Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập từ ruột của ấu trùng protaetia brevitarsis seulensis

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GENOME CĨ KHẢ NĂNG KHỬ NITRAT CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ RUỘT CỦA ẤU TRÙNG Protaetia brevitarsis seulensis Mã số: T2022-06-06 Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Thị Ngọc Thư Đà Nẵng, 11/2023 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU STT Họ tên Đơn vị công tác lĩnh vực 01 TS Nguyễn Thị Đông Phương chuyên môn Khoa CNHH-MT, chuyên ngành Công nghệ Sinh học i MỤC LỤC MỤC LỤC .ii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HINH ẢNH .v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU viii INFORMATION ON RESEARCH RESULTS xi MỞ ĐẦU .1 1.Tổng quan nghiên cứu nước .1 2.Tính cấp thiết đề tài 3.Mục tiêu, đối tượng nghiên cứu đề tài: Mục tiêu Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu .3 4.Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu Cách tiếp cận Phương pháp nghiên cứu .3 Nội dung nghiên cứu .4 CHƯƠNG 1.1 Chu trình Ni tơ 1.2 Vi khuẩn khử Nitrat .12 1.3 Cellulosimicbium 21 1.4 Phân tích tin sinh 22 1.4.1 Tin sinh học .22 1.4.2 Phân tích metagenomics 24 1.4.3 Sự phát triển cơng nghệ giải trình tự thông lượng cao 26 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Nguyên liệu 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phân lập vi sinh vật từ ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis 34 2.2.2 Tách chiết DNA vi khuẩn 36 ii 2.2.3 Giải trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn phân lập 36 2.2.4 Phân tích tin sinh học khả khử nitrat vi khuẩn phân lập 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis môi trường đặc hiệu .39 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu .39 3.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập phương pháp sinh học phân tử 40 3.2 Giải trình tự tồn gen chủng vi kh̉n có khả khử nitrat thuộc chi Cellulosimicrobium 44 3.3 Phân tích đường khử nitrat so sánh gen .44 3.4 Dự đoán cụm gen sinh tổng hợp 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .54 Kết luận .54 Kiến nghị .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 58 Một số đoạn 16S rRNA .58 Hình ảnh đoạn gen kí gửi QJW35564.1 NCBI 60 Hình ảnh Cellulosimicrobium protaetiae BI34 kí gửi NCBI 61 THUYẾT MINH ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG HỢP ĐỒNG TRIỂN KHAI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI PHỤ LỤC HỢP ĐỒNG BẢNG MỤC LỤC MINH CHỨNG SẢN PHẨM ĐỀ TÀI BỘ MINH CHỨNG SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI iii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Môi trường phân lập đặc hiệu 39 Bảng 3.2 Các chủng phân lập thuộc Cellulosimicrobium 41 Bảng 3.3 Bảng tổng hợp đặc điểm chung chủng Cellulosimicrobium phân lập 45 Bảng 3.4 Dữ liệu gen Cellulosimicrobium dự đoán cụm gen sinh tổng hợp 47 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Chu trình biến đổi N sinh học điều khiển xảy môi trường biển đất liền tự nhiên chịu ảnh hưởng người (Zhang et al 2020) Hình Quá trình cố định đạm tự nhiên Hình Sơ đồ q trình nitrat hóa Hình Loại bỏ nitơ vi sinh vật xử lý nước thải (Kuypers et al 2018).11 Hình Cây phát sinh lồi dựa trình tự gen 16S rRNA phần (1.334 bp) sử dụng MEGA 5.2 Mối quan hệ phát sinh gen chất khử nitơ hiếu khí báo cáo khác tạo phương pháp nối hàng xóm (1.000 lần lặp lại) Giá trị Bootstrap 50% hiển thị nút.(Ji et al 2015) 13 Hình Tóm tắt đường xác định, tương tác, loại bỏ nitơ vi khuẩn khử nitơ dị dưỡng-khử khí hiếu khí từ nước ni trồng thủy sản cách sử dụng nuôi cấy tế bào metagenomics (Huang et al 2020) .14 Hình Định danh 80 chủng hoang dã đánh giá an toàn sinh thái - sinh học chủng S16 DS'5 15 Hình Phản ứng tổng quát trình khử nitrat vi khuẩn(Albina et al n.d.) 17 Hình Sơ đồ biểu diễn chuỗi hơ hấp q trình khử nitrat (Albina et al n.d.) 18 Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn q trình điều hịa phiên mã biểu gen mã hóa enzyme khác liên quan đến trình khử nitrat P denitrifican .19 Hình 1.11 Sơ đồ trình bày bước cần thiết để phân tích liệu có nguồn gốc metagenomics WGS 25 Hình 12 Lịch sử phát triển giải trình tự .27 Hình 2.1 Ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis 33 Hình 2.2 Bộ kit DNA NucleoSpin 33 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu .34 Hình 2.4 Dung dịch mẫu pha loãng để cấy ria 35 Hình 2.5 Nguyên lý tách chiết DNA sử dụng kit DNA NucleoSpin 36 Hình 2.6 Cấu trúc mồi thiết kế cho 16S rRNA 37 Hình Kh̉n lạc mơi trường kị khí AB .39 v Hình Các chủng tách từ chủng phân lập xác định dựa trình tự tương tự 16S rRNA 41 Hình 3 Cây phát sinh lồi dựa trình tự gen 16S rRNA 43 Hình Con đường chuyển hóa nitơ Cellulosimicrobium BI34 gen liên quan 1, nitrat khử (9); 2, men khử nitrit (5); 3, tổng hợp glutamine (2); 4, glutamat dehydrogenaza (3); 5, tổng hợp glutamat (2) *Các số ngoặc minh họa số lượng CDS liên quan đến gen .46 Hình Quy trình khử nitrat tổng quát VSV phân lập từ Cellulosimicrobium52 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGCs: biosynthetic gene clusters CDSs: Protein coding genes COG: clusters of orthologous groups of proteins HGAP: hierarchical genome assembly process ncRNA: non-coding RNA NRP: non-ribosomal peptide SMRT: single-molecule real-time RAST: rapid annotation subsystems technology rRNA: ribosomal RNA tRNA: transfer RNA T3PKS: type III polyketide synthase NRPS: Nonribosomal Peptide Synthetases vii ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: -Tên đề tài: Nghiên cứu phân tích genome có khả khử nitrat vi khuẩn phân lập từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis - Mã số: T2022-06 - Chủ nhiệm: TS Trần Thị Ngọc Thư - Thành viên tham gia: TS Nguyễn Thị Đông Phương - Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật, ĐH Đà Nẵng - Thời gian thực hiện: 09 tháng, từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 Mục tiêu:  Phân lập vi khuẩn Cellulosimicrobium sp từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis  Phân tích đoạn gen có khả khử nitrat vi khuẩn phân lập cách tiếp cận tin sinh Tính sáng tạo: Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis phân lập chủng vi khuẩn khử nitrat tiếp cận tin sinh để dự đốn đặc tính khử nitrat đặc tính khác chúng nghiên cứu mới, có ý nghĩa thực tiễn làm giảm trình thực nghiệm nghiên cứu xác định đặc tính Tóm tắt kết nghiên cứu: Hiện ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis nghiên cứu nguồn thực phẩm bổ dưỡng tập trung vào tác động môi trường chúng Trong nghiên cứu này, hệ vi sinh vật đường ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis nghiên cứu để làm sáng tỏ tác động vai trị chúng mơi trường Trong số giống vi khuẩn phong phú xác định dựa gen 16S rRNA từ chủng phân lập ruột ấu trùng côn trùng Protaetia viii