Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống aspergillus, trichoderma và ứng dụng

Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau này người ta đan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ HUỆ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT

SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ

ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU

TP.HCM, 2010 THƯ

VIỆN

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin

Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với polysaccharide như cellulose Chitin phân

bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài của tôm cua

và côn trùng Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, chứa các đơn

phân là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β-glucoside Chitin có nhiều công dụng trong

nhiều lĩnh vực như y học và công nghiệp…

Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme có tên gọi chung là chitinase Enzyme này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của chúng Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hóa lý (tỉ lệ giữa cơ chất

và enzyme, pH, nhiệt độ…) Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là nguồn quan trọng Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn

thuộc các chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus,

Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh

Những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm soát nấm kí sinh trên cây trồng…v.v…

Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như trên, mục đích đề tài chúng tôi nhằm nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước đầu khảo sát một số ứng dụng của enzyme này Chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh

tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và

ứng dụng

Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế

phẩm chitinase từ canh trường và bước đầu nghiên cứu một số ứng dụng của chitinase

Nhiệm vụ của đề tài

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một vài chủng nấm sợi thuộc giống

Aspergillus, Trichoderma Chọn chủng nấm sợi sinh tổng hợp chitinase cao để nghiên cứu tiếp

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi đã

chọn và tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm

- Thu nhận chế phẩm chitinase

- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân cơ chất

- Bước đầu thử nghiệm một số ứng dụng của chế phẩm chitinase từ nấm sợi

Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài

Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Khái quát về enzyme

1.1.1.1 Cấu trúc [1, 23]

Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các phản ứng sinh học

Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin liên kết nhau bởi liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu

cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác Ngoài ra có một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Fe đóng vai trò liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản ứng, liên kết giữa apoenzyme

và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử

1.1.1.2 Cơ chế hoạt động [16, 23]

Trung tâm hoạt động của enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất mà chúng xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khóa-ổ khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản phẩm trải qua

ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình không gian và mức độ bền vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm

Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phóng nguyên vẹn Sản phẩm (P) tạo thành

Sơ đồ cơ chế tác động enzyme:

1.1.1.3 Phân loại enzyme [16, 23]

Có nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tôi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc tác của enzyme Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại mới, trong đó enzyme được chia ra làm 6 lớp chính:

- Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hoàn nguyên sinh học)

- Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

- Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

- Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo con đường thủy phân)

- Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

- Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)

1.1.2 Enzyme chitinase [32]

1.1.2.1 Cấu trúc

Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase]

thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14

3 → Hydrolase

2 → Glycosylase

1 → Glycosidase

14 → Chitinase Chitinase còn có các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase,

β-poly-N-acetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC

(Streptomyces griceus)

Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20

 Họ Glycohydrolase 18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase

Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer [32]

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas

hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens…

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]

 Họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn

Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng

xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69]

 Họ Glycohydrolase 20

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi

khuẩn, Streptomyces và người

Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.1.2.2 Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11]

D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn

olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9),

Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8)

Chitin 1,4- - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các

dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ±

0,2)

N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho

sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine

Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine

Hình 1.3 Vị trí phân cắt enzyme chitinase [70]

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo

thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase ở Trichoderma [11]

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay

β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu

không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc)

Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm

cơ chất Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì không Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên

Endochitinase, chitobiosidase và β –N- acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất

là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu

từ vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn

chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng -N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm

-N-acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và -N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine

1.1.2.3 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase [11]

* Trọng lượng phân tử

Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa (kilodalton) Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến

120 kDa

* Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml)

* Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 63]

Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001)

trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là

những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và

chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ

Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum

tối ưu là 400C

* Ảnh hưởng của pH [32]

thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5- 8,0

chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu

Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0-8,5 (Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001) Chitinase của nấm hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0 Theo Bhushan và Hoondal

(1998), hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp BG-11 cao nhất ở pH = 8,5

1.1.2.4 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [11, 27]

Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật

Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella,

Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp

enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus,

Gliocladium, Calvatia và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus

Enzyme chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây

bệnh cho cây trồng Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.),

cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase

Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt có thể thu nhận được enzyme chitinase Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú

ăn sâu bọ

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác

1.1.3 Chitin (cơ chất của chitinase)

1.1.3.1 Lịch sử nghiên cứu chitin [56]

Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu loài nấm

Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu được sản phẩm và

đặt tên là chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc)

Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của chitin