Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm phân lập ở vùng ven biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐINH THỊ ÚT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐINH THỊ ÚT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Mã số học viên: 58DT13 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ- ĐHNT ngày 27/3/2018 Quyết định thành lập hội đồng: 1585/QĐ-ĐHNT Ngày bảo vệ: 18/12/2019 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phạm Thu Thủy PGS.TS Nguyễn Văn Duy Chủ tịch Hội Đồng: PGS TS Vũ Ngọc Bội Phòng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HỊA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi nấm phân lập vùng ven biển Khánh Hòa” cơng trình nghiên cứu cá nhân tơi, chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Kết phần đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hoà dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thuỷ chủ nhiệm đề tài Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn đƣợc cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn xác đƣợc rõ nguồn gốc Khánh Hịa, ngày 10 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Đinh Thị Út iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm on thầy cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng, Truờng Đại học Nha Trang giảng dạy tạo điểu kiện thuận lợi cho viẹc thực hiẹn luạn van Tôi đạc biẹt cảm on TS Phạm Thu Thủy PGS.TS Nguyễn Văn Duy tạn tình huớng dẫn, bảo để tơi c thể hồn thành luạn van cao học Tơi xin cảm ơn Quý thầy cô cán viên chức Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành công việc nghiên cứu thực đề tài Xin chân thành cảm ơn bạn học viên Cao học lớp CHSH16-1 Trƣờng Đại học Nha Trang thành viên đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hòa dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thủy chủ nhiệm nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình tiến hành thực nghiệm Đặc biệt cảm ơn em Trần Thị Châu Loan tận tình giúp đỡ tơi trình thực nghiên cứu đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu đồng nghiệp Trƣờng THCS& THPT Đống Đa, Lâm Đồng nơi công tác tạo điều kiện ủng hộ tơi vƣợt qua kh khăn q trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, anh chị, … yêu thƣơng, động viên ủng hộ vƣợt qua kh khăn trình học tập thực luận văn Khánh Hòa, ngày 18 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Đinh Thị Út iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi nấm biển 1.2 Protease .6 1.2.1 Khái niệm protease 1.2.2 Phân loại protease 1.2.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ protease 1.2.4.1 Nguồn động vật 10 1.2.4.2 Nguồn từ thực vật 10 1.2.4.3 Nguồn từ vi sinh vật 10 1.2.5 Ứng dụng protease 11 1.2.5.1 Công nghiệp thực phẩm 11 1.2.5.2 Công nghiệp nhẹ 12 1.2.5.3 Nông nghiệp .13 1.2.5.4 Y học .13 1.3 Protease từ vi nấm 13 1.3.1 Protease từ vi nấm 13 1.3.2 Cơ chế sinh enzyme protease 14 1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp enzyme protease vi nấm 15 1.4.1 Nhiệt độ .15 1.4.2 pH 15 1.4.3 Nguồn dinh dƣỡng 16 1.4.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 17 1.5 Tình hình nghiên cứu enzyme protease từ vi nấm biển giới Việt Nam .17 v CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng, phạm vi, thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu .21 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .21 2.2 Vật liệu nghiên cứu .21 2.2.1 Chủng vi nấm biển 21 2.2.2 H a chất .21 2.2.2.1 Oligonucleotide 21 2.2.2.2 Môi trƣờng nuôi vi nấm 22 2.2.2.3 Thiết bị chuyên dụng 24 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát bố trí thí nghiệm 24 2.3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc sơ khả sinh enzyme ngoại bào phƣơng pháp đo đƣờng kính phân giải protease 24 2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện ni cấy thích hợp để sinh tổng hợp protease chủng DW15M 27 2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nhiệt độ 27 2.3.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng pH 27 2.3.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nguồn cacbon 28 2.3.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nguồn ni tơ hữu 29 2.3.2.5 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nồng độ casein 29 2.3.2.6 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nguồn nitơ vô 30 2.3.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 31 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.4.1 Nuôi cấy chủng vi nấm 31 2.4.2 Bảo quản chủng vi nấm 32 2.4.3 Xác định hoạt tính sinh enzyme protease cách đo đƣờng kính vòng phân giải chất protein 33 2.4.4 Xác định hoạt độ enzyme protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến 34 2.4.5 Nhuộm đơn tế bào nấm mốc 36 2.4.6 Tách chiết DNA từ vi nấm biển .37 2.4.7 Khuếch đại đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 kỹ thuật PCR 38 2.4.8 Kỹ thuật điện di DNA gel agarose 39 vi 2.4.9 Giải phân tích trình tự gen 39 2.4.10 Phƣơng pháp xử lí số liệu 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Tuyển chọn sơ chủng vi nấm biển phân lập vùng ven biển Khánh Hòa .40 3.2 Tuyển chọn chủng vi nấm c hoạt độ protease cao 42 3.3 Định danh chủng nấm DW15M dựa trình tự gen ITS đặc điểm hình thái 43 3.3.1 Đặc điểm hình thái chủng DW15M 43 3.3.2 Kết PCR khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2 45 3.3.3 Trình tự đoạn gen ITS chủng DW15M 45 3.4 Điều kiện thích hợp sinh tổng hợp protease ngoại bào chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M .47 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào 47 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào 48 3.4.3 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào .50 3.4.4 Ảnh hƣởng nguồn nitơ hữu đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào 51 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ casein đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào 53 3.4.6 Ảnh hƣởng nguồn nitơ vô đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào 54 3.4.7 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp protease ngoại bào 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt PDA YPD MT Viết đầy đủ Ghi Potato Dextrose Agar Hoạt h a nấm mốc Yeast Extract Peptone Hoạt h a nấm mem Dextrose Môi trƣờng Môi trƣờng Potato Dextrose Agar Môi trƣờng Yeast MT Môi trƣờng Extract Peptone Dextrose Môi trƣờng khảo sát MT Môi trƣờng sơ khả sinh enzyme protease Mơi trƣờng thích hợp MT Mơi trƣờng cảm ứng sinh enzyme protease w/v Weight/volume U/ml Units/mililiter TCA Tricloacetic acid viii Trọng lƣợng/thể tích Đơn vị hoạt độ enzyme protease Axít Tricloacetic DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin cặp mồi ITS1F KYO2/ITS4 22 Bảng 2.2 Tỷ lệ thành phần phản ứng để dựng đƣờng chuẩn tyrosine 34 Bảng 2.3 Tỷ lệ thành phần dung dịch để xác định hoạt độ enzyme protease 35 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 38 Bảng 3.1 Kích thƣớc vịng phân giải protein 10 chủng nấm mốc c hoạt tính protease mạnh 40 Bảng 3.2 Hoạt độ protease chủng .43 Bảng 3.3 So sánh trình tự đoạn gen ITS chủng DW15M với trình tự tƣơng đồng Genbank .46 ix Thuốc thử Folin 0,5 M Bảng 2.5 Thành phần thuốc thử Folin 0,5 N Thành phần Số lƣợng Dung dịch Folin-Ciocalteu M 10 ml (Merck 1,09001) Nƣớc cất lần 30 ml Dung dịch Na2CO3 500 mM Bảng 2.6 Thành phần dung dịch Na2CO3 500 mM Thành phần Số lƣợng Na2CO3 (M = 105,99 g) 23,84775 g Nƣớc cất lần đủ 450 ml Đệm CH3COONa 10 mM bổ sung mM (CH3COO)2Ca, pH 7,5 (dùng để pha loãng enzyme) Bảng 2.7 Thành phần đệm pha loãng enzyme Thành phần Số lƣợng CH3COONa.3H2O (M = g) 1,4 mg/ml (CH3COO)2Ca (M = g) 0,8 mg/ml Nƣớc cất lần đủ ml Điều chỉnh pH 7,5 cần thiết dung dịch axit axetic 0,1 M NaOH 0,1 N Ngay trƣớc sử dụng pha loãng dịch enzyme dung dịch Dung dịch L-Tyrosine 1,1 mM Bảng 2.8 Thành phần dung dịch L-Tyrosine 1,1 M Thành phần Số lƣợng L-Tyrosine (M = 181,19 g) 0,00199 g Nƣớc cất lần đủ 10 ml  Hóa chất dùng cho khảo sát yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme protease chủng DW15M - Nguồn cacbon: glucose, fructose, saccharose, lactose, maltose - Nguồn nitơ hữu cơ: cao nấm men, peptone, tryptone, urê, casein - Nguồn nitơ vô cơ: NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3  Hóa chất dùng cho sinh học phân tử  Bộ Kit tách chiết DNA tổng số EZ – 10 Column Plant Genomic DNA Purification (Bio Basic) − Buffer PCB − Buffer BD − PW Solution − Wash Solution − TE Buffer (pH 8,0)  H a chất điện di − Dung dịch đệm Tris-acetateEDTA(TAE) 50X: 242 g Tris base, 57,1 ml glacial acetic acid, 100 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0) Pha loãng 50 lần thành đệm 1X để điện di − 6X GelRed loading buffer − Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas, Mỹ) − Agarose tinh khiết  H a chất PCR − MyTaqTM Mix (2X) Các cặp mồi ITS1F KYO2/ITS4 Công ty TNHH Một thành viên Sinh h a Phù Sa tổng hợp Bảng PL.1: Các chủng vi nấm biển đƣợc nghiên cứu Vị trí thu mẫu Cửa Sơng Cái, Nha Trang (SC) STT Tên STT chủng Tên STT chủng Tên STT chủng Tên chủng SC1Y SC5Y SC8M 11 SC11M SC2Y SC6Y SC9M 12 SC12M SC3Y SC7M 10 SC10M 13 SC13M SC4Y Vị trí thu mẫu Bãi tắm Dốc Lết (DL) 14 DL1Y 17 DL4Y 20 DL7Y 23 DL10Y 15 DL2Y 18 DL5Y 21 DL8Y 24 DL11M 16 DL3Y 19 DL6Y 22 DL9Y 25 DL12M Vị trí thu mẫu Cảng cá Đầm Môn (DM) 26 DM1Y 29 DM4Y 32 DM8Y 35 DM11M 27 DM2Y 30 DM6Y 33 DM9Y 36 DM12M 28 DM3Y 31 DM7Y 34 DM10Y 43 TB7Y 46 TB10M 44 TB8M 47 TB11M 45 TB9M Vị trí thu mẫu Cửa sông Tu Bông (TB) 37 TB1Y 40 38 TB2Y 41 39 TB3Y 42 TB4Y TB5Y TB6Y Vị trí thu mẫu Khu bảo tồn biển Rạn Trào (RT) 48 RT3M 52 RT7Y 57 RT14Y 61 RT19Y 49 RT4Y 53 RT9Y 58 RT16Y 62 RT20Y 50 RT5Y 55 RT12Y 59 RT17Y 63 RT21Y 51 RT6Y 56 RT13Y 60 RT18Y 64 RT22Y Vị trí thu mẫu vùng nƣớc sâu Vịnh Nha Trang (DW) 65 DW1M 69 DW6M 73 DW11M 76 DW14M 66 DW2M 70 DW7M 74 DW12M 77 DW15M 67 DW3M 71 DW9M 75 DW13M 78 DW16M 68 DW4M 72 DW10M Vị trí thu mẫu Cảng Cầu Đá, Nha Trang (CD) 79 CD1Y 85 CD7Y 91 CD13Y 97 CD19Y 80 CD2Y 86 CD8Y 92 CD14Y 98 CD20M 81 CD3Y 87 CD9Y 93 CD15Y 99 CD21M 82 CD4Y 88 CD10Y 94 CD16Y 100 CD22M 83 CD5Y 89 CD11Y 95 CD17Y 84 CD6Y 90 CD12Y 96 CD18Y Vị trí thu mẫu vùng đệm Khu bảo tồn biển Hòn Mun (HMB) 102 HMB1Y 105 HMB4Y 108 HMB7Y 111 HMB10Y 103 HMB2Y 106 HMB5Y 109 HMB8Y 112 HMB11M 104 HMB3Y 107 HMB6Y 110 HMB9Y Vị trí thu mẫu vùng lõi Khu bảo tồn biển Hòn Mun (HMC) 113 HMC1Y 119 HMC7Y 125 HMC13Y 131 HMC19Y 114 HMC2Y 120 HMC8Y 126 HMC14Y 132 HMC20Y 115 HMC3Y 121 HMC9Y 127 HMC15Y 133 HMC21Y 116 HMC4Y 122 HMC10Y 128 HMC16Y 134 HMC22M 117 HMC5Y 123 HMC11Y 129 HMC17Y 118 HMC6Y 124 HMC12Y 130 HMC18Y Vị trí thu mẫu vùng ni trồng thủy sản Vũng Ngán, Đảo Hòn Tre (VN) 135 VN1Y 140 VN6Y 145 VN11Y 150 VN16M 136 VN2Y 141 VN7Y 146 VN12Y 151 VN17M 137 VN3Y 142 VN8Y 147 VN13Y 152 VN18M 138 VN4Y 143 VN9Y 148 VN14M 139 VN5Y 144 VN10Y 149 VN15M Vị trí thu mẫu Bãi biển trung tâm, thành phố Nha trang (NB) 153 NB1Y 155 NB3Y 157 NB5Y 159 NB7M 154 NB2Y 156 NB4Y 158 NB6Y 160 NB8M Bảng 2.PL: Đƣờng kính vịng phân giải protease 160 chủng vi nấm biển STT Kí hiệu D-d Hoạt tính chủng (mm) protease STT Kí hiệu D-d Hoạt tính chủng (mm) protease DL1Y - 81 RT5Y - DL2Y - 82 RT6Y - DL3Y - 83 RT7Y - DL4Y - 84 RT8Y - DL5Y - 85 RT9Y - DL6Y - 86 RT10Y - DL7Y - 87 RT11Y - DL8Y - 88 RT12Y - DL9Y - 89 RT12Y - 10 DL10Y - 90 RT14Y - 11 DL11M 91 RT15Y - 12 DL12M - 92 RT16Y - 13 TB1Y - 93 RT17Y - 14 TB2Y - 94 RT18Y - 15 TB3Y - 95 RT19Y - 16 TB4Y - 96 RT20Y - 17 TB5Y - 97 RT21Y - 18 TB6Y - 98 RT22Y 19 TB7Y - 99 DW1M 15 Trung bình 20 TB8M 11 Trung bình 100 DW2M 14 Trung bình 21 TB9M Yếu 101 DW3M 17 Trung bình 22 TB10M - 102 DW4M - 23 TB11M Yếu 103 DW5M - 24 DM1Y - 104 DW6M - 25 DM2Y - 105 DW7M 20 Mạnh 26 DM3Y - 106 DW8M 15 Trung bình 27 DM4Y - 107 DW9M - 28 DM5Y - 108 DW10M - Yếu Trung bình 29 DM6Y - 109 DW11M 15 30 DM7Y - 110 DW12M - 31 DM8Y - 111 DW13M 15 32 DM9Y - 112 DW14M - 33 DM10Y - 113 DW15M 21 34 DM11M1 14 114 DW16M - 35 DM11M2 - 115 NB3Y - 36 DM12M - 116 HMB1Y - 37 NB1Y - 117 HMB2Y - 38 NB2Y - 118 HMB3Y - 39 NB4Y - 119 HMB4Y - 40 NB5Y - 120 HMB5Y - 41 NB6Y - 121 HMB6Y - 42 NB7M 10 Trung bình 122 HMB7Y - 43 NB8M Yếu 123 HMB8Y - 44 SC1Y - 124 HMB9Y - 45 SC2Y - 125 HMB10Y - 46 SC3Y - 126 HMB11M 12 47 SC4Y - 127 HMC1Y - 48 SC5Y - 128 HMC2Y - 49 SC6Y - 129 HMC3Y - 50 SC7M 14 Trung bình 130 HMC4Y - 51 SC8M 11 Trung bình 131 HMC5Y - 52 SC9M Yếu 132 HMC6Y - 53 SC10M 12 Trung bình 133 HMC7Y - 54 SC11M 14 Trung bình 134 HMC8Y - 55 SC12M 11 Trung bình 135 HMC9Y - 56 SC13M 10 Trung bình 136 HMC10Y - 57 CD1Y - 137 HMC11Y - 58 CD2Y - 138 HMC12Y - 59 CD3Y - 139 HMC13Y - Trung bình Trung bình Mạnh Trung bình 60 CD4Y - 140 HMC14Y - 61 CD5Y - 141 HMC15Y - 62 CD6Y - 142 HMC16Y - 63 CD7Y - 143 HMC17Y - 64 CD8Y - 144 HMC18Y - 65 CD9Y - 145 HMC19Y - 66 CD10Y - 146 HMC20Y - 67 CD11Y - 147 HMC21Y - 68 CD12Y - 148 HMC22M - 69 CD13Y - 149 VN1Y - 70 CD14Y - 150 VN2Y - 71 CD15Y - 151 VN3Y - 72 CD16Y - 152 VN4Y - 73 CD17Y - 153 VN5Y - 74 CD18Y - 154 VN6Y - 75 CD19Y - 155 VN7Y - 76 CD20M 12 Trung bình 156 VN8Y - 77 CD21M 17 Trung bình 157 VN9Y - 78 CD22M - 158 VN14M - Chƣa 159 79 RT3M test VN15M - VN16M 10 đƣợc 80 RT4Y - 160 Trung bình Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi pH = 7.5 chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 1.1 PL: Kết hoạt độ Hàm Nhiệt độ OD1 nuôi OD2 ODĐC ODTB ΔOD cấy Hoạt lƣợng Hoạt độ Độ Tyrosin độ trung lệch e (U/ml) bình chuẩn (µmol) 28C 30C 37C 40C 0,3065 0,3652 0,3586 0,6363 0,628 0,643 0,5073 0,5081 0,4964 0,4256 0,5089 0,4712 0,2966 0,3446 0,3629 0,621 0,604 0,651 0,5403 0,4909 0,4849 0,4283 0,5136 0,4824 0,0773 0,1025 0,115 0,1285 0,1116 0,121 0,1035 0,1018 0,11 0,1665 0,2806 0,192 0,302 0,355 0,361 0,629 0,616 0,647 0,524 0,500 0,491 0,427 0,511 0,477 0,224 0,252 0,246 0,500 0,504 0,526 0,420 0,398 0,381 0,260 0,231 0,285 (U/ml) 0,145 0,162 0,158 0,317 0,320 0,333 0,267 0,253 0,243 0,167 0,149 0,183 0,239 0,268 0,261 0,523 0,528 0,550 0,441 0,418 0,400 0,276 0,246 0,301 0,256 0,015 0,534 0,014 0,420 0,020 0,274 0,027 Bảng 1.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa yếu tố nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Nhiệt độ Số lần l p lại Tukey a b 28C 0,25600 40C 0,27433 37C 30C a,b HSD Phân nhóm Sig, 0,41967 0,53367 0,690 Sai số tồn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 0,000 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 b Alpha = 0,05 c 1,000 1,000 Khảo sát ảnh hƣởng pH nuôi cấy đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi nhiệt độ 300C chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 2.1 PL: Kết hoạt độ Hàm pH nuôi OD1 OD2 ODĐ ODTB ΔOD C cấy Hoạt lƣợng Hoạt độ Độ Tyrosin độ trung lệch e (U/ml) bình chuẩn (µmol) 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 0,5 0,489 0,511 0,54 0,532 0,545 0,93 0,953 0,968 0,763 0,754 0,736 0,378 0,402 0,398 0,486 0,475 0,491 0,534 0,565 0,558 0,926 0,948 0,972 0,685 0,721 0,733 0,298 0,386 0,392 0,145 0,125 0,122 0,166 0,148 0,133 0,16 0,143 0,139 0,176 0,157 0,161 0,187 0,172 0,168 0,493 0,482 0,501 0,537 0,5485 0,5515 0,928 0,9505 0,97 0,724 0,7375 0,7345 0,338 0,394 0,395 0,348 0,357 0,379 0,371 0,4005 0,4185 0,768 0,8075 0,831 0,548 0,5805 0,5735 0,151 0,222 0,227 0,183 0,187 0,197 0,193 0,206 0,213 0,361 0,378 0,388 0,268 0,282 0,279 0,100 0,130 0,132 (U/ml) 0,303 0,309 0,324 0,319 0,339 0,352 0,596 0,624 0,641 0,443 0,465 0,460 0,165 0,214 0,218 0,312 0,010 0,3366 67 0,017 0,620 0,022 0,456 0,012 0,199 0,029 Bảng 2.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa yếu tố pH đến trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Tukey pH Số lần l p HSDa,b lại Phân nhóm a b 8,5 6,5 0,31200 7,0 0,33667 8,0 7,5 Sig, c d 0,19900 0,45600 0,62033 1,000 0,560 1,000 1,000 Sai số toàn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 0,000 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 b Alpha = 0,05 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn cacbon nuôi cấy đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi nhiệt độ 300C, pH = 7,5 chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 3.1 PL: Kết hoạt độ Hàm Nguồn Cacbon nuôi OD1 OD2 ODĐ ODTB ΔOD lƣợng Hoạt độ Tyrosin độ trung e (U/ml) bình C cấy Hoạt (µmol) 0,997 Glucose 0,971 1,051 0,735 Fructose 0,826 0,629 0,569 Sucrose 0,586 0,600 0,503 Maltose 0,537 0,559 Tinh bột 0,452 0,475 tan 0,498 0,968 0,945 1,074 0,669 0,796 0,569 0,574 0,595 0,538 0,528 0,507 0,542 0,488 0,462 0,502 0,162 0,168 0,158 0,191 0,318 0,210 0,159 0,163 0,176 0,124 0,122 0,103 0,152 0,13 0,143 0,983 0,958 1,063 0,702 0,811 0,599 0,572 0,591 0,569 0,516 0,522 0,551 0,470 0,469 0,500 0,821 0,790 0,905 0,511 0,493 0,389 0,413 0,428 0,393 0,392 0,400 0,448 0,318 0,339 0,357 0,384 0,371 0,419 0,253 0,245 0,201 0,211 0,217 0,202 0,202 0,205 0,226 0,171 0,179 0,187 Độ lệch chuẩ n (U/ml) 0,633 0,612 0,692 0,417 0,404 0,331 0,348 0,358 0,334 0,333 0,339 0,372 0,282 0,296 0,309 0,646 0,041 0,384 0,046 0,347 0,012 0,348 0,021 0,296 0,013 Bảng 3.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa nguồn cacbon đến q trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Tukey Nguồn Cacbon Số lần HSDa,b l p lại Phân nhóm a b Tinh bột tan 0,2960 Sucrose 0,3467 0,3467 Maltose 0,3480 0,3480 c Fructose Glucose 0,3840 0,6457 Sig, 0,293 0,583 1,000 Sai số tồn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 0,000 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 b Alpha = 0,05 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn Nitơ hữu nuôi cấy đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi nhiệt độ 300C, pH = 7,5, glucose 1% chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 4.1 PL: Kết hoạt độ Nguồn Hàm Nitơ hữu OD1 OD2 ODĐ ODTB ΔOD C nuôi cấy Casein Urê Peptone Cao nấm men Hoạt lƣợng Hoạt độ Độ Tyrosin độ trung lệch e (U/ml) bình chuẩn (µmol) (U/ml) 0,958 0,944 0,974 0,423 0,457 0,451 0,596 0,593 0,553 0,447 0,416 0,965 0,952 0,979 0,438 0,446 0,459 0,556 0,601 0,581 0,424 0,415 0,128 0,139 0,125 0,182 0,179 0,163 0,185 0,173 0,174 0,147 0,139 0,962 0,948 0,977 0,431 0,452 0,455 0,576 0,597 0,567 0,436 0,416 0,834 0,809 0,852 0,249 0,273 0,292 0,391 0,424 0,393 0,289 0,277 0,389 0,379 0,397 0,141 0,151 0,160 0,202 0,216 0,202 0,158 0,153 0,642 0,625 0,655 0,233 0,250 0,263 0,333 0,356 0,334 0,261 0,253 0,469 0,457 0,142 0,463 0,321 0,172 0,284 0,6407 0,015 0,2487 0,015 0,3410 0,013 0,2660 0,016 Bảng 4.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa yếu tố nguồn nitơ hữu đến trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Nguồn Nitơ Số lần hữu l p lại Phân nhóm a b Urê 0,248667 Tukey Cao nấm men 0,266000 HSDa,b Peptone Casein c 0,341000 0,640667 Sig, 0,516 1,000 1,000 Sai số toàn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 0,000 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 b Alpha = 0,05 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ casein đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi nhiệt độ 300C, pH = 7.5, glucose 1% chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 5.1 PL: Kết hoạt độ Hàm Nồng độ OD1 OD2 ODĐ ODTB ΔOD C casein Hoạt lƣợng Hoạt độ Độ Tyrosin độ trung lệch e (U/ml) bình chuẩn (µmol) Casein 0,15% Casein 0,3% Casein 0,6% Casein 0,9% 0,377 0,44 0,447 0,958 0,944 0,974 0,639 0,622 0,603 0,574 0,586 0,593 0,364 0,45 0,421 0,965 0,952 0,979 0,611 0,629 0,621 0,609 0,623 0,597 0,174 0,181 0,176 0,128 0,139 0,125 0,158 0,173 0,164 0,167 0,162 0,159 0,371 0,445 0,434 0,962 0,948 0,977 0,625 0,626 0,612 0,592 0,605 0,595 0,197 0,264 0,258 0,834 0,809 0,852 0,467 0,453 0,448 0,425 0,443 0,436 0,119 0,148 0,145 0,389 0,379 0,397 0,234 0,228 0,226 0,216 0,223 0,221 (U/ml) 0,197 0,244 0,240 0,642 0,625 0,655 0,386 0,376 0,373 0,356 0,369 0,364 0,2270 0,026 0,6407 0,015 0,3783 0,007 0,3630 0,007 Bảng 5.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa yếu tố nồng độ Casein đến trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Nồng độ Casein Số lần Phân nhóm l p lại a b Casein 0,9% Tukey Casein 0,15% 0,36300 HSDa,b Casein 0,6% 0,37833 Casein 0,3% c 0,22700 0,64067 Sig, 1,000 0,649 1,000 Sai số toàn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 0,000 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 b Alpha = 0,05 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn nitơ vô nuôi cấy đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi nhiệt độ 300C, pH = 7,5, glucose 1%, casein 0.3% chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 6.1 PL: Kết hoạt độ Hàm Nguồn Nitơ vô OD1 OD2 ODĐ ODTB ΔOD C Hoạt lƣợng Hoạt độ Độ Tyrosin độ trung lệch e (U/ml) bình chuẩn (µmol) KNO3 NaNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 1,112 1,109 1,106 1,003 0,996 1,002 0,636 0,63 0,615 0,663 0,645 0,636 1,023 1,089 1,102 0,998 1,001 1,005 0,612 0,668 0,638 0,651 0,652 0,612 0,169 0,175 0,172 0,192 0,198 0,187 0,245 0,237 0,268 0,179 0,182 0,245 1,068 1,099 1,104 1,001 0,999 1,004 0,624 0,649 0,627 0,657 0,649 0,624 0,899 0,924 0,932 0,809 0,801 0,817 0,379 0,412 0,359 0,478 0,467 0,379 0,417 0,428 0,431 0,379 0,375 0,382 0,197 0,211 0,188 0,239 0,234 0,197 (U/ml) 1,375 1,411 1,422 0,625 0,619 0,630 0,324 0,347 0,310 0,394 0,385 0,324 1,4027 0,025 0,6247 0,006 0,327 0,019 0,3783 0,02 Bảng 6.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa nguồn Nitơ vơ đến trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Nguồn Số lần Nitơ vô l p lại NH4NO3 Tukey (NH4)2SO4 HSDa,b NaNO3 KNO3 Phân nhóm a b c d 0,32700 0,37833 0,62167 1,40267 Sig, 1,000 1,000 1,000 1,000 Sai số tồn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 0,000 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 b Alpha = 0,05 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme protease sau ngày nuôi nhiệt độ 300C, pH = 7.5, glucose 1%, casein 0.3%, KNO3 0.3% chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Bảng 7.1 PL: Kết hoạt độ Thời gian nuôi cấy ngày OD1 OD2 0,346 0,356 0,352 0,637 0,646 0,604 0,74 0,702 0,718 1,168 1,165 1,155 0,921 0,903 0,932 0,35 0,355 0,361 0,625 0,639 0,634 0,742 0,706 0,753 1,158 1,143 1,205 0,989 0,997 0,931 ODĐ C 0,199 0,184 0,177 0,205 0,19 0,207 0,196 0,196 0,201 0,228 0,169 0,198 0,193 0,183 0,188 ODTB 0,348 0,356 0,357 0,631 0,643 0,619 0,741 0,704 0,736 1,163 1,154 1,180 0,955 0,950 0,932 ΔOD 0,149 0,172 0,180 0,426 0,453 0,412 0,545 0,508 0,535 0,935 0,985 0,982 0,762 0,767 0,744 Hàm Hoạt lƣợng Hoạt độ Tyrosin độ trung e (U/ml) bình (µmol) (U/ml) 0,099 0,163 0,109 0,179 0,112 0,185 0,1757 0,216 0,357 0,228 0,376 0,211 0,347 0,36 0,267 0,440 0,251 0,415 0,262 0,433 0,4293 0,432 1,427 0,453 1,497 0,452 1,492 1,4713 0,359 1,184 0,361 1,191 0,351 1,159 1,178 Độ lệch chuẩn 0,011 0,014 0,012 0,04 0,017 ngày 0,936 0,923 0,915 0,971 0,901 0,924 0,245 0,242 0,231 0,9535 0,912 0,920 0,708 0,670 0,689 0,336 0,320 0,328 1,110 1,056 1,082 1,0827 0,0270 Bảng 7.2 PL: Phân tích thống kê để tìm khắc biệt có ý nghĩa thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M Thời gian Số lần nuôi cấy l p lại ngày Tukey HSDa,b ngày a 0,1756 b Phân nhóm c d b Alpha = 0,05 f 0,360 00 0,429 33 Sig, 1,000 1,000 1,000 Sai số tồn phƣơng trung bình (Mean Square Error) =0,001 a Kích thích mẫu trung bình = 3,000 e 1,082 67 1,1780 1,000 1,000 1,471 33 1,000 ... ? ?Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi nấm vùng ven biển Khánh Hòa? ?? Mục tiêu đề tài nhằm sàng lọc chủng vi nấm biển c khả sinh tổng hợp protease ngoại bào, phân lập từ nƣớc biển ven. .. TRANG VI? ??N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐINH THỊ ÚT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HỊA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Cơng nghệ sinh. .. chủng vi nấm biển Các chủng nấm mốc đƣợc hoạt h a môi trƣờng PDA Bảo quản chủng vi nấm Các chủng nấm men đƣợc hoạt h a môi trƣờng YPD Các chủng vi nấm biển đƣợc nuôi cấy MT để sinh tổng hợp protease