Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập từ ruột của ấu trùng protaetia brevitarsis seulensis

Tổng quan nghiên cứu trong và ngoài nước Vi khuẩn khử nitrat sử dụng cả ba nguồn năng lượng có sẵn cho vi khuẩn baogồm các hợp chất carbon hữu cơ , hợp chất ni tơ vô cơ và ánh sáng đ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GENOME CÓ

KHẢ NĂNG KHỬ NITRAT CỦA VI

KHUẨN PHÂN LẬP TỪ RUỘT CỦA ẤU

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

chuyên môn

01 TS Nguyễn Thị Đông Phương Khoa CNHH-MT, chuyên ngành

Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv

DANH MỤC HINH ẢNH v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU viii

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS xi

MỞ ĐẦU 1

1.Tổng quan nghiên cứu trong và ngoài nước 1

2.Tính cấp thiết của đề tài 2

3.Mục tiêu, đối tượng nghiên cứu của đề tài: 3

Mục tiêu 3

Đối tượng nghiên cứu 3

Phạm vi nghiên cứu 3

4.Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 3

Cách tiếp cận 3

Phương pháp nghiên cứu 3

Nội dung nghiên cứu 4

CHƯƠNG 1 5

1.1.Chu trình Ni tơ 5

1.2.Vi khuẩn khử Nitrat 12

1.3 Cellulosimicbium 21

1.4 Phân tích tin sinh 22

1.4.1 Tin sinh học 22

1.4.2 Phân tích metagenomics 24

1.4.3 Sự phát triển của công nghệ giải trình tự thông lượng cao 26

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Nguyên liệu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phân lập vi sinh vật từ ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis 34

2.2.2 Tách chiết DNA của vi khuẩn 36

2.2.3 Giải trình tự gen 16S rRNA của các vi khuẩn phân lập 36

2.2.4 Phân tích tin sinh học về khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis trên môi trường đặc hiệu 39

3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu 39

3.1.2 Định danh các vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh học phân tử 40

3.2 Giải trình tự toàn bộ gen của chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrat thuộc chi Cellulosimicrobium 44

3.3 Phân tích con đường khử nitrat và so sánh bộ gen 44

3.4 Dự đoán cụm gen sinh tổng hợp 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

Kết luận 54

Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 58

Một số đoạn 16S rRNA 58

Hình ảnh của đoạn gen kí gửi QJW35564.1 trên NCBI 60

Hình ảnh của Cellulosimicrobium protaetiae BI34 kí gửi trên NCBI 61 THUYẾT MINH ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

HỢP ĐỒNG TRIỂN KHAI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

PHỤ LỤC HỢP ĐỒNG

BẢNG MỤC LỤC MINH CHỨNG SẢN PHẨM ĐỀ TÀI

BỘ MINH CHỨNG SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Môi trường phân lập đặc hiệu 39Bảng 3.2 Các chủng phân lập thuộc Cellulosimicrobium 41Bảng 3.3 Bảng tổng hợp đặc điểm chung của các chủng Cellulosimicrobium phân lập 45Bảng 3.4 Dữ liệu bộ gen của Cellulosimicrobium và dự đoán các cụm gen sinh tổng hợp 47

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Chu trình biến đổi N do sinh học điều khiển xảy ra trong môi trường biển và

đất liền tự nhiên và chịu ảnh hưởng của con người (Zhang et al 2020) 6

Hình 1 2 Quá trình cố định đạm tự nhiên 7

Hình 1 3 Sơ đồ quá trình nitrat hóa 8

Hình 1 4 Loại bỏ nitơ bằng vi sinh vật trong xử lý nước thải (Kuypers et al 2018).11 Hình 1 5 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen 16S rRNA một phần (1.334 bp) sử dụng MEGA 5.2 Mối quan hệ phát sinh gen của các chất khử nitơ hiếu khí được báo cáo khác nhau đã được tạo ra bằng phương pháp nối hàng xóm (1.000 lần lặp lại) Giá trị Bootstrap trên 50% được hiển thị ở mỗi nút.(Ji et al 2015) 13

Hình 1 6 Tóm tắt con đường xác định, tương tác, loại bỏ nitơ của vi khuẩn khử nitơ dị dưỡng-khử khí hiếu khí từ nước nuôi trồng thủy sản bằng cách sử dụng nuôi cấy tế bào và metagenomics (Huang et al 2020) 14

Hình 1 7 Định danh 80 chủng hoang dã và đánh giá an toàn sinh thái - sinh học của chủng S16 và DS'5 15

Hình 1 8 Phản ứng tổng quát quá trình khử nitrat ở vi khuẩn(Albina et al n.d.) 17

Hình 1 9 Sơ đồ biểu diễn chuỗi hô hấp chính của quá trình khử nitrat (Albina et al n.d.) 18

Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn quá trình điều hòa phiên mã sự biểu hiện của các gen mã hóa các enzyme khác nhau liên quan đến quá trình khử nitrat ở P denitrifican 19

Hình 1.11 Sơ đồ trình bày các bước chính cần thiết để phân tích dữ liệu có nguồn gốc metagenomics của WGS 25

Hình 1 12 Lịch sử phát triển giải trình tự 27

Hình 2.1 Ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis 33

Hình 2.2 Bộ kit DNA NucleoSpin 33

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 34

Hình 2.4 Dung dịch mẫu được pha loãng để cấy ria 35

Hình 2.5 Nguyên lý tách chiết DNA sử dụng bộ kit DNA NucleoSpin 36

Hình 2.6 Cấu trúc và mồi thiết kế cho 16S rRNA 37

Hình 3 1 Khuẩn lạc trên môi trường kị khí AB 39

Hình 3 2 Các chủng được tách ra từ các chủng phân lập và được xác định dựa trêntrình tự tương tự 16S rRNA 41Hình 3 3 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen 16S rRNA 43Hình 3 4 Con đường chuyển hóa nitơ chính trong Cellulosimicrobium BI34 và cácgen liên quan 1, nitrat khử (9); 2, men khử nitrit (5); 3, tổng hợp glutamine (2); 4,glutamat dehydrogenaza (3); 5, tổng hợp glutamat (2) *Các số trong ngoặc minh họa

số lượng CDS liên quan đến gen 46

Hình 3 5 Quy trình khử nitrat tổng quát của VSV phân lập từ Cellulosimicrobium52

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BGCs: biosynthetic gene clusters

CDSs: Protein coding genes

COG: clusters of orthologous groups of proteins

HGAP: hierarchical genome assembly process

ncRNA: non-coding RNA

NRP: non-ribosomal peptide

SMRT: single-molecule real-time

RAST: rapid annotation subsystems technology

rRNA: ribosomal RNA

tRNA: transfer RNA

T3PKS: type III polyketide synthase

NRPS: Nonribosomal Peptide Synthetases

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

-Tên đề tài: Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat của vi khuẩn

phân lập từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis

- Mã số: T2022-06

- Chủ nhiệm: TS Trần Thị Ngọc Thư

- Thành viên tham gia: TS Nguyễn Thị Đông Phương

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật, ĐH Đà Nẵng

- Thời gian thực hiện: là 09 tháng, từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023

4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu:

Hiện nay ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis đã được nghiên cứu như

một nguồn thực phẩm bổ dưỡng và cũng tập trung vào tác động môi trường của chúng

Trong nghiên cứu này, hệ vi sinh vật đường ruột của ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis đã được nghiên cứu để làm sáng tỏ tác động và vai trò của chúng

đối với môi trường Trong số các giống vi khuẩn phong phú được xác định dựa trêngen 16S rRNA từ các chủng phân lập trong ruột của ấu trùng côn trùng Protaetia

brevitarsis seulensis, sáu trong số các chi nổi bật được xác định là Bacillus (40,2%), Cellulosimicrobium (33,5%), Microbacteria (2,8%), Streptomyces (3%), Krasilnikoviella (17,5%) và Isoptericola (3%); và độ giống nhau của đoạn 16S rRNA

từ 99% thành 100% Cellulosimicrobium protaetiae BI34T cho thấy hoạt tính khử

nitrat và phân hủy cellulose mạnh mẽ Trình tự bộ gen mới hoàn chỉnh của BI34T và

bộ gen của năm loài được công bố trong chi Cellulosimicrobium, tập trung vào các gen

khử nitrat và gen chuyển hóa thứ cấp Để làm sáng tỏ mối quan hệ giữa chủng BI34T

và ấu trùng côn trùng chủ, toàn bộ trình tự bộ gen được phân tích, sau đó so sánh với

bộ gen của 5 chủng trong cùng chi Cellulosimicrobium được nạp từ GenBank Kết quả

của nghiên cứu cho thấy thành phần hệ vi sinh vật đường ruột của ấu trùng côn trùng

và phân tích dữ liệu bộ gen của chủng mới để dự đoán các đặc điểm của nó và hiểuđược con đường chuyển hóa nitơ

5 Tên sản phẩm:

Bài báo đăng trên tạp chí có tên tạp chí thuộc danh mục SCIE/Q2: 01 bài báo

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu

 Đối với lĩnh vực giáo dục và đào tạo: Hướng dẫn sinh viên nghiên cứukhoa học và tốt nghiệp Đại học

 Đối với lĩnh vực kinh tế-xã hội: Thu thập được chủng vi khuẩn khử nitrat

để đưa vào ứng dụng xử lý

 Phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu: Bàn giao trực tiếp sản phẩmcủa đề tài cho Khoa Công nghệ Hóa học-Môi trường, trường Đại học Sưphạm Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng

 Địa chỉ ứng dụng:

 Là tài liệu tham khảo giảng dạy cho các học phần Kỹ thuật phân tích trongCông nghệ Sinh học/ Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh thực phẩm cho cácsinh viên Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ Hóa học-Môitrường, trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật (100 sinh viên)

 Ứng dụng cho các trường Đại học và Cao đẳng trong địa bàn TP ĐàNẵng

Mẫu 4 Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

Project title: Research on genome analysis of denitrifying bacteria isolated from the gut of Protaetia brevitarsis seulensis larvae

Code number: T2022-06-06

Coordinator: Dr Nguyen Thi Dong Phuong

Implementing institution: University of Technology and Education, TheUniversity of Danang

Duration: from March, 2023 to November, 2022

3 Creativeness and innovativeness:

Studying the microbial diversity in the intestine of Protaetia brevitarsisseulensis larvae and isolating a denitrifying bacterial strain using a bioinformaticsapproach to predict their denitrifying properties and other properties is a new study.has practical significance and reduces the experimental process when researching todetermine this characteristic

4 Research results:

The insect larvae Protaetia brevitarsis seulensis have been researched as a source of

nutritious food and also concentrated on their environmental impacts, recently Therefore,their gut microbiota have been studying to elucidate their effects and roles on environment Ofthe abundance bacterial genus identified based on the 16S rRNA genes from isolates of the

gut of insect larva Protaetia brevitarsis seulensis, six of the prominent genus were identified

as Bacillus (40.2%), Cellulosimicrobium (33.5%), Microbacterium (2.8%), Streptomyces (3%), Krasilnikoviella (17.5%) and Isoptericola (3%); and their similarity of 16S rRNA blast changed from 99 % to 100% Cellulosimicrobium protaetiae BI34T showed strongdenitrification and cellulose degradation activity The newly complete genome sequence ofBI34T and the genomes of five species published in the genus Cellulosimicrobium, with

emphasis on the denitrification genes and secondary metabolite genes To elucidate the

relationship between the strain BI34T and the host insect larva, the whole genome sequencewas analyzed, then was compared with the genomes of five strains in the same genus

Cellulosimicrobium loaded from GenBank Our results revealed the composition of gut

microbiota of the insect larvae, and analyzing the genomic data for the new strain to predictits characteristics and to understand the nitrogen metabolism pathway

5 Products:

01 article published in the Journal of Molecular Biotechnology in the SCIE/Q2category

6 Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:

Guide students in scientific research and university graduation in the field ofeducation and training

- Collect denitrifying bacteria strains to apply for treatment

- Method of transferring research results: Directly hand over the project'sproducts to the Department of Chemical and Environmental Technology, University ofTechnical Education, University of Danang

- Application address:

o Used as a teaching material for Analytical Techniques courses inBiotechnology/Food Technology, Food Microbiology for students of the Department

of Food Technology, Faculty of Chemical and Environmental Technology, University

of Technical Education and for Universities and Colleges in Da Nang City

MỞ ĐẦU

1 Tổng quan nghiên cứu trong và ngoài nước

Vi khuẩn khử nitrat sử dụng cả ba nguồn năng lượng có sẵn cho vi khuẩn baogồm các hợp chất carbon hữu cơ , hợp chất ni tơ vô cơ và ánh sáng để hoàn tất chutrình chuyển hóa Ni tơ Vi khuẩn khử nitrat chiếm 10–15% quần thể vi khuẩn trongđất, nước và đá trầm tích [1] Khử nitrat là một đặc điểm chức năng được tìm thấytrong hơn 50 chi Hầu hết các vi khuẩn có đặc điểm chức năng như các loài

Alcaligenes, Pseudomonas[3] và Bacillus[4] cũng như Actinobacteria (đặc biệt là Streptomycetes) Ngoài ra, trên một số nấm Fusarium và các chi biến hình có liên quan (Gibberella và Nectria) cũng cho thấy khả năng khử nitrat[2] Thông thường các chi

khử nitrat được phân lập từ đất, nước ao hồ, rễ cây họ đậu, bắp[5] nhưng chưa cónhiều công bố về phân lập từ ruột các ấu trùng, trong khi ấu trùng hoặc côn trùngchính là một trong những tác nhân quan trọng làm tơi xốp đất đai Các nghiên cứu các

chủng vi khuẩn từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis mới được nghiên

cứu gần đây đã cho thấy sự đa dạng các chủng vi sinh vật, nhất là chiCellulosimicrobium [6,7] có khả năng phân hủy cellulose mà chưa có nghiên cứu đềcập đến khả năng khử nitrat

Tại Việt Nam, các hợp chất nitơ trong môi trường nước nuôi thủy sản là amoni,nitrit và nitrat, là những hợp chất gây độc cho cá, động vật thân mềm, giáp xác và cựckỳ độc cho tôm Các hợp chất ni tơ vô cơ này nếu không được xử lý sẽ tăng lên theocấp số nhân trong suốt thời vụ nuôi tôm Do đó những năm gần đây, các nhà khoa họctrong nước cũng đã và đang nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn khử nitrat, nitrat hóa vàocông nghiệp xử lý nước thải thủy hải sản, thực phẩm nhằm giảm thiểu các gốc chứa ni

tơ độc hại chủ yếu là các gốc amoni Hoàng Phương Hà và cộng sự (2008) cũng đãcông bố đặc điểm sinh học 17 chủng vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ nuôi tômtại Quảng Bình và Hà Tĩnh [3], có các đặc điểm thuộc chi Nitrosomonas,Nitrosobacteria và Nitrospira Gần đây, nhóm tác giả này (2020) cũng đã công bố phânlập được chủng BL 5 được xác định là Pseudomonas sp BL5 ở hồ nuôi tôm nước lợtại Bạc Liêu, có khả năng khử nitrIte trong cả hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí bằngthực nghiệm hóa sinh và giải trình đoạn gen 16s RNA Nguyễn Văn Minh và cộng sự(2012) đã phân lập và sàng lọc vi khuẩn nitrat hóa từ 15 mẫu nước ao nuôi tôm thẻchân trắng và ao nuôi cá tra Trong 3 chủng được lựa chọn có những đặc điểm phù hợpvới nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit dị dưỡng, thuộc chi Bacillus [4] Võ Thị Xuân

Hương và cộng sự (2018) đã phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải nitrat trong dưacải muối chua bằng phương pháp thực nghiệm, đã ứng dụng vi khuẩn khử nitrat phânlập được vào sản phẩm dưa cải muối chua nhằm giảm thiểu hàm lượng nitrat [5] Cácnghiên cứu trong nước đều phân lập được các chủng vi khuẩn nitrat hóa từ các nguồnthông thường thông qua các kỹ thuật thực nghiệm hóa sinh Những nghiên cứu phânlập chủng vi khuẩn khử nitrat cũng như sử dụng công cụ tin sinh còn hạn hẹp.

2 Tính cấp thiết của đề tài

Nitơ là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cần thiết để tạo ra cácthành phần quan trọng như acid amin, protein, acid nucleic, v.v Ngay cả những cây tolớn cũng cần được cung cấp Nitơ đầy đủ để phát triển và sản xuất Nitơ chủ yếu đượchấp thụ qua rễ nhỏ dưới dạng amoni hoặc nitrat Vì thế, quá trình khử nitrat là một quátrình cơ bản trong các chu trình nitơ, và là cơ chế quan trọng để giải phóng nitơ trong

tự nhiên Quá trình này được xúc tác bởi bốn loại enzyme khử nitơ: nitrat reductase,nitrit reductase, nitric oxide reductase và nitrous oxide reductase Tuy nhiên, cácenzyme này hạn chế trong tự nhiên và cần được tổng hợp để bổ sung vào đất Một sốlượng lớn vi sinh vật có thể khử nitrat và quá trình này là phản ứng đối với sự thay đổinồng độ oxy trong môi trường xung quanh chúng Khi nồng độ oxy bị hạn chế, vi sinhvật sẽ chuyển từ hô hấp hiếu khí sang hô hấp kỵ khí bằng cách sử dụng nitrat làm chấtnhận điện tử

Vi sinh vật phổ biến tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình khử nitrat là các vikhuẩn kỵ khí tùy tiện ví dụ như Alcaligenes, Pseudomonas và Bacillus, được phân lập

từ các vùng ao hồ, đất… là nơi chứa nhiều nitrat và được đưa vào nghiên cứu, ứngdụng từ nhiều thập niên qua Trong khi đó, ấu trùng hoặc côn trùng chính là một trongnhững tác nhân quan trọng làm tơi xốp đất đai, rất đa dạng chủng vi khuẩn nhưng chưa

có nhiều công bố về phân lập vi khuẩn khử nitrat từ nguồn này

Ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis đã được sử dụng làm thuốc truyềnthống của Hàn Quốc để điều trị một số bệnh hiểm nghèo như ung thư, bệnh viêmnhiễm và viêm gan Ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis được Bộ An toànThực phẩm và Dược phẩm Hàn Quốc phê duyệt là nguồn thực phẩm và ấu trùng cũngchứa protein chất lượng cao làm nguồn thực phẩm trong tương lai Do đó, nghiên cứu

sự đa dạng vi sinh vật trong ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis và phânlập được chủng vi khuẩn khử nitrat bằng tiếp cận tin sinh để dự đoán đặc tính khử

nitrat và các đặc tính khác của chúng là một nghiên cứu mới, có ý nghĩa thực tiễn và làm giảm quá trình thực nghiệm khi nghiên cứu xác định đặc tính này.

3 Mục tiêu, đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn khử nitrat được phân lập từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis, được thu thập ở Jeongeup, Hàn Quốc.

Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat thuộc chi

Cellulosimicrobium từ ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Cách tiếp cận

Trong nghiên cứu này, ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis được sử dụng để

phân lập vi khuẩn khử nitrat Thông qua công cụ tin sinh, nghiên cứu sẽ thu thập cácchủng chứa bộ gen khử nitrat

Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis trên môi trường đặc hiệu (MRS, hiếu khí, kị khí)… để thu nhận các

khuẩn lạc có sắc tố màu vàng, hình tròn và lồi để nghiên cứu

 Giải trình tự gen 16S rRNA của các vi khuẩn phân lập

 Phương pháp sử dụng công cụ phân tích dữ liệu metagenomic RapidAnnotation using Subsystem Technology (MR-RAST) phiên bản 4.0 Các giátrị lai DNA-DNA kỹ thuật số (dDDH) được xác định thông qua trình duyệt webGenome Blast Distance Phylogeny phiên bản 2.1 từ DSMZ (//ggdc.dsmz.de) đểđịnh danh và xây dựng cây phát sinh loài genome bằng phần mềm MEGA7

 Lựa chọn và giải trình tự toàn bộ gen của chủng vi khuẩn có khả năng khử

nitrat thuộc chi Cellulosimicrobium bằng cách sử dụng kết hợp các công nghệ

giải trình tự RSII single molecule, real time (SMRT) của Pacific Bioscatics(PacBio) và công nghệ giải trình tự Illuminate.

 Phương pháp dự đoán đặc tính khử nitrat của chủng vi khuẩn phân lập và dựđoán cụm gen sinh tổng hợp bằng phần mềm antiSMASH phiên bản 5.0

Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu này thực hiện theo các bước sau ở quy mô phòng thí nghiệm:

 Xây dựng đề cương nghiên cứu phân tích genome khả năng khử nitrat của vikhuẩn phân lập

 Nghiên cứu lý thuyết phân tích genome khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân

lập từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis

 Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis

trên môi trường đặc hiệu

 Tiến hành nuôi cấy sàng lọc các chủng vi khuẩn trích ly từ ruột ấu trùng trêncác môi trường kị khí, hiếu khí, MRS, các khuẩn lạc có sắc tố màu vàng, hìnhtròn và lồi là hình thái thông thường của các chủng vi khuẩn khử nitrat, đượcsàng lọc để nghiên cứu

 Giải trình tự gen 16S rRNA của các vi khuẩn phân lập được

 Lựa chọn và giải trình tự toàn bộ gen của chủng vi khuẩn có khả năng khử

nitrat thuộc chi Cellulosimicrobium

 Phân tích tin sinh đặc tính khử nitrat của chủng vi khuẩn phân lập và dự đoáncụm gen sinh tổng hợp

Cấu trúc báo cáo của đề tài nghiên cứu

Kết quả của đề tài được tóm lược qua 3 chương như sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu các nghiên cứu trong và ngoài nước

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1 1.1 Chu trình Ni tơ

Nitơ là nguyên tố có nhiều nhất trong bầu khí quyển Trái đất Bầu khí quyểnchứa gần 79% Nitơ Nitơ có mặt trong tất cả các sinh vật sống, dưới dạng protein, axitamin và axit nucleic DNA và RNA, trong khi trong khí quyển, nó hiện diện ở dạngphân tử (N₂) và ở dạng một số oxit Ở dạng nguyên tố, nó là một loại khí không màu

và không mùi, thực vật và động vật không thể sử dụng, nhưng sau khi kết hợp với Oxy

và các nguyên tố khác, nó có thể được các sinh vật sống sử dụng làm chất dinh dưỡng.Chu trình nitơ được gọi là “chu trình hoàn hảo” trong sinh quyển vì nó duy trì tổnghàm lượng nitơ trong khí quyển, đất và nước (Zilli et al 2019)(Zhang, Ward, andSigman 2020)

Định nghĩa chu trình nitơ

Chu trình Nitơ có thể được định nghĩa là dòng Nitơ tuần hoàn từ khí nitơ tự dotrong khí quyển đến Nitrat trong đất, và cuối cùng quay trở lại Nitơ khí quyển Chutrình Nitơ là một phần của Sinh học và nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sựcân bằng nitơ trong môi trường và có liên quan chặt chẽ với chu trình Carbon Mộtphần protein thực vật được động vật tiêu thụ và chuyển hóa thành protein động vật,phần còn lại bị phân hủy sau khi cơ thể thực vật phân hủy, giải phóng nitơ vào khíquyển Những protein này cũng phân hủy thành chất thải chứa nitơ như urê, axit uric

và amoniac ở động vật và được bài tiết ra ngoài Sau đó, các chất phân hủy sẽ tác độnglên xác chết và chất thải của động vật, giải phóng nitơ tự do trở lại khí quyển Nitơđược tuần hoàn từ môi trường đến sinh vật và sau đó quay trở lại môi trường bằngnhiều con đường (Zilli et al 2019)(Zhang et al 2020)

Hình 1.1 là Chu trình biến đổi N do sinh học điều khiển xảy ra trong môi trườngbiển và đất liền tự nhiên và chịu ảnh hưởng của con người bao gồm các bước:

- Cố định nitơ (N2) (bước 1)

- đồng hóa Nitơ (từ amoni, nitrat hoặc N hữu cơ)

- Các quá trình đồng hóa, trong khi khoáng hóa (bước 3),

- Nitrat hóa (bước 4−6), DNRA (bước 7,15 ),

- Khử nitrat (bước 7−11)

- Anammox (oxy hóa amoni kỵ khí, bước 12−14)

Các nguồn N cố định phi sinh học đi vào chu trình N sinh học dưới dạng amoni

và nitrat (Zhang et al 2020).

Hình 1.1 Chu trình biến đổi N do sinh học điều khiển xảy ra trong môi trường biển và đất liền tự nhiên và chịu ảnh hưởng của con người (Zhang et al 2020).

(1) Cố định đạm:

Nitơ có mặt trong khoảng 79% bầu khí quyển trái đất, nhưng hầu hết các sinhvật sống không thể sử dụng trực tiếp dạng nitơ này Quá trình khử nitơ trong khí quyển(N₂) thành ion amoni được gọi là cố định Nitơ

Cố định nitơ vật lý:

Trong tổng số nitơ được cố định bởi các cơ quan tự nhiên, khoảng 10% trong sốnày xảy ra do các quá trình vật lý như sét (tức là phóng điện), giông bão và ô nhiễmkhí quyển

Sét và bức xạ tia cực tím trong khí quyển tạo điều kiện cho sự kết hợp giữa khínitơ và oxy để tạo thành oxit nitric (NO) Các oxit nitric lại bị oxy hóa bằng oxy để tạothành nitơ peroxide (NO2)

N2+O2 ————> 2NO (Khi có sấm chớp)

2NO+O2 ————–> 2NO2 (Sự oxy hóa)Nitơ peroxide này có thể kết hợp với nước trong mưa để tạo thành axit nitơ vàaxit nitric Các axit rơi xuống đất cùng với nước mưa và phản ứng với các gốc kiềm đểtạo ra nitrat hòa tan trong nước (NO ) và nitrit (NO )

2NO2 + H2O > HNO2 + HNO3

HNO3 + Ca hoặc K —————-> Muối Ca hoặc K nitratNitrat hòa tan trong nước và được cây hấp thụ trực tiếp

Cố định đạm sinh học:

Việc chuyển đổi nitơ khí quyển (nitơ phân tử) thành các dạng vô cơ hoặc hữu

cơ có thể sử dụng được với sự trợ giúp của các sinh vật sống được gọi là quá trình cốđịnh nitơ sinh học Quá trình này được thực hiện bởi hai loại vi sinh vật chính:

Những loài sống tự do hoặc không cộng sinh

Nững loài sống cộng sinh chặt chẽ với các loài thực vật khác: Vi khuẩn cố địnhđạm cũng có mặt trong các nốt sần ở rễ, vi khuẩn Rhizobium, là một loại vi khuẩn hiếukhí cần một lượng oxy để tồn tại

Gần đây, loại vi khuẩn thứ ba có khả năng cố định đạm gắn với rễ cây ngũ cốc

và cỏ đã được công nhận Nó được gọi là cố định nitơ cộng sinh liên kết

Hình 1 2 Quá trình cố định đạm tự nhiên

(3) Quá trình nitrat hóa:

Quá trình nitrat hóa là một quá trình gồm hai bước, trong đó amoniac (NH3)trước tiên được chuyển đổi thành Nitrite (NO2-) bởi các vi khuẩn nitrat hóa nhưNitrosomonas và Nitrobacter Ở bước thứ hai, nitrite (NO2-) tiếp tục bị oxy hóa thànhNitrate (NO3-) bởi các vi khuẩn nitrat hóa khác như Nitrobacter Nitrat này sau đóđược rễ hấp thụ vì đây là chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng

Hình 1 3 Sơ đồ quá trình nitrat hóa

Bên cạnh đó, trong nước thải các hợp chất Nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni,nitrat, nitrit và trong các hợp chất hữu cơ Nhìn chung tất cả các loại nước thải đềuchứa hợp chất nitơ, tuỳ theo quy định và yêu cầu về mức độ xử lý mà các bể xử lýnước thải và thiết bị sẽ khác nhau Trong đó các vi sinh vật sử dụng các hợp chất nitơ

có trong nước thải để xây dựng tế bào, một phần tế bào bị chết (phân huỷ nội bào) tiết

ra amoniac và 1 phần tạo ra lượng sinh khối mới Loại vi sinh tự dưỡng đại diện là

Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus,… thực hiện phản ứng oxy hóa amoni với

oxy để sản xuất năng lượng cho mục đích hoạt động sống, sinh trưởng và phát triển

(4) Đồng hóa:

Nitrat và amoniac có trong đất sau đó được thực vật và sinh vật sản xuất sơ cấphấp thụ và kết hợp chúng vào các mô để tổng hợp protein, DNA và các phân tử nitơkhác Sau đó, người tiêu dùng thu được nitơ bằng cách tiêu thụ những thực vật này vàcác động vật khác

(5) Khử nitrat:

Khử nitrat: Khử nitrat là bước cuối cùng của chu trình nitơ, trong đó nitrat(NO3-) được chuyển đổi trở lại thành khí nitơ (N₂) hoặc oxit nitơ (N₂O) Quá trình

này diễn ra với sự trợ giúp của một số bộ phân hủy như Pseudomonas.

Tiếp theo vi sinh tùy nghi, dị dưỡng đại diện là Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus,… khử nitrit, nitrat với chất hữu cơ (chất cho điện tử) để tạo thành khí

nitơ (gọi là quá trình khử nitrat) Khí nitơ là sản phẩm cuối cùng của quá trình xử lýnitơ bằng phương pháp sinh học trong nước thải

Tầm quan trọng của chu trình nitơ

Chu trình nitơ rất quan trọng đối với môi trường của chúng ta vì nitơ cũng làmột yếu tố thiết yếu cần thiết cho thực vật và tất cả các sinh vật sống ở các dạng khácnhau.

Cần thiết cho sinh vật sống: Nitơ về cơ bản cần thiết cho sự hình thành protein,axit nucleic và các hợp chất quan trọng khác trong tất cả các sinh vật sống, bao gồmthực vật, động vật và vi sinh vật

Tăng trưởng và năng suất cây trồng: Nitơ là chất dinh dưỡng chính mà câytrồng cần cho sự sinh trưởng và phát triển Thực vật có thể thu được nitơ cần thiết ởnhiều dạng khác nhau như nitrat và ion amoni mà chúng hấp thụ từ rễ

Độ phì nhiêu của đất: Chu trình nitơ giúp duy trì độ phì nhiêu của đất bằng cáchduy trì mức độ nitơ trong đó Quá trình nitrat hóa chuyển đổi các hợp chất nitơ thànhnitrat mà thực vật có thể sử dụng, do đó làm tăng độ phì nhiêu của đất

Cân bằng môi trường: Chu trình nitơ đóng vai trò rất quan trọng trong việc duytrì mức độ nitơ trong khí quyển trái đất

Chu trình dinh dưỡng toàn cầu: Chu trình dinh dưỡng toàn cầu rộng lớn baogồm nhiều yếu tố thiết yếu như nitơ, cacbon, phốt pho và lưu huỳnh Tất cả các chutrình này được kết nối với nhau và đóng vai trò to lớn trong sự ổn định của sinh quyển

1.3 Chu trình Nitơ toàn cầu và sự xáo trộn do con người gây ra

Sự biến đổi sinh học và phi sinh học của N cùng với sự vận chuyển vật lý của

nó qua khí quyển và sông ngòi dẫn đến vòng tuần hoàn toàn cầu của N ở nhiều dạnghóa học giữa khí quyển, đất liền và các hồ chứa đại dương (Hình 5) Các hoạt độngcủa con người liên quan đến sản xuất lương thực và đốt nhiên liệu hóa thạch đã làmxáo trộn chu trình Nitơ toàn cầu Việc sản xuất ở quy mô công nghiệp và sử dụng rộngrãi các loại phân bón giàu N đã được thực hiện nhờ phát minh ra quy trình HaberBosch để cố định N2 tổng hợp thành amoni (mũi tên đỏ 1, Hình 5) vào đầu thế kỷ 20.Điều này đã cho phép năng suất nông nghiệp, trước đây bị giới hạn bởi lượng N cốđịnh sẵn có trong tự nhiên, tăng lên đến mức hỗ trợ dân số tăng nhanh

Quá trình cố định N2 sinh học liên quan đến nông nghiệp (ví dụ: trồng cây họđậu) và đốt nhiên liệu hóa thạch, thải ra oxit nitơ (NOx), là những nguồn N quan trọngkhác có nguồn gốc từ con người (mũi tên đỏ 2 và 3, tương ứng, Hình 5) Sự kém hiệuquả trong sản xuất lương thực và tính di động cao của N vô cơ dẫn đến sự thất thoátmột phần đáng kể N do con người tạo ra vào đất, nước và khí quyển xung quanh, từ đódẫn đến các dòng lớn hơn trong chu trình N bên trong cũng như tăng tốc các quá trình

mất N (mũi tên đỏ biểu thị chu trình N sinh học, khí thải, khử nitrat/anammox và vậnchuyển, Hình 5).

Lợi ích của Nitơ do con người tạo ra đối với xã hội loài người không phải làkhông gây ra tổn thất đáng kể cho môi trường và sức khỏe con người Galloway vàcộng sự đã giới thiệu thuật ngữ “dòng nitơ” để nhấn mạnh rằng một nguyên tử Nitơ

do con người tạo ra có thể gây ra nhiều tác động môi trường trước khi quá trình khửnitrat loại bỏ nó khỏi Nitơ cố định Những tác động này, mà chúng tôi tóm tắt dướiđây, bao gồm giảm đa dạng sinh học hệ sinh thái do axit hóa và phú dưỡng, tăng khínhà kính và suy giảm tầng ozone, và tỷ lệ mắc các bệnh liên quan đến ô nhiễm khôngkhí cao hơn

Quá trình nitrat hóa đòi hỏi phải thông khí rộng rãi để tạo điều kiện thích hợpcho quá trình oxy hóa amoni thành nitrat (cần 2 phân tử O2 cho mỗi phân tử amoni).Sau đó, cacbon hữu cơ bên ngoài (thường là metanol) được thêm vào để tạo ra quátrình khử nitrat dị dưỡng, làm khử nitrat thành dinitrogen Do đó, việc loại bỏ nitơthông thường rất tốn kém cũng như tốn nhiều năng lượng và tài nguyên, đồng thờicũng tạo ra oxit nitơ, góp phần gây ra hiện tượng nóng lên toàn cầu Để giảm bớtnhững vấn đề này, các cấu hình lò phản ứng khác nhau đã được thực hiện để giảmthiểu việc bổ sung và sục khí carbon bên ngoài (Kuypers, Marchant, and Kartal 2018)

Ví dụ, trong một số hệ thống, một phần nước thải thô giàu cacbon hữu cơ đượcđưa trực tiếp đến bước khử nitrat hoặc ở các hệ thống khác, sục khí gián đoạn được sửdụng để thúc đẩy quá trình nitrat hóa và khử nitrat trong một bể duy nhất Trong thập

kỷ qua, quá trình oxy hóa amoni kỵ khí (anammox) nổi lên như một quá trình thay thế

để loại bỏ nitơ Trong các lò phản ứng sinh học nhỏ gọn, vi khuẩn oxy hóa amoniac

hiếu khí, chẳng hạn như Nitrosomonas europea, chuyển đổi một nửa lượng amoniac

có sẵn thành nitrit trong điều kiện hạn chế oxy, được gọi là 'nitrit hóa một phần' Tiếptheo là quá trình chuyển đổi nitrit với phần amoni còn lại thành khí dinitrogen do vikhuẩn thực hiện quá trình anammox Trong các hệ thống nitrat hóa-anammox mộtphần này, việc sản xuất nitrat bằng các chất oxy hóa nitrit hiếu khí như Nitrospira spp

hoặc Nitrobacter spp không mong muốn vì nó làm giảm hiệu quả loại bỏ nitơ

(Kuypers et al 2018)

Hình 1 4 Loại bỏ nitơ bằng vi sinh vật trong xử lý nước thải (Kuypers et al 2018).

Lò phản ứng nitrat hóa-anammox một phần hạn chế oxy có yêu cầu thông khíthấp hơn so với hệ thống loại bỏ nitơ thông thường, không cần bổ sung carbon hữu cơ

và tạo ra ít oxit nitơ hơn Hiện nay, hệ thống nitrat hóa-anammox một phần đang đượcsử dụng ngày càng nhiều cho nước thải giàu amoni146,147, chẳng hạn như nước thải

từ các bể phân hủy bùn kỵ khí Việc triển khai các hệ thống này trong xử lý nước thải

đô thị quy mô lớn, có nồng độ amoni thấp hơn nhiều, có thể mở đường cho việc xử lýnước thải bền vững hơn Một số vi sinh vật chu trình nitơ được phát hiện gần đây cũng

có thể được áp dụng trong xử lý nước thải Vi khuẩn cổ oxy hóa amoniac thành nitrit

và vi khuẩn oxy hóa amoniac thành nitrat (trong quá trình oxy hóa amoniac hoàn toàn(quy trình comammox)) đã được phát hiện trong các nhà máy xử lý nước thải loại bỏnitơ133,148, nhưng vai trò của chúng trong các hệ thống này vẫn chưa rõ ràng Trongcác hệ thống loại bỏ nitơ hạn chế oxy, chẳng hạn như các lò phản ứng sinh học nitrathóa-anammox một phần, vi khuẩn thực hiện comammox rất có thể sẽ hoạt động nhưcác chất oxy hóa amoniac thông thường tạo ra nitrit Các khả năng mới thú vị để xử lýnước thải được mang lại bởi các vi sinh vật oxy hóa metan kỵ khí phụ thuộc nitrit vàphụ thuộc nitrat mới được phát hiện Một lò phản ứng sinh học kết hợp các sinh vật

methanotroph kỵ khí, chẳng hạn như 'Candidatus Methylomirabilis' spp Những môi

trường đồng nuôi cấy như vậy đã được thiết lập trong điều kiện phòng thí nghiệm; tuynhiên, hệ thống xử lý nước thải toàn diện vẫn chưa được triển khai Trong các hệ

thống này, các chất oxy hóa metan hiếu khí như Methylomonas spp cũng sẽ góp phần

loại bỏ khí mê-tan (Kuypers et al 2018)

Quá trình khử nitrat là một phần quan trọng của chu trình ni tơ, giúp chuyển đổinitrat thành các dạng nitơ khác để duy trì sự cân bằng ni tơ trong môi trường tự nhiên.Quá trình khử nitrat là một quá trình sinh học hoặc hóa học giúp giảm nitrat (NO3-)thành dạng nitơ dinitrogen (N2) hoặc các dạng nitơ khác, như nitrite (NO2-) hoặc nitơammonia (NH3) Quá trình này có thể xảy ra trong tự nhiên và được sử dụng trong cácứng dụng môi trường và xử lý nước để giảm thiểu việc tồn tại quá nhiều nitrat trongmôi trường, đặc biệt trong nước ngầm và dòng nước

chi biến hình có liên quan (Gibberella và Nectria) cũng cho thấy khả năng khử nitratPhần lớn các vi khuẩn phản nitrat là sinh vật dị dưỡng hiếu khí tùy nghi Chúng dễchuyển từ hô hấp hiếu khí sang khử nitrat trong môi trường không có oxy(Ji et al.2015)

Bởi vì nhóm vi khuẩn này rất đa dạng, chúng có thể phát triển mạnh trong cácmôi trường sống bao gồm một số môi trường khắc nghiệt nhiều muối và nhiệt độ cao

Vi khuẩn khử nitrat hiếu khí có thể tiến hành quá trình hô hấp hiếu khí trong đó nitratđược chuyển hóa dần dần thành N2 Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng chất khửnitơ hiếu khí chủ yếu thuộc về vi khuẩn α-, β- và γ-Proteobacteria

Chi Pseudomonas là một trong những chi vi khuẩn phản nitrat lớn nhất được nghiên cứu Đây là lý do người ta hay dùng Pseudomonas làm sinh vật mẫu để nghiên cứu quá trình khử nitrat Trong chi Pseudomonas, và có thể cả trong các sinh vật nhân

sơ, những tiến bộ trong việc xác định đặc điểm sinh hóa của quá trình khử nitơ sử

dụng các phương pháp tiếp cận đã sử dụng với Pseudomonas stutzeri Sự khử nitơ là một đặc điểm ổn định đối với P stutzeri; nó là một trong những vi khuẩn dị dưỡng,

khử nitơ tích cực nhất, và nó đã được coi là một hệ thống kiểu mẫu cho quá trình khửnitơ

Hình 1 5 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen 16S rRNA một phần (1.334 bp) sử dụng MEGA 5.2 Mối quan hệ phát sinh gen của các chất khử nitơ hiếu khí được báo cáo khác nhau đã được tạo ra bằng phương pháp nối hàng xóm (1.000 lần lặp lại) Giá trị Bootstrap trên 50% được hiển thị ở mỗi nút.(Ji et al 2015)

Sự mở rộng nhanh chóng của ngành nuôi trồng thủy sản gây ra những lo ngạiđáng kể về môi trường, đặc biệt là ô nhiễm nitơ So với quá trình chuyển đổi sinh họcnitơ được thực hiện bởi các máy nitrat hóa tự dưỡng và máy khử nitơ kỵ khí thôngthường, vi khuẩn có khả năng khử nitơ dị dưỡng-khử nitrat (HNAD) trong môi trườngnuôi trồng hải sản vẫn chưa được hiểu rõ Fei Huang và cộng sự (2022) 25 loài vikhuẩn HNAD ưa mặn mới đã được phân lập và xác định từ nước nuôi trồng hải sản.Bằng các chủng này được nuôi cấy trong nước nuôi trồng thủy sản tổng hợp (amoniac:

5 mg/L, C/N: 5, độ mặn: 30‰), phân tích động lực học vi sinh vật cho thấy rằng

amoniac chủ yếu được loại bỏ bởi các chi ưu thế của Marinomonas, Marinobacteria, Halomonas, và Cobetia đồng thời có mối tương quan dương với tổng lượng nitơ được

loại bỏ Các chú thích Metagenomic tiết lộ rằng N vô cơ đã được chuyển đổi thành khí

N2 và N hữu cơ bởi các vi khuẩn HNAD này thông qua con đường chuyển hóa nitơ củaquá trình đồng hóa, nitrat hóa một phần, oxy hóa nitroalkane, khử nitrat/nitrit và khửnitrat Trong số đó, do sự cùng tồn tại và hợp tác giữa các loài, Marinomonas

communis và Halomonas titanicae, Marinomonas communis và Cobetia marina, Marinomonas aquimarina và Halomonas titanicae, và Marinomonas aquimarina và Cobetia marina cho thấy hiệu quả loại bỏ N vô cơ và độ ổn định tốt hơn đáng kể Bốn

tập đoàn vi khuẩn mới có thể biến đổi khoảng 60% amoniac ban đầu thành N hữu cơnội bào (18–20%) và khí N (36–38%), cao hơn đáng kể so với các chủng đơn lẻ củachúng Những phát hiện này sẽ góp phần hiểu biết và phát triển vi khuẩn HNAD có thểnuôi cấy được như những ứng cử viên đầy hứa hẹn cho việc kiểm soát ô nhiễm nitơ vàxử lý sinh học nước trong nuôi trồng hải sản hoặc các môi trường nước mặn khác(Huang et al 2020)

Hình 1 6 Tóm tắt con đường xác định, tương tác, loại bỏ nitơ của vi khuẩn khử nitơ dị khử khí hiếu khí từ nước nuôi trồng thủy sản bằng cách sử dụng nuôi cấy tế bào và metagenomics

dưỡng-(Huang et al 2020)

Gần đây, Hu Shu và cộng sự (2022) đã công bố hai chủng an toàn sinh học,

được xác định là Pseudomonas mendocina S16 và Enterobacter cloacae DS'5, được

phân lập từ các ao nuôi trồng thủy sản nước ngọt và cho thấy khả năng khử nitơ dịdưỡng-khử khí đáng kể Trong vòng 48 giờ, hiệu suất loại bỏ nitơ vô cơ ở hai chủng là66,59 %–97,97 % (S16) và 72,27 %–96,44 % (DS'5) Điều kiện tối ưu để loại bỏ nitơhữu cơ của hai chủng là nhiệt độ 20–35°C và tỷ lệ cacbon/nitơ (C/N) là 10–20 trongkhi sử dụng natri citrat làm nguồn cacbon

Hình 1 7 Định danh 80 chủng hoang dã và đánh giá an toàn sinh thái - sinh học của chủng S16 và DS'5

Khuếch đại trình tự đã chứng minh sự hiện diện của các gen khử nitrat ở cả haichủng và kết quả PCR thời gian thực định lượng cho thấy rằng biểu hiện kết hợp củanap + nar sẽ cải thiện tốc độ loại bỏ nitrat ở S16 Hiệu suất loại bỏ nitơ của hai chủngtrong hệ thống nuôi cấy cố định là 79,80 %–98,58 % (S16) và 60,80 %–98,40 %(DS'5) Hình 1.5 A: Nguồn phân lập, nhận dạng rRNA 16 giây, cây phát sinh gen,phân loại và xác định khả năng loại bỏ nitơ của 80 chủng hoang dã Cả hai chủng S16

và DS'5 đều được đánh dấu màu đỏ trong cây phát sinh gen B: Xét nghiệm an toànsinh học chủng S16 và DS'5 Các chữ cái thể hiện sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm(p < 0,05) C: Xét nghiệm độ nhạy kháng sinh của chủng S16 và DS'5 Các thanh tỷ lệ

là 10 mm (Để giải thích các tham chiếu đến màu sắc trong chú giải hình này, ngườiđọc có thể tham khảo phiên bản web của bài viết này.) Nghiên cứu này cho thấy tiềmnăng ứng dụng lớn của hai chủng này trong xử lý nước đuôi nuôi trồng thủy sản (Shu

et al 2022)

Tại Việt Nam, các nhà khoa học trong nước cũng đã và đang nghiên cứu ứngdụng vi khuẩn khử nitrat, nitrat hóa vào công nghiệp xử lý nước thải thủy hải sản, thựcphẩm nhằm giảm thiểu các gốc chứa ni tơ độc hại chủ yếu là các gốc amoni

Vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí khử nitrat (Nitrate Reducing Bacteria - NRB) tạimột số dạng môi trường sinh thái ở Việt Nam, cụ thể là thủy vực nước ngọt, bể xử lýnước thải và đầm nuôi tôm thủy sản ven biển được đánh giá về số lượng và mức đadạng Nguyễn Thị Tuyền và cộng sự đã công bố số lượng NRB cao nhất trong thủyvực nước ngọt và thấp nhất trong mẫu lấy từ bể xử lý nước thải 12 chủng NRB đượcphân lập từ ba dạng môi trường sinh thái trên thể hiện tính đa dạng di truyền cao theophân tích RFLP 16S rADN sử dụng hai enzyme HaeIII và MspI Mẫu thủy vực nướcngọt, bể xử lý nước thải và đầm nuôi tôm thủy sản ven biển được sử dụng trong thínghiệm làm giàu NRB với nguồn cơ chất Na-lactat và Na-benzoat Phân tích điện dibiến tính (DGGE) tập hợp NRB trong các mẫu làm giàu cho thấy tính đa dạng cao,trong đó Ochrobactrum và Paracoccus là hai nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế ở mỗi tập

hợp Hai chủng đại diện Ochrobactrum sp LF1 và Paracoccus sp BB3 được phân lập

và nghiên cứu khả năng loại bỏ nitrat trong môi trường nuôi cấy (Tuyền et al 2009)

Hoàng Phương Hà và cộng sự (2008) cũng đã công bố đặc điểm sinh học 17chủng vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ nuôi tôm tại Quảng Bình và Hà Tĩnh [3],

có các đặc điểm thuộc chi Nitrosomonas, Nitrosobacteria và Nitrospira Gần đây,

nhóm tác giả này (2020) cũng đã công bố phân lập được chủng BL 5 được xác định là

Pseudomonas sp BL5 ở hồ nuôi tôm nước lợ tại Bạc Liêu, có khả năng khử nitrIte

trong cả hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí bằng thực nghiệm hóa sinh và giải trình đoạngen 16s RNA (Hoàng Phương Hà et al 2020)

Từ bùn thải của bể xử lý sinh học lấy từ Khu liên hợp xử lý chất thải rắn NamBình Dương, phân lập được 03 chủng Nitrobacter spp Trong đó, chủng NitrobacterNB1 có khả năng xử lý nitrit hiệu quả nhất Trên môi trường Winogradsy có nồng độmuối thay đổi từ 5 – 25‰, hiệu suất xử lý nitrit sau 24 giờ của chủng này đạt từ 97.63

- 97.92% Ở nồng độ tối thiểu 103 tế bào/ ml môi trường, chủng này có hiệu suất xử lýnitrit đạt đến 99.79% sau 24 giờ Khi thử nghiệm với nước rỉ rác ở quy mô phòng thí

nghiệm, khả năng xử lý nitrit chủng Nitrobacter NB1 đạt 67.77% sau 4 giờ(Trần Ngọc

Hùng and Huỳnh Thị KIm Trang 2017)

Nguyễn Văn Minh và cộng sự (2012) đã phân lập và sàng lọc vi khuẩn nitrathóa từ 15 mẫu nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng và ao nuôi cá tra Trong 3 chủng đượclựa chọn có những đặc điểm phù hợp với nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit dị dưỡng, thuộcchi Bacillus [4]

Võ Thị Xuân Hương và cộng sự (2018) đã phân lập và nhận diện vi khuẩn phângiải nitrat trong dưa cải muối chua bằng phương pháp thực nghiệm, đã ứng dụng vikhuẩn khử nitrat phân lập được vào sản phẩm dưa cải muối chua nhằm giảm thiểu hàmlượng nitrat (Hương et al 2018)

Các nghiên cứu trong nước đều phân lập được các chủng vi khuẩn nitrat hóa từcác nguồn thông thường thông qua các kỹ thuật thực nghiệm hóa sinh Những nghiêncứu phân lập chủng vi khuẩn khử nitrat cũng như sử dụng công cụ tin sinh còn hạnhẹp

Đặc điểm sinh hóa quá trình khử nitrat

Khử nitrat bằng vi sinh vật là một quá trình hô hấp sinh học bao gồm quá trìnhkhử liên tiếp các hợp chất nitơ: nitrat, nitrit, oxit nitric và oxit nitơ thành nitơ Khửnitrat bằng vi sinh vật được coi là hiệu quả hơn ở nồng độ nitrat cao và kinh tế hơn sovới các kỹ thuật hóa lý để loại bỏ nitrat (thẩm thấu ngược, trao đổi ion, điện phân, khửnitrat hóa học, phương pháp hấp phụ) Đó là một quá trình hô hấp dẫn đến sự khử nitrattrong khi chất cho điện tử (chất hữu cơ, hydro ) bị oxy hóa Nitrat dần dần bị khửthành nitrit, oxit nitric, oxit nitơ và cuối cùng thành dinitrogen trong bốn phản ứng liêntiếp được xúc tác bởi bốn enzyme khử của vi sinh vật Bốn bước được xúc tác bởi bốnenzyme khác nhau (reductase) (Albina et al n.d.)

Hình 1 8 Phản ứng tổng quát quá trình khử nitrat ở vi khuẩn(Albina et al n.d.).

Quá trình khử nitrat của vi sinh vật thường được thực hiện bởi vi khuẩn dịdưỡng bằng cách sử dụng, ví dụ, axetat làm chất cho điện tử (phản ứng (1)) Khi môitrường hạn chế hơn, không có chất hữu cơ, hydro trở thành nguồn điện tử thay thế cho

vi khuẩn (phản ứng (2)) Quá trình khử nitrat của vi sinh vật, dù dị dưỡng hay

hydrootrophic, luôn đi kèm với việc tạo ra các ion OH−, ảnh hưởng đến độ pH của môi trường nếu nó không được đệm (Albina et al n.d.)

5 CH3COOH + 8 NO3− → 10 CO2 + 4 N2 + 6 H2O + 8 OH− (1)

2 NO3− + 5 H2 → 4 H2O + N2 + 2 OH− (2)

Hô hấp nitrat là quá trình trong đó các electron được chuyển từ chất cho (chấthữu cơ, hydro) sang chất nhận nitrat (Hình 2) Phản ứng oxy hóa khử này dọc theochuỗi hô hấp tạo ra một dải proton xuyên qua màng tế bào vi khuẩn, cuối cùng đượcchuyển hóa thành năng lượng dưới dạng ATP bởi ATP synthase (Albina et al n.d.)

Đầu tiên, các electron từ nguồn điện tử chính (acetate, hydro, metanol, v.v.) táitạo các co-enzym, chẳng hạn như NADH, H+ NADH, H+ hoặc các chất cho điện tửtiềm năng khác như succinate, giúp chuyển điện tử của chúng sang chuỗi hô hấp [31].Sau đó, các electron được vận chuyển qua chuỗi hô hấp bởi ba loại chất vận chuyểnđiện tử: (i) Coenzym Q được gọi là Ubiquinone (UQ) ở trạng thái oxy hóa vàUbiquinol (UQH2) ở trạng thái khử, (ii) phức hợp cytochrome bc1, và (iii) họ proteincytochrome c (Cyt c) chứa heme c [31,32] Mỗi người trong số họ có thể tương tácvới một số reductase [29,30]

Hình 1 9 Sơ đồ biểu diễn chuỗi hô hấp chính của quá trình khử nitrat (Albina et al n.d.).

Loại enzyme reductase đầu tiên trong quá trình khử nitrat là nitrat reductase(Nar) Ba loại phức hợp Nar của vi khuẩn đã được mô tả Phức hợp màng NarGHI làmột molybdoenzym, trung tâm hoạt động của nó đối diện với tế bào chất Phức hợpnày thường nằm cạnh protein màng narK; nó là một chất chống phản ứngNO3−/NO2− hấp thụ NO3− và bài tiết NO2−, Hình 2 Nap enzyme khử ngoại chất

làm giảm nitrat nhưng không thể đóng góp vào gradient proton Nitrate reductase cuốicùng (Nas), là một phức hợp ngoại chất khá khác biệt so với các hệ thống reductasekhác, vì nó được sử dụng trong quá trình khử nitrat đồng hóa [33].

Nitrit được tạo ra từ quá trình khử nitrat sau đó được khử bằng nitrit reductase(Nir) Hai loại enzyme ngoại chất đã được mô tả: cd1-nitrite reductase với vị trí hoạtđộng dựa trên heme và nitrite reductase với vị trí hoạt động dựa trên đồng [34]

Sản phẩm của quá trình khử nitrit, oxit nitric, được biến đổi bởi enzyme nitricoxit reductase (Nor), một thành viên của họ heme-đồng oxydase cũng có khả năng khửoxy [35] Sự khử cuối cùng được thực hiện bởi nitrous oxit reductase Nó là mộtenzyme ngoại chất có chứa hai lõi Cu [29,30,36]

Quy định khử Nitrat, tích lũy Nitrit

Nhiều vi khuẩn khử nitrat là kỵ khí tùy ý: khi có oxy, quá trình khử nitrat bị ứcchế và chỉ còn hô hấp hiếu khí vì nó có sự bảo tồn năng lượng tự do Gibbs hiệu quảnhất Khi O2 ở mức thấp và NO3− có sẵn, quá trình khử nitrat được bắt đầu Các chấttrung gian khử nitrat NO2− và NO là các hợp chất độc hại đối với tế bào vi khuẩn[10,11,12,29], nồng độ bên trong của chúng được điều chỉnh dưới mức gây độc tế bàotương ứng với mM và nM [30,31] Do đó, O2, NO3−, NO2− và NO là một trongnhững tín hiệu chính ảnh hưởng đến quá trình khử nitrat Sự điều hòa quá trình khửnitrat của vi sinh vật ở cấp độ phiên mã đã được nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử

dụng các chủng khử nitrat mô hình như Paraccocus denitrificans hoặc Pseudomonas aeruginosa Ở vi khuẩn khử nitrat, sự điều hòa phiên mã gen khử nitrat hóa được quản

lý bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ FNR (Fumarate và Nitrate reductase điều hòa)[37] Ví dụ, ở P denitrificans, có ba loại FNR liên quan: NarR (nhạy cảm với NO3−

và NO2−), NnrR và FnrP (nhạy cảm với O2 và NO) Mỗi loại kích thích phiên mã cácgen reductase khác nhau (Hình 3)

Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn quá trình điều hòa phiên mã sự biểu hiện của các gen mã hóa các enzyme khác nhau liên quan đến quá trình khử nitrat ở P denitrifican

Ở chủng khử nitrat được nghiên cứu kỹ lưỡng P aeruginosa, sự điều hòa được

kiểm soát bởi NarXL (nhạy cảm với NO3− và NO2−), ANR, DNR và NosR (nhạy

cảm với NO và O2) [38,39,40,41] Tóm lại, ở vi khuẩn khử nitrat, ở cấp độ gen, có sựđiều hòa cơ chất với NO3− và điều hòa sản phẩm từ NO và NO2−, mục đích của nó làcân bằng nồng độ bên trong của các hợp chất gây độc tế bào như NO2− và NO [31].

Vì vậy, trong nuôi cấy ở điều kiện thuận lợi, các chất trung gian như NO2− và NOkhông nên tích lũy

Tuy nhiên, ở mức độ trao đổi chất, sự cạnh tranh của enzyme khử có thể gây ra

sự tích tụ NO2− hoặc N2O Trong chuỗi hô hấp, các chất vận chuyển UQH2 có thểtương tác với ba chất khử (Nar, Nir và Nos) và các chất vận chuyển Cyt c với hai chấtkhử (Nir và Nos) [42,43] Do đó, UQH2 và Cyt c được thu hút bởi một số chất nhậnđiện tử cùng một lúc và tùy thuộc vào điều kiện môi trường, chẳng hạn như độ pH, cácchất vận chuyển điện tử có thể ưu tiên chuyển các điện tử của chúng sang mộtreductase hơn là một loại khác [43,44] Do đó, ở độ pH axit (5,5), quá trình khử nitratphân đoạn đã được quan sát thấy ở P denitrificans [43], tức là các tác giả quan sát thấy

sự tích tụ NO2− và N2O vì UQH2 và Cyt c ưu tiên chuyển electron sang một sốreductase, trong khi ở pH 8,5 thì có không có sự tích lũy: UQH2 và Cyt c chuyểnelectron đồng thời sang tất cả các reductase Hơn nữa, chất cho điện tử cũng tác độngđến sự tích lũy nitrit tùy thuộc vào số lượng điện tử mà nó có khả năng cung cấp.Trong một nghiên cứu, sự tích lũy nitrit xảy ra khi nuôi cấy Pseudomonas stutzeriđược cho ăn 5 mM axetat (hai nguyên tử cacbon) nhưng không xảy ra với 5 mMbutyrate (bốn nguyên tử cacbon) [45] Butyrate có khả năng giải phóng 20 electrontrong quá trình oxy hóa, trong khi axetat chỉ giải phóng 8 electron, do đó nó cung cấp

đủ điện tử và tránh sự cạnh tranh giữa các reductase để nhận điện tử Do đó, sự tíchlũy các chất trung gian như nitrit có thể xảy ra do điều kiện môi trường và bất chấpquy định phiên mã nghiêm ngặt Để ngăn chặn sự tích tụ nitrit trong tế bào, vi khuẩnsử dụng các chất vận chuyển như narK để bài tiết nitrit [46]

Trong quần thể vi khuẩn hỗn hợp, hai kiểu hình vi khuẩn riêng biệt có thể ảnhhưởng đến trạng thái cân bằng nitrat và nitrit:

(i) vi khuẩn hô hấp nitrat không thể khử nitrit,

(ii) (ii) vi khuẩn khử cả 2 loại nitrat và nitrit thành dinitrogen [47,48,49,50] Tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn hô hấp nitrat cao hơn và chúng nhanh chóngchiếm ưu thế Ví dụ, tốc độ tăng trưởng cao gấp ba lần đã được quan sát thấy đối với

vi khuẩn hô hấp nitrat [51] Do đó, khi có mặt nitrat, vi khuẩn hô hấp nitrat chiếm ưuthế sẽ gây ra sự tích tụ nitrit Sau khi nitrat được tiêu thụ, các chất khử nitơ thực sựtiếp tục phát triển bằng cách sử dụng nitrit và trở nên chiếm ưu thế Tóm lại, trong môi

trường nuôi cấy được tiêm chủng hỗn hợp, quần thể vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy, chẳng hạn như độ pH kiềm, sẽ ảnh hưởng đến sự tích tụ nitrit.

axit béo chính của tế bào Tiếp theo là C fucosivorans sp nov đã được đề xuất đặt tên

là SE3T vì đây là chủng loại có liên quan đến việc sản xuất carotenoid (Aviles andKyndt 2021)

Cellulosimicrobium, trước đây gọi là loài Oerskovia, là trực khuẩn gram dương

thuộc bộ Actinomycetales Chi Cellulosimicrobium thuộc họ Promicromonosporaceae, ngành Actinobacteria, lần đầu tiên được đề xuất bằng cách phân loại lại Cellulomonas cellulans thành Cellulosimicrobium cellulans bởi

Schumann et al vào năm 2001 và được sửa đổi bởi Brown et al vào năm 2006 vàYoon và cộng sự vào năm 2007 (Rivero et al 2019) Cho đến nay, 8 loài đã được

công bố hợp lệ là Cellulosimicrobium cellulans, Cellulosimicrobium variabile, Cellulosimicrobium funkei, Cellulosimicrobium terreum, Cellulosimicrobium marinum, Cellulosimicrobium aquatile, Cellulosimicrobium composti và Cellulosimicrobium fucosivorans Ngoài ra, Cellulosimicrobium arenosum đã được

công bố một cách hiệu quả nhưng cho đến nay vẫn chưa được xác nhận Dựa trên kếtquả phân tích phát sinh loài và sự khác biệt về đặc điểm phân loại hóa học,

Ngoài ra, C aquatile sau đó được xác định là từ đồng nghĩa dị hình của C.

funkei (Brown et al 2006) dựa trên phân tích liên quan đến DNA-DNA Gần đây,

xylanosome từ các chi Cellulosimicrobium đã được chứng minh là có hoạt tính phân

hủy cao chống lại các polysaccharide không tan trong nước của hemiaellulose Một số

chủng mới như Paenibacillus protaetiae, Gryllotalpicola protaetiae và Protaetiibacter gutis đã được phân lập từ côn trùng Protaetia brevitarsis seulensis Chúng tôi lập luận

rằng ruột của loài côn trùng ăn cỏ này có chứa các vi khuẩn khác có khả năng phânhủy các polysaccharide cứng đầu Phân tích tin sinh học trong công nghệ sinh học(Han et al 2022)

Các thành viên của chi Cellulosimicrobium là Gram dương, catalase dương tính

và có MK-9(H4) là quinone hô hấp chiếm ưu thế Anteiso-C15:0, iso-C15:0, iso-C16:0

và anteiso-C17:0 là các axit béo chính Đường toàn tế bào là fucose, galactose,glucose, mannose và rhamnose hoặc galactose và ribose (Brown et al 2006)

1.4 Phân tích tin sinh

1.4.1 Tin sinh học

Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệcủa ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính và toán sinh học(biomathematics) để giải quyết các vấn đề sinh học

Tin sinh học và sinh học tính toán: Những nghiên cứu trong ngành tin sinh học(bioinformatics) thường trùng lặp với sinh học tính toán (computational biology) hoặcsinh học hệ thống (system biology) Những lĩnh vực nghiên cứu chính của nó baogồm:

 Bắt cặp trình tự (sequence alignment)

 Bắt cặp cấu trúc protein (protein structural alignment)

 Dự đoán cấu trúc protein (protein structural prediction)

 Dự đoán biểu hiện gen (gene expression)

 Tương tác protein-protein (protein-protein interaction)

 Mô hình hoá quá trình tiến hoá

Thuật ngữ tin sinh học và sinh học tính toán thường được dùng hoán đổi chonhau, nhưng nói một cách nghiêm túc thì cái trước là tập con của cái sau Mối quantâm chính ở tin sinh học và sinh học tính toán là việc sử dụng các công cụ toán học đểphân chiết các thông tin hữu ích từ các dữ liệu hỗn độn thu nhận được bằng các kỹthuật sinh học với lưu lượng và mức độ lớn

Như vậy, về phương diện này lĩnh vực khai phá dữ liệu (data mining) có sựtrùng lắp với sinh học tính toán Bài toán đặc trưng trong sinh học tính toán bao gồmviệc lắp ráp (assembly) những trình tự ADN chất lượng cao từ những đoạn ngắn ADNđược thu nhận từ kỹ thuật xác định ADN và việc dự đoán quy luật điều hoà gen (generegulation) với dữ liệu từ các mARN, microarray hay khối phổ (mass-spectrometry)

Các lĩnh vực nghiên cứu của tin sinh học gồm:

 Hệ gen học phân tích trình tự

 Tìm kiếm gen

 Tìm kiếm các đột biến

 Phân loại học phân tử

 Bảo tồn đa dạng sinh học

 Phân tích chức năng gen hay biểu hiện nhận diện chuỗi polypeptid dựđoán cấu trúc của protein các hệ thống sinh học kiểu mẫu

 Phân tích hình ảnh mức độ cao

 Công cụ phần mềm

Việc so sánh các gen cùng một loài hay giữa các loài với nhau có thể cho thấy

sự tương đồng về chức năng của các protein hay mối quan hệ phát sinh chủng loài giữacác loài này thể hiện trên cây phát sinh chủng loài (phylogenetic tree) Với sự tăngtrưởng khổng lồ của dữ liệu này, việc phân tích trình tự ADN một cách thủ côngkhông thể thực hiện nổi Và bởi thế, ngày nay các chương trình máy tính được sử dụng

để giúp tìm các trình tự tương đồng trong bản đồ gen (genome) của hàng loạt sinh vật

dù số lượng nucleotide trong trình tự có đến hàng tỷ Và cũng từ các chương trình này

mà có thể tìm kiếm những trình tự ADN không giống nhau hoàn toàn do các đột biếnnucleotide

Những giải thuật bắt cặp trình tự (sequence aligenment) cũng được áp dụngngay cả trong quá trình xác định ADN (DNA sequencing) là kỹ thuật xác định trình tựnhỏ (shotgun sequencing) Bởi kỹ thuật xác định trình tự hiện nay không thể tiến hànhtrên cả một phân tử ADN lớn, nên xác định trình tự nhỏ có kích thước khoảng 600-800nucleotide là hợp lý Kỹ thuật này đã được công ty Celera Genomics áp dụng khi xácđịnh gen của vi khuẩn Heamophilus influenza Sau đó, những đoạn trình tự nhỏ nàyđược sắp xếp thứ tự và nối lại qua việc bắt cặp trình tự của những đầu gối lên nhau(overlap) tạo nên một trình tự genome hoàn chỉnh Nhờ kỹ thuật xác định chuỗi trình

tự nhỏ đã tạo ra chuỗi dữ liệu một cách nhanh chóng nhưng việc sắp xếp các chuỗitrình tự ADN nhỏ là khá phức tạp, cho nên khi phân tích bản đồ gen người (Humangenome) các nhà tin sinh học với các siêu máy tính (máy DEC Alpha ra đời năm 2000)phải làm việc hàng tháng mới có thể xếp đúng trình tự những đoạn ADN ngắn lại vớinhau

Hiện nay, kỹ thuật xác định trình tự nhỏ đang được ưu tiên để giải mã genome

và giải thuật lắp ráp genome (genome assembly algorithms) là một trong những lĩnhvực nóng của tin sinh học Việc tìm kiếm tự động các gen và những trình tự điều khiểnbên trong một gen cũng là một khía cạnh khác của tin sinh học Như ta đã biết, khôngphải là tất cả nucleotides bên trong một genome đều là gen Phần lớn các ADN tronggenome của các sinh vật bậc cao là các đoạn ADN không phục vụ cho một nhiệm vụ

cụ thể nào đó là những đoạn intron Tin sinh học còn giúp kết nối giữa genomics vàprotenimics như việc sử dụng trình tự ADN để từ đó nhận dạng protein

Các phân tích gen đánh dấu dựa trên trình tự của một vùng gen cụ thể để tiết lộtính đa dạng và thành phần của các nhóm phân loại cụ thể có trong một mẫu môitrường Các gen đánh dấu chính được sử dụng trong hệ sinh thái vi sinh vật là gen 16SrRNA (để phân tích sự hiện diện của vi khuẩn cổ và vi khuẩn) vùng đệm được phiên

mã bên trong (ITS) (để mô tả thành phần của cộng đồng nấm) và 18S rRNA (để báocáo sự xuất hiện của sinh vật nhân chuẩn) Cả hai phương pháp đều đã được sử dụngrộng rãi để mô tả đặc điểm của các cộng đồng vi sinh vật, đặc biệt là kết hợp với cáccông nghệ giải trình tự thông lượng cao(Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, andTrương Nam Hải 2015)

16S rRNA là viết tắt của axit ribonucleic ribosome 16S (rRNA), trong đó S(Svedberg) là đơn vị đo lường (tốc độ lắng đọng) rRNA này là thành phần quan trọngcủa tiểu đơn vị nhỏ (SSU) của ribosome nhân sơ cũng như ty thể và lục lạp Mã hóađoạn DNA cho rRNA được gọi là gen rRNA hoặc rDNA Với mục đích giải trình tự,thông tin trình tự được lấy từ gen 16S vì DNA dễ xử lý và giải trình tự hơn nhiều sovới RNA Biến thể di truyền trong gen 16S được tìm thấy ở sinh vật nhân sơ là đủ đểsử dụng trong phân tích phát sinh gen cho phạm vi phân loại rộng Nó được sử dụngthành công để suy ra mối quan hệ phát sinh gen giữa các ngành đồng thời được sửdụng để so sánh giữa các loài trong cùng chi Trên thế giới hiện nay có nhiều ngânhàng dữ liệu nổi tiếng như: NCBI - Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinhhọc (National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)của Mĩ; EMBL-Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử European Molecular BiologyLaboratory: http://www.embl.org), DNA Data Bank of Japan: tạihttp://www.ddgj.nig.ac.jp) của NHật, EzBioCloud.net…

Phân tích toàn bộ bộ gen WGS nhằm mục đích sắp xếp tất cả các bộ gen hiện

có trong một mẫu môi trường để phân tích tính đa dạng sinh học và khả năng hoạtđộng của cộng đồng vi sinh vật được nghiên cứu Khi toàn bộ vật liệu di truyền của

một mẫu được phục hồi, có thể mô tả đặc điểm đa dạng hoàn chỉnh của môi trườngsống, bao gồm vi khuẩn cổ, vi khuẩn, sinh vật nhân chuẩn, vi rút và plasmid, cũng nhưhàm lượng gen của nó.

Hình 1.11 Sơ đồ trình bày các bước chính cần thiết để phân tích dữ liệu có nguồn gốc metagenomics của WGS Phần mềm liên quan đến từng bước được in nghiêng.

Từ năm 2005, một số phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo generation sequencing -NGS) đã được phát triển và đề xuất NGS đề xuất một cáchmới để giải trình tự, bao gồm nhiều cách tiếp cận khác nhau phụ thuộc vào sự hợp nhấtcủa việc chuẩn bị mẫu, xác định thứ tự của các bazơ, sắp xếp trình tự và tập hợp bộgen [12] Ưu điểm chính của NGS so với các phương pháp truyền thống là khả nănggiải trình tự nhiều gen và làm nổi bật hàng triệu biến thể cùng một lúc Các ưu điểmkhác bao gồm đầu vào DNA tối thiểu, thời gian xử lý nhanh hơn; NGS đã cách mạnghóa tốc độ khám phá gen và gen, đồng thời nâng cao hiểu biết của chúng ta về cơ chếphân tử của bệnh và các lựa chọn điều trị tiềm năng Những tiến bộ kỹ thuật trong cácphương pháp giải trình tự này (thay thế dán nhãn phóng xạ bằng thuốc nhuộm huỳnhquang và điện di trên gel bằng điện di mao quản) đã giới thiệu khả năng tự động hóatrong các phương pháp giải trình tự và tăng cường khối lượng giải trình tự lên hàngnghìn cặp bazơ trong một lần chạy [13].

(Next-Các thiết bị NGS có thể tạo ra vài tỷ nucleotide trong thời gian rất ngắn và chiphí thấp Những khả năng này cho phép các phương pháp NGS sử dụng trong một sốlĩnh vực như giải trình tự toàn bộ bộ gen (whole-genome sequencing -WGS), giải trình

tự toàn bộ exome (wholeexome sequencin WES/ES), gọi biến thể (variant calling VC), giải trình tự nhắm mục tiêu (targeting sequencing-TS) và giải trình tự phiên mã(transcriptome sequencing -TCS) Trong vài năm qua, việc sử dụng các nền tảng giảitrình tự DNA mới nhất trong một số lượng lớn các dự án nghiên cứu đã giúp cải thiệncác phương pháp và công nghệ giải trình tự, cho phép chúng ta giải trình tự bộ gen củatất cả các loài với chi phí rất thấp và tốc độ cao Hình 1.11 là Sơ đồ trình bày cácbước chính cần thiết để phân tích dữ liệu có nguồn gốc metagenomics của WGS

-1.4.3 Sự phát triển của công nghệ giải trình tự thông lượng cao

Năm 1953 khám phá về cấu trúc xoắn kép của phân tử ADN lần đầu tiên đượccông bố Các phương pháp giải trình tự DNA trong vòng 60 năm qua đã phát triển rấtnhanh và có thể nói là một ví dụ nổi bật về sự tiến bộ dẫn đến sự cải thiện và nâng caođáng kể về việc giảm chi phí, thông lượng, khả năng và ứng dụng cao Lịch sử giảitrình tự DNA bắt đầu khi hai phương pháp cơ bản, tức là giải trình tự Sanger [4] vàphương pháp của Maxam và Gilbert [5], được giới thiệu Sự phát triển trong phản ứngtrùng hợp chuỗi [6, 7], sự sẵn có của các enzyme chất lượng tốt để sửa đổi DNA vàtrình tự tự động huỳnh quang đã cho phép giải trình tự bộ gen người đầu tiên vào năm