Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi nấm phân lập từ vùng biển nha trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ------ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

- -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM

PHÂN LẬP TỪ VÙNG BIỂN NHA TRANG

Cán bộ hướng dẫn : ThS LÊ NHÃ UYÊN

ThS PHAN THỊ HOÀI TRINH Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ THANH

Mã số sinh viên

Lớp

: 55132666 : 55SH2

Nha Trang, tháng 6 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

- -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM

PHÂN LẬP TỪ VÙNG BIỂN NHA TRANG

Cán bộ hướng dẫn : ThS LÊ NHÃ UYÊN

ThS PHAN THỊ HOÀI TRINH Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ THANH

Mã số sinh viên

Lớp

: 55132666 : 55SH2

Nha Trang, tháng 6 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Lê Nhã Uyên (Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại Học Nha Trang) và ThS Phan Thị Hoài Trinh (Cán bộ phòng Công nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang), những người đã tận tình dìu dắt, hưỡng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo đã tận tình chỉ dạy và cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt bốn năm học qua

Tôi chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, các anh chị phòng Công nghệ sinh học biển, đặc biệt là chị Ngô Thị Duy Ngọc đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi thực hiện đồ án này Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, cổ vũ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện đồ án

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 6 năm 2017 Sinh viên

Phạm Thị Thanh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 3

1.2 Đặc điểm của nấm sợi 4

1.2.1 Hình thái, cấu tạo 4

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 6

1.2.3 Phương thức sinh sản 8

1.2.4 Vai trò của nấm sợi 9

1.2.5 Phân loại nấm sợi 9

1.3 Khả năng hình thành chất kháng sinh từ nấm sợi 11

1.3.1 Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh 11

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh 11

1.3.3 Khả năng sinh kháng sinh của vi nấm 12

1.3.4 Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh 15

1.3.5 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh từ vi nấm biển 17

1.4 Ứng dụng của chất kháng sinh từ vi nấm biển trong thực tiễn 19

1.4.1 Điều trị hiện tượng lờn thuốc của vi nấm 19

1.4.2 Phòng chống bệnh hại cây trồng 20

1.4.3 Phòng chống côn trùng hại cây trồng 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22

2.2.1 Vật liệu 22

2.2.1.1 Vi nấm biển 22

2.2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 22

2.2.2 Hoá chất 22

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 23

2.2.4 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Quy trình phân lập vi nấm từ vùng biển Nha Trang 24

2.3.2 Quy trình sàng lọc các chủng vi nấm biển có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn 26

2.3.3 Phương pháp định danh vi nấm biển và quan sát vi thể nấm sợi 28

2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men lên hoạt tính kháng khuẩn của vi nấm biển tuyển chọn 28

2.3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 28

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường lên men 29

2.3.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập vi nấm từ mẫu biển thu thập ở vùng biển Nha Trang 30

3.2 Sàng lọc khả năng sinh các chất kháng khuẩn của các chủng vi nấm biển và tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao 36

3.3 Kết quả xác định đặc điểm hình thái và định danh chủng vi nấm biển 40

3.3.1 Đặc điểm hình thái 40

3.3.2 Định danh chủng vi nấm biển 41

3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi nấm biển tuyển chọn 42

3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 42

3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường lên men 43

3.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

1 Kết luận 47

2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 57

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu sinh vật biển thu nhận tại Nha Trang 30

Bảng 3.2 Danh sách và đặc điểm hình thái các chủng vi nấm biển được phân

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Vị trí lấy mẫu vi sinh vật biển tại Đầm Bấy Nha Trang, Khánh Hòa 3

Hình 1.2 Các loại sợi nấm 5

Hình 1.3 Cấu trúc sợi nấm 5

Hình 1.4 Sinh sản hữu tính ở nấm sợi 9

Hình 1.5 Khuẩn lạc Penicillium kháng tụ cầu vàng S aureus năm 1928 13

Hình 1.6 Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh 17

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình phân lập vi nấm biển 24

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi nấm biển 26

Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng vi nấm biển 01NT.1.1.5 trên môi trường CYA 40

Hình 3.2 Cuống sinh bào tử của chủng nấm biển 01NT.1.1.5 40

Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của chủng 01NT.1.1.5 42

Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của chủng 01NT.1.1.5 44

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của chủng 01NT.1.1.5 45

MỞ ĐẦU

Biển là nguồn cung cấp phong phú và đa dạng các chất có hoạt tính sinh học và hiện đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới Đã có rất nhiều hợp chất được phát hiện từ sinh vật biển sinh sống ở những nơi có điều kiện rất khắc nghiệt như độ mặn, áp suất cao hơn, nhiệt độ thay đổi, pH [25] Chính vì thế, những hợp chất này có những đặc tính vô cùng quý báu, là nguồn tiềm năng cung cấp dược liệu chữa bệnh cho con người [23],[ 75] Các hợp chất thu được có hoạt tính sinh học vô cùng đa dạng bao gồm: tính kháng khuẩn [18],[ 34],[ 38],[ 92]; chống viêm [69]; gây độc tế bào [51],[ 78]; kháng nấm [44]; kháng virus và kháng u [63],[ 65],[ 68]

Trong số các vi sinh vật biển thì vi nấm là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trên thế giới [18],[ 70],[ 85] Cụ thể, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 272 hợp chất

tự nhiên mới có nguồn gốc từ vi nấm biển [41] Theo các tác giả như Pietra (1997) [73], Rodrigues et al (2000) [83] và Raghukumar et al (1994) [76], vi nấm biển là nguồn sinh vật có tiềm năng trong việc sinh các hợp chất thứ cấp, chứa một lượng lớn các enzyme, đặc biệt là một lượng lớn các chất kháng sinh [66],[ 83] Theo Ebel R (2010) [50] thì điều này mở ra những hướng nghiên cứu ứng dụng trong y học, trong phát triển thuốc [53],[ 62] và trong ngành công nghiệp thực phẩm [91]

Ở Việt Nam cũng như các nước đang phát triển, việc lạm dụng thuốc kháng sinh

đã gây nên sự xuất hiện của nhiều chủng vi sinh vật kháng thuốc nên việc điều trị bằng kháng sinh trở nên rất khó khăn Vấn đề tìm kiếm chất kháng sinh mới, có nguồn gốc

từ thiên nhiên do các vi sinh vật tiết ra chống lại các vi sinh vật gây bệnh đã lờn thuốc đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đó là một việc làm vô cùng cấp thiết và quan trọng [26] Trong đó có một số lượng lớn chất kháng sinh mới được tìm thấy từ nấm biển được chứng minh bởi Rateb et al (2011) [79] và Blunt et al (2015) [39]

Việt Nam là một quốc gia có chiều dài bờ biển hơn 3.200 km, sở hữu một nguồn tài nguyên biển vô cùng phong phú, đa dạng Tuy nhiên, việc nghiên cứu và khai thác lợi ích từ vi nấm biển vẫn còn tương đối mới và chưa thực sự được quan tâm,

đặc biệt là ở vùng biển Nha Trang

Do vậy, trong khuôn khổ luận văn tốt nghiệp này, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi nấm phân lập từ vùng biển Nha Trang”

 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và tuyển chọn chủng vi nấm, xác định khả năng kháng khuẩn và điều kiện lên men tối ưu của chủng vi nấm tuyển chọn

 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi nấm từ một số mẫu bọt biển, san hô mềm, rong biển và trầm tích thu tại vùng biển Nha Trang

- Sàng lọc khả năng kháng khuẩn của các chủng vi nấm phân lập được đối với một số chủng vi sinh vật kiểm định và tuyển chọn chủng có khả năng kháng khuẩn cao

- Định danh bằng phương pháp giải trình tự và xác định đặc điểm hình thái của chủng

vi nấm tuyển chọn trên môi trường đặc trưng

- Xác định điều kiện lên men tối ưu của chủng vi nấm biển tuyển chọn qua các thông số: Thời gian, nồng độ muối và pH môi trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

Vị trí địa lý thủy văn của Đầm Bấy - Nha Trang, Khánh Hòa

Khánh Hòa là một tỉnh ven biển miền Trung và nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, trong khoảng 11o41’53” - 12o52’12’’ vĩ độ Bắc và 108o40’12’’ - 109o30’00’ kinh Đông Độ dài bờ biển xấp xỉ 200 km Khánh Hòa có khoảng 200 hòn đảo với tổng diện tích khoảng 600 km2 Các vịnh và đầm phá phân bố liên tục và dọc theo đường bờ biển Khánh Hòa: Vũng Rô - Đại Lãnh, Vũng Bến Gỏi - Vịnh Vân Phong, Vịnh Bình Cang, Đàm Nha Phu và Đầm Thủy Triều - Vịnh Cam Ranh Hệ thống Vịnh góp phần vào đặc trưng về địa mạo, trầm tích cũng như các yếu tố thủy động lực làm cho vùng biển Nha Trang phức tạp, đa dạng và phong phú về nguồn lợi vi sinh vật (VSV) [4] Đầm Bấy là một thủy vực nhỏ nằm ở phía Đông Nam đảo Hòn Tre trong vịnh Nha Trang Đầm Bấy có diện tích 132,5 ha, với tổng thể tích nước ở mực nước triều trung bình khoảng 12.649.842 m3; độ rộng cửa 853 m, độ dài dọc theo trục chính của đầm 2.368 m, chỗ hẹp nhất 334 m, nơi rộng nhất 1.060 m Đây là một vùng nước khá đẹp, yên tĩnh, nước sạch, có bãi cát mịn, sinh thái học đa dạng và độc đáo, là nơi phù hợp để có thể triển khai các nghiên cứu và thí nghiệm về sinh học, sinh thái và môi trường biển [19]

Hình 1.1.Vị trí lấy mẫu vi sinh vật biển tại Đầm Bấy Nha Trang, Khánh Hòa

Tốc độ gió trung bình là 2,6 m/s, dao động 2 – 5 m/s Hệ thống thủy văn động lực mang tính hỗn hợp Sóng cao trung bình 0,4 m, độ cao sóng cực đại là 4,0 - 4,5 m, chu

kỳ trung bình 5,5 - 6,0 s Do địa hình tương đối dốc, nên sóng tác động mạnh, đặc biệt

là vào thời gian từ tháng 9 đến tháng 4 năm sau Vùng của Vịnh Nha Trang có hiện tượng nước trồi với tốc độ trồi dưới nước sâu lên đạt giá trị 10-3 cm/s Hiện tượng này

đã tạo ra những đặc trưng hải dương học, sinh thái học hết sức đặc biệt và thú vị, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn [7]

1.2 Đặc điểm của nấm sợi

Nấm sợi (NS) thuộc nhóm vi nấm, được phân bố khắp nơi: trong đất, trong nước, trong không khí, trên thực vật, động vật, kể cả trên cơ thể người [9]

Đây là nhóm VSV có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi bông, tạo khuẩn ty ở dạng bột Màu sắc của NS được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu…[27]

1.2.1 Hình thái, cấu tạo

 Hình thái

Trước kia nhiều người hay nhầm lẫn giữa nấm động vật và nấm thực vật Cho đến ngày nay thì thấy rằng, nấm không phải là một loại thuộc thực vật và cũng không

phải là động vật Vì khi quan sát nấm ta thấy một số đặc điểm sau:

- Nấm không có màu xanh lục của lá cây hay không có chất diệp lục, không có khả năng tự tổng hợp các chất dinh dưỡng cho chính bản thân Chúng chỉ phát triển được trên những thức ăn đã có sẵn

- Nấm là loại sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh Những sợi phân nhánh này phát triển thành từng đám chằng chịt, người ta gọi là khuẩn ty hay hệ sợi nấm khi phát triển trên môi trường đặc, thường phân ra làm hai loại rõ rệt: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng [33]

Hai loại khuẩn ty này đóng vai trò và nhiệm vụ khác nhau Khuẩn ty dinh dưỡng (hay khuẩn ty cơ chất) ăn sâu vào môi trường làm nhiệm vụ như chiếc rễ của cây xanh Còn khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường lại đóng vai trò sinh sản là chủ yếu

 Cấu tạo

Cấu tạo cơ thể là một tản (thallus) tức là cơ thể có bộ máy dinh dưỡng chưa phân

hóa thành các cơ quan riêng biệt Nấm gây bệnh ở động vật thủy sinh thường có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những nấm này sinh trưởng ở đầu mút sợi nấm và phát triển

rất nhanh tạo thành những đám rất chằng chịt gọi là hệ sợi nấm (mycelya) Từng sợi nấm gọi là khuẩn ty (hyphae) [28]

Cấu tạo của nấm có thể là đơn bào hoặc đa bào Ở nấm đa bào có hai loại, một loại giữa các tế bào không có vách ngăn, toàn bộ sợi nấm như một tế bào khổng lồ đa hạch được gọi là nấm bậc thấp một loại khác giữa các tế bào có vách ngăn gọi là nấm bậc cao [1]

Hình 1.2 Các loại sợi nấm

NS có thành tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin và chitosan Màng tế bào dầy khoảng 7 μm thành phần chủ yếu là lipit (40%) và protein (38%) Nhân phân hoá, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 – 3 μm Ty thể hình elip, luôn

di động để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào [29]

Hình 1.3 Cấu trúc sợi nấm

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

 Sinh lý

NS có thể phát triển liên tục trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng Hầu hết các loài NS không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là 20oC, và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót

ở 0oC và ở 60oC Nói chung, NS có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH = 6) nhưng pH tối hảo là 5 – 6.5 một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở

pH > 9 [8]

NS có thể sử dụng những nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau Để thực hiện các quá trình sinh lí khác nhau NS thường có những nhu cầu không giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hoá Sự sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất Hầu hết các loại NS có thể đồng hoá trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường Ngoài các nguồn Nitơ vô cơ, nấm sợi còn có thể sử dụng tốt nhiều nguồn Nitơ hữu cơ như protein, pepton, peptide, acid amin…[5],[ 8]

Oxi cũng cần cho sự phát triển của NS vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi [9]

Nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K,

Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dể hấp thu vào trong tế bào

Ngoài các chất dinh dưỡng NS cũng như tất cả các sinh vật khác còn có nhu cầu

về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào Liên quan đến lượng nước còn

có độ ẩm Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60%) [8]

 Sinh hóa [8]: Bao gồm một số chất có hoạt tính:

- Hoạt tính sinh các chất kháng sinh (CKS):

CKS là những sản phẩm hữu cơ tự nhiên có khối lượng phân tử thấp được các VSV tiết ra ở nồng độ thấp nhưng có tác dụng chống lại các VSV khác một cách hữu hiệu

CKS là một trong số những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp do NS tiết ra Vai trò của kháng sinh đối với đời sống là một vấn đề đang được nghiên cứu Tuy nhiên, có hai giả thuyết về vai trò của CKS được nhiều nhà khoa học ủng hộ Giả thuyết thứ nhất cho rằng việc tổng hợp các CKS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó Giả thuyết thứ hai cho rằng việc tổng hợp CKS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao cho chủng sinh ra CKS trong tự nhiên, nhất là với các loài có bào tử Người ta

đã xác định được một số CKS có tác dụng ức chế sự nảy mầm của bào tử của chính chủng sinh ra CKS đó Có thể CKS có vai trò kìm hãm sự nảy mầm của bào tử cho đến khi điều kiện môi trường ngoài hoàn toàn thích hợp cho sự phát triển của chúng Đối với con người, CKS là một trong số những sản phẩm có giá trị và ngày càng trở nên rất quan trọng trong đời sống như: trong việc chữa bệnh, bảo vệ cây trồng, bảo quản thực phẩm và trong chăn nuôi Những NS có khả năng sinh CKS mạnh là các

nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium, Trichoderma…

Với những đặc điểm quan trọng trên, NS đang trở thành đối tượng rất được quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác triệt để những đặc tính sinh học có lợi phục vụ cho đời sống con người

1.2.3 Phương thức sinh sản

NS có nhiều hình thức sinh sản khác nhau:

- Sinh sản sinh dưỡng tạo nên các phân sinh bào tử Đó là các tế bào sinh trưởng ở đầu mút của khuẩn ty, có vách tế bào dày lên hình thành các tế bào màng dày, các hạch nấm Các tế bào màng dày này đứt ra khỏi cơ thể mẹ và phát triển thành sợi nấm mới [30]

- Sinh sản vô tính: các bào tử vô tính khác nhau ở hình thái và nguồn gốc phát sinh Căn cứ vào đặc điểm phát sinh người ta phân thành bào tử kín và bào tử trần Một dạng bào tử vô tính khác không phải là dạng sinh sản được gọi là bào tử màng dày hay bào tử áo Chúng do một đoạn sợi nấm tích lũy nhiều chất dinh dưỡng và có thành tế bào dày lên mà tạo thành nhằm mục đích thích ứng với các điều kiện bất lợi của môi trường Một kiểu bào tử vô tính khác nữa đó là bào tử có roi có khả năng bơi lội trong nước, người ta gọi là bào tử di động [33]

- Sinh sản hữu tính: Nấm hình thành các túi giao tử (gamentagia) Túi giao tử đực gọi

là hùng khí (antheridium), túi giao tử cái gọi là noãn khí (oogonium) Trên khuẩn ty

thường quan sát thấy những cơ quan sinh sản đực và cái của nấm nằm vuông góc với sợi nấm Túi giao tử đực nhỏ, thường có hình ống và túi giao tử cái thường là mép túi phình to dạng hình cầu Một số giống nấm sinh sản hữu tính theo hình thức tiếp hợp, túi giao tử đực uốn cong và bao lấy túi giao tử cái, giữa chúng xuất hiện cầu nối nguyên sinh chất Qua cầu nối này giao tử đực và cái gặp nhau tạo thành hợp tử Hợp

tử này nảy mầm phát triển thành sợi nấm mới [30] (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sinh sản hữu tính ở nấm sợi

1.2.4 Vai trò của nấm sợi [28],[ 30]

- NS góp phần quan trọng trong việc đảm bảo các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp

- Thu nhận nhiều hợp chất có hoạt tính quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm (sản xuất tương, nước chấm, đậu phụ, cồn, rượu, các acid xitric, acid gluconic…), tích lũy vitamin, các chất sinh trưởng và nhiều loại ancaloit có giá trị chữa bệnh, xử lý ô nhiễm môi trường

- NS có khả năng tiết CKS có giá trị (Penicillium, xephalosporum, fuzidin, fumagilin, tripaxidin), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, các chất kích thích yếu tố sinh trưởng thực vật, tăng độ phì nhiêu cho đất, định lượng các chất hoạt động sinh học

1.2.5 Phân loại nấm sợi

Vi nấm là thuật ngữ dùng để chỉ tất cả các loại nấm hiển vi, không sinh quả thể lớn (mũ nấm) Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi nói riêng vẫn đang ở thời

kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý sinh hóa và phương thức sinh sản Các phương pháp sinh hóa và sinh học phân

tử được sử dụng ít trong phân loại vi nấm

 Nhà nấm học Italia P.A Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm Các thành tựu nghiên cứu đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G.C Ainsworth

và cộng sự (Vol 1, 2, 3, 4A, 4B New Yord and London: Academic Press, 1963-1973)

Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn từ điển về nấm (Dictionary of the Fungi) của Ainsworth và Bisby Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum):

- Deuteromycota (Deuteromycetes): nấm bất toàn

Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953) Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm:

Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá) Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata [17]

Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần

Người ta cho rằng trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10 000 chi và 70 000 loài, Trung Quốc đã điều tra được 40

000 loài Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau [8] Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hiện đang hợp tác với Viện NITE (Nhật Bản) điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới trong quá trình nghiên cứu

Hiện tồn tại nhiều hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, có nhiều khóa phân loại đã được sử dụng như: Saccardo P A (1880- 1886), Barron G.L (1968) Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Ainsworth G C (1973), V.Arx (1981), Bùi Xuân Đồng (1984) [10], Alexopoulos & Mins (1996), Nguyễn Lân Dũng (2000) [11], Đặng Hồng Miên (1999) [24], Nguyễn Đức Lượng (2003) [20], Persoon ex Gray (1801) Sự

phân loại vi nấm đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic clasifications) và đã bắt đầu dựa vào sự phát triển của sinh học phân tử

Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại: Nguyễn Lân Dũng (2000) [11] (trong tài liệu này có khóa phân loại của Saccardo PA (cải tiến), Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Bùi Xuân Đồng (1984) [10], Nguyễn Đức Lượng (2003) [20], Đặng Hồng Miên (1999) [24]

1.3 Khả năng hình thành chất kháng sinh từ nấm sợi

1.3.1 Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh

Kháng sinh (antibiotics) là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các VSV khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…) một cách chọn lọc [2],[ 15]

CKS là một trong các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp quan trọng nhất, là nhóm hợp chất thiên nhiên đa dạng về thành phần hóa học Chúng có thể là một chất kiềm, axit, trung tính, dễ bay hơi hay một polypeptit, sản phẩm này có thể tiết ra ngoài môi trường sống hay tích luỹ trong tế bào Trước đây việc sử dụng CKS trong điều trị các bệnh nhiễm trùng thường có nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn) Những năm gần đây với những tiến bộ về khoa học kỹ thuật, nhiều CKS đã được tạo

ra theo con đường bán tổng hợp (ampixillin) hoặc tổng hợp mới hoàn toàn (chloramphenicol) [12]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh [26]

Trong quá trình sống, cơ thể VSV thường xuyên trao đổi chất với môi trường ngoài tạo ra các sản phẩm trao đổi chất khác nhau Sản phẩm trao đổi chất sơ cấp là những sản phẩm cần thiết cho sự sống của tế bào, chúng là những vật chất tham gia xây dựng tế bào như các axít amin, vitamin, nucleotide Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm về mặt hóa học là những hợp chất có cấu tạo cực kỳ phức tạp, chúng không có chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào như chất kháng sinh, giberelin, độc tố nấm, các polysacarit

Quá trình tổng hợp CKS chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố trong đó có thành phần môi trường (nguồn cacbon, nito, nguyên tố vi lượng, phương pháp nuôi cấy, tuổi

giống, độ thông khí…) và điều kiện nuôi cấy Vì vậy khi nuôi cấy chúng ta tìm điều kiện tối ưu cho các yếu tố trên để hiệu suất tổng hợp CKS cao nhất

 Cacbon: Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS chịu ảnh hưởng sâu sắc của nguồn thức ăn Tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn như glucose, manitol, các loại đường kép như saccarose, lactose, cũng có thể là các loại đường đa như tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường [13]

 Nguồn nitơ và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến

sự sinh tổng hợp CKS Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hóa nhanh khác

sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS Quá trình sinh tổng hợp CKS ở NS thường cần cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi trường

 Photphat vô cơ cũng là một trong những yếu tố điều chỉnh sự tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS không quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng acid nuclêic trong tế bào, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS Ngoài ra sự dư thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp CKS

 Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường trong khoảng từ 28 - 30oC

 Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc đáng kể vào pH môi trường, pH thích hợp cho việc tổng hợp CKS là trung tính, pH acid hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS

 Ngoài ra tuổi của giống, khả năng đồng đều về mặt di truyền, hoạt tính trao đổi chất cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp CKS

1.3.3 Khả năng sinh kháng sinh của vi nấm

Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với con người và các VSV khác Do vậy việc tìm kiếm thuốc chữa bệnh cho con người, từ lâu đã là mơ ước của nhiều nhà khoa học nói riêng và của nhân loại nói chung Và đã có nhiều CKS đã được phát hiện từ nấm sợi như:

 Penicillin:

Vào mùa thu năm 1928, tại St Mary’s Hospital London, Alexander Fleming - một nhà vi sinh vật học trở lại phòng thí nghiệm sau thời gian nghỉ hè Quan sát các hộp nuôi VSV cũ còn sót lại trên bàn, ông phát hiện một hộp cấy tụ cầu

Staphylococcus bị nhiễm vi nấm Penicillium sp., và lấy làm ngạc nhiên vì nấm đã ức

chế sự phát triển của tụ cầu Fleming nhận thức ngay hiện tượng mới lạ này và sau một

loạt thử nghiệm đã thấy nấm Penicillium sp ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn

gây bệnh như:

- Liên cầu khuẩn Streptococcus (thường trú ở họng)

- Phế cầu khuẩn Diplococcus pneumoniae gây viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai

mũi họng

- Vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphteriae

- Cả xoắn khuẩn giang mai Treponema pallidum lây lan qua đường tình dục Ông đặt

tên hoạt chất được chiết từ nấm là Penicillin Nhưng sau đó, công trình của Fleming đã

bị lãng quên Cho đến chiến tranh thế giới thứ hai, do sự nỗ lực hợp tác của nhiều nhà khoa học Anh- Mỹ, đứng đầu là Abraham, Chain, Florey thí nghiệm của Fleming đã được lặp lại, đồng thời đã tiến hành chiết rút thành công và khẳng định giá trị to lớn của Penicillin “loại thuốc thần kỳ” này đã mở ra một kỷ nguyên mới - kỷ nguyên kháng sinh trong lịch sử y học của loài người Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928,

Hình 1.5 Khuẩn lạc Penicillium kháng tụ cầu vàng S aureus năm 1928

Năm 1938, ở Oxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicillium vào sản xuất thử Và chỉ sau hai năm đã tinh chế một lượng lớn penicillin, đủ để thử nghiệm trên chuột thí nghiệm và kết quả điều trị đã thành công mỹ mãn, ngày 25/05/1940 [21]

Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tử của Penicillin

Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đó

Mãi đến năm 1945, ông mới được nhận giải thưởng Nobel

Năm 1946 – 1950, hàng loạt chất kháng sinh đã được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillin, khẳng định giá trị to lớn của Penicillin sử dụng trong chữa bệnh

 Cephalosporin

Cephalosporin là một họ các CKS được tách lần đầu tiên vào năm 1948 từ nấm

Cephalosporium và cấu trúc betalactam của chúng rất giống cấu trúc của penicilin [3]

Đây là CKS có hoạt tính và cấu tạo gần giống với penicilin nhưng nó lại có khả năng chống được cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) tuy nhiên hoạt tính nó kém hơn penicilin [14]

Các Cephalosporin gồm có cephalotin, cefoxitin, ceftriaxon và cefoperazon Cefoperazon đề kháng với sự huỷ hoại bởi các β-lactamaza và chống lại có hiệu quả

nhiều loại vi khuẩn Gram (-) kể cả Pseudomonas aeruginosa Cephalexin và cefixim

được uống qua đường miệng chứ không được tiêm [3]

 Tetracyclin

Các tetraxyclin là một họ các CKS có một cấu trúc chung gồm bốn vòng mà hàng loạt các chuỗi bên được gắn vào Có những CKS phổ biến như: oxitetraxyclin, clotetraxyclin,… các CKS này ức chế tổng hợp protein bằng cách liên kết với đơn vị nhỏ (30S) của ribosome và ức chế sự liên kết của các phân tử aminoaxyl – tRNA vào

vị trí A của ribosome [3]

Các Tetracyclin là các CKS phổ rộng (các VK Gram (+) và Gram (-), Rickettsia, xoắn khuẩn ) Chỉ định điều trị bằng cách kết hợp với các kháng sinh khác để điều trị các bệnh: Brucella, tả, sốt định kỳ, lậu cầu, giang mai, viêm đường tiêu hoá, sốt rét

 Griseofulvin:

Năm 1959, Oxford và cộng sự phát hiện Griseofulvin chiết được từ một số loài

NS thuộc giống Penicilium (P.urticae, P.nigricans, P.raistrichi ) Griseofulvin không

có hoạt tính chống vi khuẩn (VK) nhưng có khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng

để chữa bệnh nấm cho người và gia súc [21]

 Glytoxin

Glytoxin là CKS từ giống Trichoderma viride, ngoài ra người ta còn phát hiện ở

Aspergillus fumgitus, một vài loài penicilium Glytoxin không bền vững và bị phân

hủy nhanh trong ánh sáng Phổ kháng sinh của nó chống các vi khuẩn Gram (+) và các nấm gây bệnh Trong kết quả thực nghiệm glytoxin không thể hiện hiệu quả chống nhiễm trùng lao ở chuột, không ngăn cản sự phát triển của u ác tính Hoạt tính KS của glytoxin liên quan với sự có mặt trong phân tử là nhóm chứa lưu huỳnh

1.3.4 Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV Sự tác động của các CKS lên tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ CKS

và cấu trúc hiển vi của tế bào VSV Ngoài ra cùng một CKS như nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế cũng có thể khác nhau Nhìn chung CKS có các cơ chế tác động sau [22]

về mặt cấu trúc với phần axit amin-D-alanin của peptidoglucan mới sinh ra

Những năm gần đây người ta đã mô tả về vị trí đa thụ thể trên màng tế bào chất của vi khuẩn có liên kết cộng hóa trị với penicilin Một số protein liên kết với penicilin (penicilin binding protein- PBP) hoạt động như các enzyme và biểu hiện hoạt tính của cacboxypeptidase, transpeptidase, endopeptidase, glycosylase Vai trò chính xác của PBP bất kể thuộc hoạt tính enzyme nào trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào thì cho đến nay vẫn chưa được biết rõ [2]

Nhóm cloramphenicol tạo thành phức hợp aminoaxin-tARN, ngăn cản sự giải phóng acid amin ra khỏi ARN vận chuyển Cloramphenicol gắn vào tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide [14]

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

 Phá hủy màng sinh chất:

Một số CKS làm chết tế bào bằng cách thay đổi tính thấm của màng sinh chất Polymixin phá vỡ lớp photpholipit cấu trúc màng sinh chất và làm cho các chất rò rỉ ra ngoài tế bào từ đó làm tế bào chết Các CKS nhóm polyen tác động lên thành phần sterol và ergosterol của màng hơn là photpholipit tạo lên các lỗ trên màng làm thất thoát các phân tử nhỏ gây chết tế bào, cho nên các CKS thuộc nhóm polyene có hiệu quả rất lớn trong việc chống nấm

 Ức chế tổng hợp DNA:

Các CKS tác động theo cơ chế này có thể gắn với acid nucleic tạo thành phức phân tử bất hoạt, ngăn chặn sự sao chép của các phân tử acid nucleic Các CKS như là actinomycine, mitomixin-D, nhóm Quinolon

 Ức chế cạnh tranh:

Một số CKS về mặt cấu trúc gần giống với chất trao đổi chất bình thường nên chúng có thể tranh chấp enzyme hoặc có thể thay thế chất trao đổi, do đó ảnh hưởng đến trao đổi chất của vi sinh vật CKS này gọi là chất kháng sinh trao đổi chất, tác động theo kiểu ức chế cạnh tranh

Hình 1.6 Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh

1.3.5 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh từ vi nấm biển

 Trong nước

Đa dạng sinh học biển Việt Nam đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nhận định rất đa dạng và phong phú Như vậy, hướng nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên biển Việt Nam nhằm tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao là rất khả thi, triển vọng và hứa hẹn thu được nhiều thành công

Năm 2013 – 2015, Phạm Văn Cường et al [97] đã sàng lọc được 15 chủng VSV biển có hoạt tính cao trong kháng lao được phân lập từ nguồn VSV đáy biển vùng

Đông bắc Việt Nam Sau đó nghiên cứu về thành phần hóa học từ các cặn chiết dịch

ngoại bào của các chủng VSV được lựa chọn, có 82 hợp chất đã được phân lập, trong

đó có 5 hợp chất mới và 4 hợp chất mới lần đầu phân lập từ tự nhiên Kết quả thử hoạt

tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) cho thấy 24 chất thể hiện hoạt tính

Năm 2012, Nguyễn Đình Luyện et al [18] đã phân lập từ các nguồn khác nhau như trầm tích và các sinh vật biển thu được 38 chủng nấm biển Kết quả cho thấy, 23

trong số 38 chủng có khả năng ức chế sự phát triển của các VSVKĐ bao gồm 4 chủng

có hoạt tính ức chế mạnh lên ít nhất 5 VSVKĐ bao gồm cả VK, nấm mốc và nấm men Đáng chú ý là cả 9 chủng nấm phân lập từ bọt biển đều có hoạt tính kháng VSV

và tất cả các chủng phân lập từ bọt biển có biểu hiện hoạt tính VSVKĐ (100%)

 Ngoài nước:

Cho đến nay, hàng trăm các hợp chất đã được phân lập, nhiều hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, kháng viêm, kháng vi sinh vật kiểm định Những kết quả nghiên cứu này đã được công bố trên các tạp chí quốc tế về hướng các hoạt chất thiên nhiên biển, đồng thời nhiều hoạt chất đã và đang được phát triển, một số loài sinh vật biển đã được lựa chọn thành các sản phẩm có giá trị y dược và sớm được đưa ra thị trường phục vụ việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Trong số 23.000 chất từ VSV có hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus… Có đến 42% trong số đó có nguồn gốc từ các loài thuộc giới nấm [40] Các nghiên cứu cho thấy nấm biển có hoạt tính KS kháng được phổ rộng các VSV [55]

Cuomo et al (1995) [46] so sánh hoạt tính KS của 1500 chủng nấm phân lập từ biển với 1450 mẫu phân lập từ đất liền, kết luận rằng có nhiều mẫu nấm phân lập từ biển có hoạt tính KS hơn từ đất liền

Carsten Christophersen et al (1999) [43] nghiên cứu trên 227 chủng NS phân lập

từ biển (trong đó có Rừng ngập mặn), kết quả có 7 chủng có khả năng kháng Vibrio

parahaemoliticus, 55 chủng kháng S aureus

Hơn 270 hợp chất mới được tìm thấy từ nấm biển [87], và đến năm 2007 thì đã

có tổng 690 hợp chất tự nhiên phân lập từ vi nấm biển được công bố Ebel et al (2010)

[50] Những hợp chất mới này được tạo ra chủ yếu từ các loài nấm thuộc chi

Penicillium, Aspergillus và một số loài nấm thuộc các chi ít phổ biến hơn như Acemonium, Emericella, Epicoccum, Exophiala, Paraphaeospaeria, Phomosis và Halarosellinia [71]

1.4 Ứng dụng của chất kháng khuẩn từ vi nấm biển trong thực tiễn

1.4.1 Điều trị hiện tượng lờn thuốc của vi nấm

Hiện tượng kháng thuốc của VSV ngày càng phổ biến, làm cho nhiều loại CKS trở nên mất tác dụng Một số VSV gây bệnh kháng thuốc phổ biến:

- Pseudomonas aeruginosa gây bệnh nghiêm trọng trong các vết thương mổ, viêm

niệu đạo, viêm phổi, viêm tai ở người đi bơi, màng não mủ đã đề kháng với hầu hết các loại KS như: mezlocillin, netilmicin, aztreonam, imipenem, meropenem, gentamycin, tobramycin, amikacin, ciprofloxacin, levofloxacin và cả các CKS thế hệ mới như cephalosporin, fluoroquinolon Hai loại KS có thể dùng điều trị là azlocillin

và ceftazedime [26]

- Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm, gây các bệnh đường tai, mũi, họng

Điều trị nhiễm trùng do S aureus thường dùng các penicillin không bị phân hủy bởi lactamase như nafcillin Đối với S aureus kháng methicillin được điều trị bằng

vancomycin, loại KS này gây nhiều phản ứng phụ cho cơ thể Gần đây, một số chủng

S aureus đã kháng cả vancomycin [26]

- Candida albicans là tác nhân gây nhiều bệnh ở niêm mạc miệng, lưỡi, dạ dày, tá

tràng, đường ruột, niệu đạo, cơ quan sinh dục Hiện nay, 25% bệnh tai mũi họng do C

albicans trở nên khó chữa trị do đề kháng với các KS chống nấm như nystatin,

amphotericin B, clotrimazole, 5-fluorocytosine Bệnh do nhiễm C albicans càng khó

chữa trị đối với các bệnh nhân AIDS [26]

- Mycobacterium tuberculosis đã đề kháng được nhiều loại KS hiện có [26]

Vì vậy, nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự lờn thuốc của các VSV gây bệnh Một trong số các biện pháp hữu hiệu là tìm các KS mới từ các loài VSV trong thiên nhiên Ngày nay, các nhà khoa học đang quay lại nhóm VSV đầu tiên sinh ra CKS đó là nấm sợi nói riêng và nấm nói chung, hy vọng tìm được giải pháp hữu hiệu chống các VSV lờn thuốc [26] Đối tượng hấp dẫn lại chính là nấm biển Vì các nhà nghiên cứu tin rằng trong các môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của VSV sẽ khác hơn các VSV trên cạn, nên sẽ có các chất trao đổi khác hơn trong đó có thể có các hoạt chất quý kể cả CKS [52],[ 54]

1.4.2 Phòng chống bệnh hại cây trồng

Ở Việt Nam, các bệnh do nấm, vi khuẩn, virút đã gây tổn thất lớn cho cây trồng Việc dùng thuốc hóa học đã mang lại hiệu quả tốt, làm giảm đáng kể sự thất thu sản lượng cây trồng Tuy nhiên, việc dùng thuốc hóa học cũng gây nên hậu quả năng nề cho sức khỏe của người tiêu dùng Nhiều hóa chất còn tồn lưu trong sản phẩm là nguyên nhân gây ung thư cho người sử dụng [5],[ 6] Việc sử dụng nấm sợi có khả năng sinh KS để bảo vệ cây trồng là biện pháp an toàn và hiệu quả, làm tăng năng suất

cây trồng, giữ được phẩm chất nông sản [26],[ 31] Cụ thể như chi Aspergillus và

Trichoderma nổi tiếng với việc tạo ra các chất kháng nấm và kháng khuẩn Hầu hết có

khả năng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có thể ức chế sự sinh trưởng của các VSV khác, bao gồm acid harzianic, alamethicins, tricholin, peptaibols, 6-pentyl-a-pyrone, massoilactone, viridin, gliovirin, glisoprenins, acid heptelidic, acid oxalic và một số

chất Khi sử dụng chất kháng nấm butenolide, harzianolide từ Trichoderma harzianum

cùng với Blue Copper- 50 để trị bệnh héo ở đậu có hiệu quả hơn so với chỉ sử dụng

thuốc trừ nấm Khi sử dụng Asp niger cùng với FoltafSOW (Captafol 80%) để trị

bệnh héo ở đậu hiệu quả hơn so với chỉ sử dụng riêng rẽ thuốc này [59]

1.4.3 Phòng chống côn trùng hại cây trồng

Ngày nay, các biện pháp kiểm soát sinh học các loại côn trùng gây hại có hiệu quả và an toàn cho môi trường đang được quan tâm Tuy biện pháp này có tác dụng chậm hơn song không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng tới các sinh vật khác Và có nhiều loài VSV được sử dụng trong kiểm soát sinh học như VK, virút và nấm sợi:

- Aspergillus niger, Trichoderma spp., Penicillium spp còn kí sinh trong trứng của tuyến trùng Heterodera spp và Meloidogyne spp Những loại nấm này phát triển

nhanh chóng trong trứng, làm cho ấu trùng không thể phát triển hoàn thiện Tuy nhiên khi trứng đã nở, các loại nấm này lại có ít tác dụng lên ấu trùng [59]

- Pochonia chlamydospria (Verticillium chlamydosporium) có khả năng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có tác dụng tiêu diệt tuyến trùng Dịch lên men của chủng P

chlamydosporia có thể giết chết 100% Globodera rostochiensis, G pallida và Panagrellus redivivus [59]

 Những chế phẩm vi sinh vật trong phòng trừ sâu bệnh: [16],[ 17]

- Chế phẩm vi sinh hữu hiệu EM (Effective microorganisms) là tập hợp các VSV có ích (các vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm sợi) làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường do các VSV có hại gây ra, từ đó làm tốt đất, chống bệnh

do VSV gây ra và tăng cường hiệu quả của việc sử dụng chất hữu cơ cho cây trồng Sử dụng chế phẩm EM góp phần tăng năng suất cây trồng, vật nuôi, tăng sản lượng nông sản Chế phẩm EM còn dùng để xử lý rác thải, nước thải, khử mùi hôi của chất thải chăn nuôi

- Sản phẩm BIMA của Trung tâm công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và

Vi-ĐK của Công ty sát trùng Việt Nam đang được nông dân sử dụng để tăng khả năng hoai mục của phân chuồng và giảm mùi hôi thối; đồng thời phòng chống một số bệnh

do nấm Phytophthora palmirova, Fusarium solani, Pythium sp., Sclerotium rolfosii do

tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong chế phẩm

- BIO-F của Viện Sinh học nhiệt đới có chứa Streptomyces sp., Trichoderma sp và vi khuẩn Bacillus sp có tác dụng phòng trừ bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani và bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzea gây ra

- OMETAR từ nấm xanh Metarhizium anisopliae và BIOVIP từ nấm trắng Beauveria

bassiana của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long có tác dụng diệt một số sâu bệnh

hại lúa và cây ăn trái

- Sản phẩm PHÂN HỮU CƠ VI SINH như vi khuẩn cố định đạm (Azotobacter),

Bacillus polymixa, Bacillus megaterium, Pseudomonas striata, Aspergillus awamori

phân giải lân khó tan

- Chế phẩm Liquid Vigo của Trung tâm ứng dụng kỹ thuật Lâm Đồng là chế phẩm VSV đối kháng nấm bệnh cây trồng Trichoderma và đang được ứng dụng trên cây rau (bắp cải) và cây hoa (cẩm chướng) ở Đà Lạt

Tóm lại: Phát hiện ra CKS được xem là một trong những phát minh vĩ đại nhất của thế kỷ 20 Hiện tượng kháng thuốc ngày càng nghiêm trọng và đang đe dọa sức khỏe của toàn nhân loại Điều này đặt ra yêu cầu phải tìm kiếm các CKS mới với cơ chế tác động mới Trong những thập kỷ gần đây, thế giới đặc biệt quan tâm đến NS sinh KS có nguồn gốc từ biển

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 10/2016 đến tháng 3/2017

- Địa điểm thu mẫu: Đầm Bấy, vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Sinh học biển, Viện Nghiên cứu và

Ứng dụng công nghệ Nha Trang, số 02 – Hùng Vương, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

- Vi khuẩn Gram (-) : Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- Vi khuẩn Gram (+) : Staphylococcus aureus ATCC 25923

Streptococcus faecalis ATCC 19433

Listeria monocytogenes ATCC 19111

Bacillus cereus ATCC 11778

- Nấm men : Candida albicans SH 20

- Potassium Sodium Tartrate Tetrahydrate (KNT) (Trung Quốc)

- Agar (Việt Nam)

- Chất kháng sinh: Penicillin, Streptomycin (Việt Nam)

- Máy đo pH Hanna (USA)

- Máy Vortex (Hàn Quốc)

- Cân điện tử (Sartorius -Đức)

2.2.4 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường Sabouraud được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút/1 atm Sau đó để môi trường nguội 50 – 55oC, bổ sung thêm kháng sinh Penicillin và Streptomycin (đối với phân lập), rồi đổ môi trường ra đĩa Petri (20 mL/đĩa)

- Môi trường thạch nghiêng:

Các chủng vi nấm biển được bảo quản ngắn ngày trên môi trường thạch nghiêng Sabouraud và giữ ở 4 oC

- Môi trường bổ sung glycerol:

Các chủng vi nấm biển phân lập được lưu giữ trong môi trường chứa nước biển có bổ sung 40% glycerol và bảo quản ở -80 oC

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp lấy mẫu

Các mẫu vật biển bao gồm bọt biển, san hô mềm, rong biển và trầm tích biển được thu nhận ở độ sâu 5-10 mét tại Đầm Bấy, Nha Trang Mẫu được bảo quản ở nhiệt

độ 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm làm nguồn phân lập vi nấm biển

2.3.1 Quy trình phân lập vi nấm từ mẫu thu tại Nha Trang

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình phân lập vi nấm biển

Giải thích quy trình:

Xử lý mẫu

- Dùng kéo vô trùng lấy ở những vị trí đại diện của mẫu

- Rửa mẫu qua 2 lần nước biển vô trùng đồng thời cắt nhỏ mẫu khoảng 0.5 cm

- Sau đó cho mẫu vào cối và dùng chày đồng nhất mẫu (đối với mẫu lỏng chỉ cần lắc nhẹ)

Cấy phân lập

- Hút khoảng 100µl dịch mẫu và trang đều trên môi trường thạch đĩa Sabouraud Sau

đó đặt mẫu vào 3 vị trí lên bề mặt thạch để có thể bắt tất cả chủng vi nấm

- Sau khoảng gần 2 tuần nuôi cấy ở 30oC, tiến hành cấy chuyển các chủng vi nấm

Quan sát hình thái: Quan sát và ghi chú đặc điểm hình dạng, màu sắc, bề mặt, độ dày

và kích thước của các khuẩn lạc vi nấm

Làm thuần: Tiến hành cấy chuyển và làm thuần các chủng vi nấm biển bằng phương

pháp cấy điểm

Bảo quản: Các chủng vi nấm biển phân lập được bảo quản trên môi trường thạch

nghiêng và môi trường glycerol

2.3.2 Quy trình sàng lọc các chủng vi nấm biển có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi nấm biển.

Chủng vi nấm đã phân lập

Nuôi cấy

Chiết sản phẩm trao đổi chất

bằng Etyl Acetate

Thu hợp chất kháng khuẩn thô

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Giải thích quy trình:

Nuôi cấy chủng vi nấm: Chủng vi nấm sau khi làm thuần được cấy vào 2 ống nghiệm

chứa môi trường Sabouraud thạch nghiêng Tiến hành nuôi cấy trong vòng 14 ngày ở

điều kiện phòng [72]

Chiết sản phẩm trao đổi chất bằng Ethyl Acetate (EA) [35],[ 72],[ 77]: Tiến hành

chiết hợp chất chuyển hoá thứ cấp bằng cách bổ sung EA vào ống thạch nghiêng nuôi cấy vi nấm Dung môi được đổ ngập mặt thạch và giữ trong 2 ngày

Thu nhận dịch chiết thô: Thu nhận dịch chiết EA và cho bay hơi để thu nhận hợp

chất thô Cao dịch chiết này được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các

chủng vi nấm biển

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Các chủng vi nấm biển được sàng lọc khả năng kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo Bauer et al (1966) [37]

- Các chủng VSVKĐ sẽ được hoạt hóa trên môi trường (MT) MHA ở 37oC Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành hoà sinh khối VSVKĐ trong ống nghiêm chứa nước muối sinh

lý 0.9% đã khử trùng và được đưa về nồng độ 0,5 McFarland Dùng que bông vô trùng nhúng vào ống nghiệm chứa VSVKĐ và cấy vào đĩa thạch chứa MT MHA theo phương pháp cấy phân lập

- Cao dịch chiết được tẩm trên đĩa giấy (đường kính 6 mm) với nồng độ 300µg/đĩa giấy Các đĩa giấy được đặt lên đĩa môi trường MHA đã cấy VSVKĐ sau khi bay hơi hết dung môi [74]

- Sau đó đặt vào tủ lạnh 6-8 giờ để các hợp chất kháng khuẩn khuếch tán trên môi trường thạch Đường kính vòng vô khuẩn được xác định sau khi ủ các đĩa ở 37oC trong

24 giờ

Đọc kết quả: Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng cách đo đường kính vòng kháng

khuẩn (mm), Hình PL18 [26]

Tuyển chọn chủng vi nấm: Chủng vi nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và

kháng nhiều chủng VSVKĐ nhất sẽ được tuyển chọn cho nghiên cứu tiếp theo là khảo

sát điều kiện lên men

2.3.3 Phương pháp định danh chủng vi nấm biển tuyển chọn và quan sát vi thể nấm sợi

- Xác định đặc điểm hình thái: Vi nấm được nuôi cấy trên môi trường đặc trưng CYA

và sử dụng phương pháp tiêu bản giọt ép Sau đó được quan sát hình thái nấm sợi dưới kính hiển vi quang học với các độ phóng đại khác nhau được kết nối với máy tính

- Định danh: Tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA và định danh loài dựa trên so sánh trình tự 28S rRNA với trình tự công bố trên ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information)

2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men lên khả năng kháng khuẩn của vi nấm biển tuyển chọn

2.3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Bước 1: Chủng vi nấm biển được nuôi cấy trên môi trường thạch Sabouraud trong

vòng 6 ngày ở nhiệt độ phòng để tạo thành những khuẩn ty lớn chuẩn bị cho lên men

Bước 2: Mỗi mốc thời gian từ 10-26 ngày, chủng vi nấm được lên men trong 2 bình

tam giác 500ml Dùng dao vô trùng cắt khuẩn lạc vi nấm biển trên đĩa thạch thành những miếng nhỏ Dùng kẹp lấy phần thạch có chứa khuẩn ty của chủng vi nấm và

chuyển vào các bình chứa môi trường lên men gạo đã được hấp khử trùng

Bước 3: Sau các mốc thời gian khảo sát từ 10 - 26 ngày, tiến hành chiết bằng EA với

thể tích 100 ml/bình

- Sau 2 ngày ngâm sinh khối và môi trường lên men với EA, tiến hành thu dung môi

có chứa hợp chất kháng khuẩn

- Dịch chiết EA được lọc bằng giấy lọc để loại bỏ sinh khối vi nấm

thô Xác định khối lượng khô của hợp chất kháng khuẩn ở các mốc thời gian nhất định

Bước 5: Cao dịch chiết được tẩm lên đĩa giấy với hàm lượng 300 µg/đĩa giấy và tiến

hành xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Bauer et al như đã trình bày ở trên

Bước 6: Xác định mốc thời gian tối ưu cho khả năng kháng khuẩn của chủng vi nấm

biển tuyển chọn

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường lên men

Bước 1: Chủng vi nấm biển được nuôi cấy trên môi trường thạch Sabouraud trong

vòng 6 ngày ở nhiệt độ phòng để tạo thành những khuẩn ty lớn chuẩn bị cho lên men

Bước 2: Môi trường lên men gạo được điều chỉnh ở các nồng độ muối khác nhau từ 10

– 45g/l Thao tác lên men chủng vi nấm giống với khảo sát thời gian lên men

Bước 3: Sau thời gian lên men xác định (mốc thời gian đã được chọn sau khảo sát thời

gian lên men ở trên), tiến hành chiết bằng EA với thể tích 100 ml/bình

- Các thao tác từ bước chiết hợp chất kháng khuẩn bằng EA đến bước xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kirby – Bauer ở các nồng độ muối như đã trình bày ở trên

Bước 4: Xác định nồng độ muối tối ưu cho khả năng khuẩn của chủng vi nấm biển

tuyển chọn

2.3.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men

Bước 1: Chủng vi nấm biển được nuôi cấy trên môi trường thạch Sabouraud trong

vòng 6 ngày ở nhiệt độ phòng để tạo thành những khuẩn ty lớn chuẩn bị cho lên men

Bước 2: Môi trường lên men gạo được điều chỉnh ở các mốc pH khác nhau từ 4 –

9 bằng dung dịch HCl 0.01N và dung dịch NaOH 0.1N

- Các thao tác từ bước lên men đến bước xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Bauer et al ở các mốc pH như đã trình bày ở trên

Bước 4: Xác định mốc pH tối ưu cho khả năng kháng khuẩn của chủng vi nấm biển

tuyển chọn