon khác pha loãng 10 lần đệm natri citrate 50 mM; pH 4,8 Riêng nguồn cacbon CMC pha loãng lần Nguồn cacbon ODĐC OD1 OD2 ODTB ΔOD Hoạt độ (IU/ml) 0,072 0,009 Hàm lượng glucose (mg/0,5ml) 0,310 0,049 0,5% CMC 0,5% CMC + 0,5% Glucose 0,5% CMC + 0,5% Sucrose 0,5% CMC + 0,5% Lactose 0,5% CMC + 0,5% Fructose -0,005 0,041 0,065 0,069 0,067 0,051 0,049 0,05 0,054 0,06 0,06 0,06 0,006 0,037 1,64 0,095 0,099 0,101 0,1 0,005 0,033 1,45 0,082 0,085 0,085 0,085 0,003 0,024 1,08 2,75 2,19 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐO QUANG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN NITƠ TRONG MÔI TRƯỜNG NI CẤY ĐẾN Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP ENZYME CMCASE Enzyme thu từ nguồn nitơ khác pha loãng lần đệm natri citrate 50 mM; pH 4,8 Nguồn nitơ vô ODĐC OD1 OD2 ODTB ΔOD 0,3% NaNO3 0,3% NH4NO3 0,3% NH4Cl 0,3% KNO3 0,3% (NH4)2SO4 -0,005 0,065 0,068 0,0665 0,0715 0,3% Nguồn nitơ hữu + 0,3% NaNO3 Tryptone Peptone Cao nấm men Urea -0,002 -0,005 -0,001 0,000 0,046 0,064 0,047 0,000 0,042 0,044 0,059 0,0615 0,053 0,05 0,001 0,0005 ODĐC OD1 OD2 ODTB ΔOD -0,005 0,066 0,07 0,068 0,073 -0,005 0,001 -0,005 0,042 0,02 0,004 0,046 0,044 0,024 0,022 0,005 0,0045 0,046 0,0665 0,051 0,0015 0,049 0,021 0,0095 Hàm lượng Hoạt độ glucose (IU/ml) (mg/0,5ml) 0,308 0,202 0,287 0,223 0,018 2,74 1,80 2,55 1,98 0,16 Hàm lượng Hoạt độ glucose (IU/ml) (mg/0,5ml) 0,314 0,215 0,099 0,051 2,79 1,91 0,88 0,46 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ ĐO QUANG VÀ HOẠT ĐỘ CMCASE CỦA CHỦNG ASPERGILLUS TERREUS VN15M, VI KHUẨN VÀ ENYME THƯƠNG MẠI TƯƠNG ỨNG Mẫu enzyme CMCase chủng Aspergillus terreus VN15M vi khuẩn HCR1 pha loãng lần đệm natri citrate 50 mM; pH 4,8 Đối v i enzyme thương mại LEAFCELL, pha loãng 15 lần đệm natri citrate 50 mM; pH 4,8 Kết đo quang lần 1: Enzyme CMCase ODĐC OD1 OD2 ODTB ΔOD Hoạt độ (IU/ml) VN15M Hàm lượng glucose (mg/0,5ml) -0,005 0,089 0,323 0,069 0,116 0,555 0,075 0,112 0,559 0,072 0,114 0,557 0,077 0,025 0,234 0,330 0,115 0,980 2,79 1,03 65,32 OD2 ODTB ΔOD Hàm lượng glucose (mg/0,5ml) 0,312 0,130 0,949 Hoạt độ (IU/ml) HCR1 LEAFCELL Kết đo quang lần 2: Enzyme CMCase ODĐC OD1 VN15M -0,004 0,067 0,07 HCR1 0,0875 0,090 0,059 LEAFCELL 0,314 0,553 0,528 Kết đo quang trung bình: 0,0685 0,0725 0,0875 0,0285 0,5405 0,2265 2,77 1,15 63,25 Enzyme chủng Hoạt độ enzyme CMCase (IU/ml) Độ lệch chuẩn VN15M HCR1 LEAFCELL 2,78 1,09 64,28 0,01 0,09 1,46 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VI? ??N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI NẤM PHÂN LẬP TỪ NƯỚC BIỂN VEN BỜ THUỘC TỈNH KHÁNH HÒA GVHD: TS Phạm Thu... Mục tiêu đề tài Sàng lọc hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ngoại bào chủng vi nấm phân lập từ mẫu nư c biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hịa Chọn chủng vi nấm có hoạt tính CMCase mạnh... Hồng Lộc MSSV: 57131647 Khánh Hòa – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: ? ?Sàng lọc hoạt tính enzyme cellulase vi nấm phân lập từ nước biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hịa” trình bày luận