Nghiên cứu tính kháng khuẩn của dịch chiết xuất enzyme bromelain, thành phần protease chính trong cây Dứa (Ananas comosus), lên sự biểu hiện của vi khuẩn Shigella và Salmonella.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT BROMELAIN TỪ CÂY DỨA (ANANAS COMOSUS) TRÊN VI KHUẨN SHIGELLA VÀ SALMONELLA ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐƯỜNG TIÊU HĨA Phạm Ngọc Khơi*, Nguyễn Bùi Minh Tâm** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tại Việt Nam, bệnh đường tiêu hóa đứng đầu nhóm bệnh nội khoa Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đẩy nhiều bệnh nhân nhiễm khuẩn đến tình trạng vơ phương cứu chữa khơng đáp ứng kháng sinh đặc hiệu Mục tiêu: Nghiên cứu tính kháng khuẩn dịch chiết xuất enzyme bromelain, thành phần protease Dứa (Ananas comosus), lên biểu vi khuẩn Shigella Salmonella Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá hiệu muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 70% bão hòa ethanol C2H5OH 96% lên kết tủa bromelain Khảo sát khả kháng khuẩn bromelain vi khuẩn Shigella Salmonella So sánh nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration, MIC) bromelain hay bromelain kết hợp với kháng sinh so với dùng kháng sinh hoàn toàn hai đối tượng nghiên cứu Kết quả: Bromelain tủa ethanol 96% cho hoạt tính cao hơn, tiết kiệm thời gian chi phí tủa muốiammonium sulfate 70% bão hòa Dịch chiết bromelain cho khả kháng khuẩn, nhiên khả kháng Shigella tốt so với Salmonella Kết nghiên cứu MIC cho thấy bromelain dùng để hạn chế lây nhiễm củaShigella Salmonella,tuy nhiên khơng thể thay hồn tồn kháng sinh việc điều trị bệnh đường tiêu hóa Kết luận: Dịch chiết bromelain có khả kháng Shigella Salmonella gây bệnh đường tiêu hóa, kết hợp dùng kèm với kháng sinh giúp làm tăng hiệu kháng sinh, đồng thời làm giảm lượng kháng sinh cần dùng, từ hạn chế tác dụng phụ sử dụng kháng sinh điều trị dài ngày Từ khóa: Bromelain, Shigella, Salmonella, kháng sinh, bệnh đường tiêu hóa ABSTRACT EVALUATION OF ANTIBACTERIAL EFFICACY OF PINEAPPLE (ANANAS COMOSUS) EXTRACTCONTAINING BROMELAIN COMPOUND ONSHIGELLA ANDSALMONELLA Pham Ngoc Khoi, Nguyen Bui Minh Tam * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 21 - 26 Background: Currently, the treatment of gastrointestinal infections totally depends on antibiotics However, the long-term usage of antibiotics can cause some side effects Therefore, finding an antibacterial factor derived from nature without causing side effects to the patient in order to replace partially or completely the usage of antibiotics is becoming more urgent Objectives: In this study, we determine the antibacterial effect of bromelain (protease found in pineapple) on the expression of Shigella and Salmonella * Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch **Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Khoa học ứng dụng, Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 21 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Methods: Evaluate the effect of (NH4)2SO4 (70% saturation) and ethanol 96% to the precipitation and activity of bromelain by Bradford and Anson method Determine the antibacterial effect of bromelain on Shigella and Salmonella by Disk Diffusion method Compare the minimum inhibitory concentration (MIC) of bromelain or bromelain in combination with antibiotic versus using antibiotic on two strains of bacteria Results: Bromelain precipitated by ethanol 96% will have higher activity than bromelain which is precipitated by (NH4)2SO4 (70% saturation) Bromelain is resistant to both Shigella and Salmonella The MIC results also showed that bromelain can be used to limit the spread of infection of Shigella and Salmonella but still cannot completely replace antibiotics in the treatment of gastrointestinal diseases Conclusions: Bromelain is resistant to both Shigella and Salmonella, which causes gastrointestinal diseases Using bromelain in combination with antibiotic will increase the effect of antibiotic, reduce the amount of antibiotics need and limit the side effects of using antibiotic in long-term therapy Keywords: Bromelain, Shigella, Salmonella, antibiotics, gastrointestinal diseases kháng khuẩn bromelain chủng MỞ ĐẦU vi khuẩn: Streptococcus mutans, Enterococcus Kiết lỵ chứng bệnh đường tiêu hóa fecalis, Aggregatibacter actinomycetecomitans loại amip hay vi khuẩn Shigella (lỵ trực trùng) Porphyromonas gingivalis, kết thông qua thử gây Tại nước phát triển, 60% nghiệm MIC (Minimum Inhibitory trường hợp tiêu chảy phân có máu trẻ em có Concentration) cho thấy bromelain có khả nguyên nhân lỵ trực trùng(3) Bên cạnh đó, kháng khuẩn mạnh S mutans, tiếp đến thương hàn chứng bệnh đường tiêu P gingivalis, A actinomycetecomitans cuối hóa nhiễm vi khuẩn Salmonella Bệnh lây E fecalis(9) Ali Abdulrahman Ali cộng lan vi khuẩn phân người/động vật bị (2015) khảo sát khả kháng khuẩn bệnh nhiễm vào thức ăn/nước uống truyền bromelain ba chủng vi khuẩn Bacillus sang người/động vật khác(3) Hiện việc điều subtilis, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli trị chứng bệnh phụ thuộc nhiều vào với Proteus spp Corynebacterium spp., kết thuốc kháng sinh Tuy nhiên, thuốc kháng sinh thông qua thử nghiệm Disk Diffusion Test không tiêu diệt vi khuẩn có hại mà cho thấy bromelain có khả kháng khuẩn tiêu diệt số vi khuẩn có lợi ruột dẫn E.coli, Proteus spp Corynebacterium spp.(1) đến nguy tiêu chảy Ngoài ra, thuốc kháng Qua nghiên cứu trên, ta thấy bromelain sinh gây số tác dụng phụ thường gặp chất kháng khuẩn tiềm Tuy nhiên khác buồn nôn, nhức đầu, chóng mặt(2).Do Việt Nam, chưa có nghiên cứu khả đó, việc tìm yếu tố kháng khuẩn có nguồn kháng khuẩn bromelain gốc tự nhiên không gây nhiều tác dụng phụ lên Mục tiêu nghiên cứu bệnh nhân nhằm thay phần hay hoàn Khảo sát khả kháng bromelain toàn việc sử dụng thuốc kháng sinh ngày trở nên cấp thiết hai giống vi khuẩn Shigellavà Salmonella Có thể sử dụng bromelain thay hoàn toàn hay Một số nghiên cứu giới cho thấy phần việc sử dụng thuốc kháng sinh hay không? bromelain (một loại protease chiết xuất từ Dứa) có khả kháng khuẩn, kháng nấm hiệu quả(1,9) Bromelain tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfuhydryl, có khả phân giải protein thu nhận từ họ Bromeliaccae, đặc biệt Dứa (thân trái)(7) Praveen N.C cộng (2014) khảo sát khả 22 ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành enzyme bromelain tách chiết phương pháp kết tủa từ Dứa nhằm xác định khả Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 kháng khuẩn hai giống vi khuẩn Salmonella Shigella phòng thí nghiệm chun đề 3, phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Khoa học ứng dụng, Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu nhận bromelain Enzyme có chất protein, lớp áo nước xung quanh phân tử nên dung dịch protein tồn trạng thái keo Vì vậy, để kết tủa protein, điều cần thiết phải phá vỡ lớp áo nước cách bổ sung vào dung dịch dung mơi hóa chất có lực với nước mạnh protein để lôi kéo nước khỏi phân tử.Các dung mơi hóa chất thường sử dụng để kết tủa bromelain ethanol, acetone muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 Tuy nhiên, acetone loại hóa chất độc hại nên nghiên cứu sử dụng khảo sát ảnh hưởng hai yếu tố tách chiết ethanol muối (NH4)2SO4 lên hoạt tính enzyme(7) Định lượng protein theo phương pháp Bradford Phương pháp dựa vào thay đổi màu cho Coomassie Brilliant Blue - G250 liên kết với protein môi trường acid Thuốc nhuộm tạo liên kết với protein, tương tác với nhóm kỵ nước nhóm mang điện tích dương phân tử protein thành phức chất có màu.Phức chất có độ hấp thu cực đại bước sóng 595nm Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein So với phương pháp xác định protein khác phương pháp có độ nhạy cao, hóa chất đơn giản tốn thời gian Một ưu điểm lớn khác phương pháp bị cản trở (NH4)2SO4 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến Cho protease tác dụng với chất casein hemoglobin, sau kết tủa protein dư thừa tricloacetic acid (TCA), xác định sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc Nghiên cứu Y học thử Folin Dựa vào đồ thị đường chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân tác dụng enzyme.Biểu diễn hoạt tính đơn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ lượng enzyme phút 30˚C phân giải lượng protein tương đương với 1µmol tyrosine(8) Phương pháp đĩa khuếch tán (Disk Diffusion Test) Kháng sinh chất cần khảo sát đĩa giấy lọc khuếch tán lên bề mặt thạch Mueller Hilton Agar có chứa giống/chủng vi khuẩn thử nghiệm Mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh chất cần khảo sát biểu đường kính vòng vơ khuẩn xung quanh đĩa giấy lọc(5) Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Chất kháng sinh chất cần khảo sát pha loãng thành dãy nồng độ giảm dần ủ qua đêm với vi khuẩn nhằm xác định nồng độ tối thiểu mà đó, chất kháng sinh chất cần khảo sát khả ức chế phát triển vi khuẩn(4) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết so sánh hàm lượng protein hoạt tính bromelain sau tủa ethanol 96% ammonium sulfate 70% bão hòa Hàm lượng protein hoạt tính enzyme bromelain sau thu nhận hai phương pháp tủa sử dụng ethanol 96% (tỷ lệ ethanol: dịch) ammonium sulfate 70% bão hòa xác định theo phương pháp Bradford Anson cải tiến Bảng Hàm lượng protein hoạt tính bromelain Yếu tố tủa Ethanol 96% Ammonium sulfate Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Hàm lượng protein (mg) 109,05 109,47 Hoạt tính bromelain (UI/g) 137,34 120,70 23 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Hình Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hoạt tính bromelain sử dụng hai yếu tố gây kết tủa ethanol 96% ammonium sulfate 70% bão hòa ta chọn ethanol 96% làm yếu tố tủa để thu Từ kết trên, ta rút nhận xét bromelain có hoạt tính tốt sau tủa ethanol 96% ammonium sulfate 70% bão hòa hàm lượng protein thu gần tương đương nhiên yếu tố tủa ethanol 96% lại cho hoạt tính enzyme bromelain mạnh Điều giải thích thời gian thẩm tích chưa đủ, dẫn đến sót lại lượng muối định gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Vậy sau thí nghiệm này, Kết phương pháp đĩa khuếch tán Tiến hành thực phương pháp đĩa khuếch tán cho Shigella spp Salmonella spp Bảng Kết phương pháp đĩa khuếch tán Giống vi khuẩn Shigella spp Salmonella spp Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) 19,70 ± 0,67 6,50 ± 0,71 Hình Vòng vơ khuẩn bromelain tạo Shigella spp (trái) Salmonella spp (phải) so với Salmonella spp Đồng thời, pH dịch vị Từ kết trên, ta rút nhận xét sau ăn khơng ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain cho khả kháng Shigella spp tốt 24 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 bromelain, chứng bromelain cho kết kháng hai giống vi khuẩn Kết phương pháp MIC Tiến hành thực phương pháp MIC khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu bromelain, kháng sinh cefotaxime, bromelain kết hợp cefotaxime cho Shigella spp Salmonella spp Chọn cefotaxime để khảo sát với bromelain cefotaxime hệ thứ ba họ kháng sinh cephalosporin, có phổ kháng khuẩn rộng [4] Bảng Kết khảo sát MIC Shigella spp Salmonella spp Bromelain 0,782 mg/mL 3,125 mg/mL Cefotaxime µg/mL µg/mL Bromelain + Cefotaxime 0,5 µg/mL µg/mL Từ bảng kết trên, ta rút nhận xét sau: - Về việc hạn chế lây nhiễm Shigella Salmonella: bromelain dùng để hạn chế lây nhiễm Shigella Salmonellado cho kết kháng hai giống vi khuẩn - Về việc điều trị bệnh Shigella Salmonella: bromelain thay hoàn toàn thuốc kháng sinh việc điều trị bệnh, chứng kết khảo sát MIC bromelain cao nhiều lần so với thuốc không đủ điều kiện để công nhận chất kháng sinh Tuy nhiên, sử dụng kết hợp bromelain với thuốc giúp tăng cường hiệu thuốc, giảm bớt lượng thuốc cần sử dụng, chứng kết hợp bromelain (3,125 mg/mL) với cefotaxime kết khảo sát MIC cefotaxime giảm từ µg/mL xuống 0,5 µg/mL (đối với Shigellaspp.) từ µg/mL xuống µg/mL (đối với Salmonella spp.) Kết giống với kết nghiên cứu H Khosropanah cộng (2012)(6) , kết hợp bromelain với vancomycin kết khảo sát MIC vancomycin Streptococcus sanguis giảm từ µg/mL xuống 0,5 µg/mL KẾT LUẬN Bromelain tủa ethanol 96% (tỷ Nghiên cứu Y học lệ ethanol: dịch) cho hoạt tính cao tủa (NH4)2SO4 (70% bão hòa) Đồng thời, phương pháp tủa ethanol 96% tiết kiệm thời gian so với tủa (NH4)2SO4 Bromelain dùng để hạn chế lây nhiễm Shigella Salmonella Bromelain cho khả kháng Shigella spp tốt so với Salmonella spp Hiện nay, chế kháng khuẩn bromelain chưa làm rõ(1) Tuy nhiên, dựa vào kết số nghiên cứu trước đây, ta dự đốn chế sau: - Bromelain tác động lên thành tế bào vi khuẩn: vi khuẩn gồm có vi khuẩn gram (+) vi khuẩn gram (-) Đối với vi khuẩn gram (-), bromelain có hoạt tính phân giải protein nên tác động lên thành tế bào, bromelain phân giải protein màng ngoài, làm cho cấu trúc màng trở nên lỏng lẻo, tiếp đến xâm nhập vào lớp peptidoglycan tiếp tục phân cắt liên kết peptide khiến cấu trúc bị phá vỡ, cuối làm lỏng lẻo màng tế bào chất theo chế phân hủy protein màng Khi thành tế bào trở nên lỏng lẻo, phân tử bromelain len lỏi xuyên qua thành tế bào xâm nhập vào tế bào chất phân giải hợp chất dinh dưỡng bào quan có chất protein Đối với vi khuẩn gram (+), chế tác động lên thành tế bào bromelain tương tự vi khuẩn gram (-) Tuy nhiên, lớp peptidoglycan dày nên khả phá vỡ cấu trúc lớp để xâm nhập vào bên tế bào thấp so với vi khuẩn gram (-) Điều minh chứng thông qua kết nghiên cứu Sparso cộng (2002)(10) đưa kết luận bromelain cho khả kháng vi khuẩn gram (-) tốt vi khuẩn gram (+) Tuy nhiên, hai giống vi khuẩn xét đề tài vi khuẩn gram (-) lại cho kết kháng Shigella spp tốt Salmonella spp.? - Khả di động vi khuẩn: vi khuẩn có khả di động (như Salmonella spp.), dịch chế phẩm đĩa giấy Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 25 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 lọc khuếch tán xung quanh, di động nên khả vi khuẩn tiếp xúc với bromelain thấp, vi khuẩn nằm bên gần sát mép đĩa giấy có khả tiếp xúc nhiều với bromelain, dẫn đến tạo vòng kháng khuẩn nhỏ Điều minh chứng thông qua kết nghiên cứu Ali Abdulrahman Ali cộng (2015)(1), điều kiện nhiệt độ 37˚C, tất vi khuẩn có khả di động cho đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ Bromelain khơng thể thay hồn tồn thuốc kháng sinh việc điều trị bệnh Shigella Salmonella gây ra, nhiên kết hợp dùng kèm với thuốc giúp làm tăng hiệu thuốc đồng thời làm giảm lượng thuốc kháng sinh cần dùng, hạn chế tác dụng phụ sử dụng thuốc điều trị dài ngày TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 Ali AA, Milala MA, Gulani IA (2015) Antimicrobial effects of crude bromelain extracted from pineapple fruit (Ananas comosus (Linn.) Merr.) Advances in Biochemistry, 3, - Bartlett J.G (2002).Antibiotic associated diarrhea N Engl J Med., 9, 334 - 346 Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn (2005) Bệnh học truyền nhiễm Nhà xuất Y học 10 Clinical and laboratory standards institute (2012) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved standard, 9th edition, 32, 17 -19 Clinical and laboratory standards institute (2012) Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; Approved standard, 11st edition, 32, - 13 Khosropanah H, Bazargani A, Ebrahimi H, Eftekhar K, Emami Z, Esmalizadeh S (2012) Assessing the effect of pineapple extract alone and in combination with vancomycin on Streptococcus sanguis, Jundishapur Journal of Natural Pharmaceutical Products, 7, 140 - 143 Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2012) Công nghệ enzyme Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Mùi (2007) Thực hành hóa sinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Praveen N.C., Rajesh A., Manish Madan, Vishwajit Rampratap Chaurasia, Neel V Hiremath, Akanksha Manmohan Sharma (2014) In vitro evaluation of antibacterial efficacy of pineapple extract (bromelain) on periodontal pathogens, Journal of International Oral Health, 6, 96 - 98 Sparso H.M., Moller S.M (2002) Proteolytic enzyme as antimicrobial agents and incorporation of hydrophobic additives into thermally compacted soy protein - based films Research thesis at Clemson University exchange with Technical University of Danmark Ngày nhận báo: 03/08/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 10/08/2016 Ngày báo đăng: 05/10/2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 ... khuẩn có nguồn kháng khuẩn bromelain gốc tự nhiên không gây nhiều tác dụng phụ lên Mục tiêu nghiên cứu bệnh nhân nhằm thay phần hay hoàn Khảo sát khả kháng bromelain toàn vi c sử dụng thuốc kháng. .. - Về vi c hạn chế lây nhiễm Shigella Salmonella: bromelain dùng để hạn chế lây nhiễm Shigella Salmonellado cho kết kháng hai giống vi khuẩn - Về vi c điều trị bệnh Shigella Salmonella: bromelain. .. luận bromelain cho khả kháng vi khuẩn gram (-) tốt vi khuẩn gram (+) Tuy nhiên, hai giống vi khuẩn xét đề tài vi khuẩn gram (-) lại cho kết kháng Shigella spp tốt Salmonella spp.? - Khả di động vi