Khảo sát khả năng sinh tổng hợp ENZYME CHITINASE của một số chủng nấm sợi thuộc giống ASPERGILLUS, TRICHODERMA và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - - Lê Thị Huệ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HP ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU Thành phố Hồ Chí Minh - 2010 DANH MỤC VIẾT TẮT CPE chế phẩm enzyme CT Canh trường DNS 3,5-dinitrosalicylic axit MT Môi trường OD Mật độ quang ∆OD Hiệu số mật độ quang mẫu thử thật thử khơng UI Đơn vị hoạt độ enzyme (tính theo đơn vị quốc tế) PTHQ Phương trình hồi qui TB Giá trị trung bình topt Nhiệt độ tối ưu pHopt pH tối ưu Luận văn thạc só Cao học K18 MỞ ĐẦU Vi sinh vật nhóm sinh vật có số lượng nhiều có khả chuyển hóa vật chất thiên nhiên mạnh Hiện người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hồn tồn theo qui mơ cơng nghiệp Nhiều enzyme khai thác từ vi sinh vật tập trung nghiên cứu có nhiều ứng dụng thời gian qua protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau người ta ý nhiều loại enzyme khác chitinase, enzyme thủy phân chitin Chitin polymer sinh học so sánh với polysaccharide cellulose, keratin Chitin phân bố rộng rãi dạng cấu trúc thành tế bào nấm xương ngồi tơm cua trùng Đây polymer có trọng lượng phân tử cao, khơng tan nước, chứa đơn phân N-acetyl-glucosamine liên kết liên kết 1,4-β Chitin có nhiều cơng dụng nhiều lĩnh vực y học công nghiệp… Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa phân giải chitin nghiên cứu nhiều năm gần Chitin bị phân giải hệ enzyme có tên gọi chung chitinase Enzyme sản xuất tổ chức sống tế bào để phục vụ nhu cầu chức sinh lý chúng Sự phân giải chitin tác động enzyme phụ thuộc vào yếu tố hóa lý (tỉ lệ chất enzyme, pH, nhiệt độ…) Trong nguồn thu nhận chitinase chitinase từ vi sinh vật nguồn quan trọng Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter Streptomyces, chủng nấm sợi thuộc chi Asperillus, Penicillium, Trichoderma, số động vật nguyên sinh Những năm gần có nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase tiềm ứng dụng to lớn enzyme nhiều lĩnh vực khác thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine N-acetyl glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng y học, việc kiểm sốt nấm kí sinh trồng…v.v… Vì ứng dụng rộng rãi chitinase trên, mục đích đề tài chúng tơi nhằm nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ số chủng nấm sợi bước đầu khảo sát số ứng dụng enzyme Chúng thực đề tài: Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng Luận văn thạc só Cao hoïc K18 Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường bước đầu nghiên cứu số ứng dụng chitinase Nhiệm vụ đề tài - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase vài chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Chọn chủng nấm sợi để nghiên cứu tiếp - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng trình sinh tổng hợp chitinase chủng nấm sợi chọn tối ưu hóa phương pháp qui hoạch thực nghiệm - Thu nhận chế phẩm chitinase - Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ chất, thời gian thủy phân chất - Bước đầu thử nghiệm ứng dụng nấm sợi sinh enzyme chitinase chế phẩm chitinase Thời gian địa điểm nghiên cứu đề tài Thời gian : từ tháng 8/2009 – 7/2010 Địa điểm : Đề tài thực Phịng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh Luận văn thạc só Cao học K18 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI 1.1.1 Khái quát enzyme 1.1.1.1 Cấu trúc [1, 23] Enzyme loại phân tử protein sinh vật tổng hợp nên tham gia xúc tác cho phản ứng sinh học Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, cấu tạo từ L-acid amin liên kết liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi trung tâm hoạt động enzyme Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme cấu tử gồm enzyme có thành phần hóa học protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm enzyme có hai thành phần: phần protein gọi apoenzyme có vai trị xúc tác, phần thứ hai phi protein coenzyme chất hữu đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình xúc tác Ngồi có số kim loại Zn, Cu, Mn, Fe đóng vai trị liên kết enzyme chất trình xúc tác phản ứng, liên kết apoenzyme coenzyme, tham gia trực tiếp vào trình vận chuyển điện tử 1.1.1.2 Cơ chế hoạt động [16, 23] Trung tâm hoạt động enzyme (E) có cấu trúc khơng gian tương ứng với chất mà chúng xúc tác, phản ứng hình thành trình enzyme tiếp xúc với chất “chìa khóa-ổ khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất Quá trình tác động enzyme vào chất để tạo sản phẩm trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với chất (S) nhờ liên kết tạo phức E-S Giai đoạn 2: Khi chất (S) tạo phức với enzyme (E), chất bị thay đổi cấu hình khơng gian mức độ bền vững liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, giải phóng nguyên vẹn Sản phẩm (P) tạo thành Sơ đồ chế tác động enzyme: E + S  E-S  E + P 1.1.1.3 Phân loại enzyme [16, 23] Có nhiều cách phân loại enzyme, đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc tác enzyme Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp Moscow đề bảng phân loại mới, enzyme chia làm lớp chính: - Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hồn ngun sinh học) Luận văn thạc só Cao học K18 - Transferase (lớp enzyme vận chuyển) - Hydrolase (lớp enzyme thủy phân) - Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo đường thủy phân) - Ligase hay Syntetase (lớp enzyme tổng hợp chất) - Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa) 1.1.2 Enzyme chitinase [32] 1.1.2.1 Cấu trúc Chitinase [Poly- Beta- 1- – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1,4 glucoside C1 C4 hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp chitin Mã số enzyme chitinase EC 3.2.1.14 → Hydrolase → Glycosylase → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase cịn có tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) chitodextrinase, β-poly-Nacetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus) Căn vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20  Họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn với khoảng 180 chi, tìm thấy hầu hết lồi thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, ngồi cịn có enzyme khác chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn trịn, chúng hoạt động thơng qua chế kiểm sốt mà đoạn β polymer bị phân cắt tạo sản phẩm β anomer [32] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 tổng hợp từ giống Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens… Luận văn thạc só Cao học K18 Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]  Họ Glycohydrolase 19 Họ gồm 130 chi, thường thấy chủ yếu thực vật, ngồi cịn có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với vịng xoắn hoạt động thơng qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 19 bao gồm chitinase thuộc nhóm I, II,IV Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [68]  Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces người Ngồi ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành nhóm: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng gắn kết enzyme chất chitin khơng cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II: đồng phân enzyme phân tử có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có thực vật, nấm, vi khuẩn Nhóm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I II Luận văn thạc só Cao học K18 Nhóm IV: đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41-47% trình tự amino acid tâm xúc tác chúng tương tự chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein kích thước phân tử nhỏ đáng kể so với chitinase nhóm I Nhóm V: dựa liệu trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) giảm nhiều lần q trình tiến hóa thực vật bậc cao 1.1.2.2 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase [11] Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- D-glucosaminidase (exochitinase) chitobiase Endochitinase enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn olygosaccharides, nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8) Chitin 1,4- - chitobiosidase enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm dimer chitobiose, cụ thể enzyme thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ± 0,2) N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) enzyme phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm monomer N-acetyl-D-glucosamine Chitobiase enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine Hình 1.3 Vị trí phân cắt enzyme chitinase [69] Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên nội mạch chitin chitooligomer, sản phẩm tạo thành hỗn hợp polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, chiếm đa số diacetylchitobiose (GlcNAc)2 hoạt tính endochitinase khơng thể phân cắt thêm Luận văn thạc só Cao học K18 Hình 1.4 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase Trichoderma [11] Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin chitooligomer mức trùng hợp lớn hay [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu khơng khử phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt chitooligomer hay chitin cách liên tục từ đầu không khử phóng thích đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) Ngồi ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm chất Các oligsaccharide thường thủy phân bên vài vị trí xác định cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả thủy phân trisaccharid, số khác khơng Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: phân cắt bên tạo disaccharid trisaccharid; phân cắt bên tạo monosaccharid tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất enzyme cắt ngẫu nhiên Endochitinase, chitobiosidase β –N- acetylhexosaminidase hoạt động chất dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer hoạt động chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin vách tế bào nấm chứa chitin chất thích hợp cho endochitinase chitobiosidase -N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 cao sợi chitin chất loại enzyme -N-acetylhexosaminidase hoạt động chậm việc làm giảm độ đục huyền phù chitin (GlcNAc)2 chất tốt -Nacetylhexosaminidase không chất endochitinase hay chitobiosidase Chính sử dụng để phân biệt hoạt tính endochitinase, chitobiosidase -N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau phân cắt N-acetyl glucosamine Luận văn thạc só Cao học K18 1.1.2.3 Các đặc tính hệ enzyme chitinase [11] * Trọng lượng phân tử Enzyme chitinase tìm thấy thực vật bậc cao tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa (kilodalton) Ở loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa cao khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử enzyme chitinase thu nhận từ nấm vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa * Điểm đẳng điện, số Michaelis Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 thực vật bậc cao tảo; pI từ 4,7-9,3 côn trùng, giáp xác, thân mềm cá; pI từ 3,5 – 8,8 vi sinh vật Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) * Ảnh hưởng nhiệt độ [32, 62] Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg Schnure, 1994; Huang cộng sự, 1996; Bhushan Hoondal, 1998; Wiwat cộng sự, 1999; Bendt cộng sự, 2001) Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase vi sinh vật hoạt động 400C, ngoại trừ chitinase Aspergillus niger hoạt động chất glycol chitin có nhiệt độ tối thích 50OC (Jeuniaux, 1963) Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có giá trị nhiệt độ tối thích khác Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập suối nước nóng cho thấy khả chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C Bendt cộng (2001) phát hoạt tính thủy phân chitin mạnh chitinase từ Vibrio sp Từ 30-450C chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp BG-11 hoạt tính cao 40-600C Lorito (1998) khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai nhận thấy enzyme có khả hoạt động khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ tối ưu 400C * Ảnh hưởng pH [32] Giá trị pH tối thích (pHop) hệ enzyme chitinase từ 4-9 enzyme chitinase thực vật bậc cao tảo; hệ enzyme chitinase động vật 4,8- 7,5 vi sinh vật 3,5- 8,0 Theo nhà khoa học, pHop enzyme chitinase có phụ thuộc vào chất sử dụng Đa số enzyme chitinase nghiên cứu có pHop khoảng 5,0 chất glucol chitin nằm khoảng pH kiềm yếu Luận văn thạc só Cao học K18 Bảng 3.12 Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau thủy phân chế phẩm chitinase Asp Awamori theo thời gian phản ứng Thời gian phản ứng Chủng ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) 10 0,036 10,473 20 0,073 21,533 30 0,118 34,746 40 0,148 43,554 50 0,164 48,252 60 0,170 49,818 70 0,169 49,721 80 0,169 49,525 90 0,168 49,427 (phút) Lượng Glucosamine (microg/ml) Aspergillus awamori 60 49.818 50 40 30 20 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian phản ứng (phút) Đồ thị 3.6 Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau thủy phân chế phẩm chitinase Asp awamori theo thời gian phản ứng  Nhận xét Từ kết khảo sát trên, nhận thấy giai đoạn đầu lượng glucosamine tạo tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng, thời gian 60 phút đạt đạt lượng glucosamine 49,818µg/ml Tuy nhiên từ khoảng thời gian 70 phút trở lên, lượng glucosamine tạo khơng tăng Luận văn thạc só Cao học K18 3.6 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU NHẬN TỪ ASPERGILLUS AWAMORI 3.6.1 Ứng dụng bước đầu phòng trừ sâu Chúng chọn hai loại sâu khác để thử nghiệm khả phân giải chitin chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori Loại sâu chọn gồm sâu gạo (tên khoa học Zoophobas mario) loại sâu dùng làm thức ăn cho chim cảnh thị trường; loại sâu thứ hai thử nghiệm sâu lạc tiên (còn gọi Chùm bao hay dây nhãn lồng Passiflora foetida) Mục đích sử dụng loại sâu nhằm bước đầu đánh giá tác động chitinase lên sâu hại, đối tượng có lớp vỏ chitin bao bọc Cho số lượng sâu 20 con/đĩa petri (đối với sâu 1) 10 con/đĩa petri (đối với sâu 2), đĩa đối chứng cho lượng nước cất tương đương lượng dung dịch chế phẩm sử dụng thí nghiệm (1ml/đĩa petri) Cho đĩa thí nghiệm 1ml dịch CPE chitiase nồng độ 1% 2% Theo dõi số lượng sâu chết qua mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút Thí nghiệm lặp lại lần, tính giá trị trung bình So sánh kết với mẫu đối chứng, đánh giá sơ khả diệt sâu CPE A B A-SÂU 1: Sâu gạo C B-SÂU 2: Sâu lạc tiên D C-Mẫu sâu làm thí nghiệm Luận văn thạc só D-Thí nghiệm đối chứng sâu Cao hoïc K18 E F E-Xử lý sâu với dung dịch CPE 1% G F-Xử lý sâu với dung dịch CPE 2% H G-Thí nghiệm sâu H-Thí nghiệm đối chứng sâu Hình 3.8 Thử nghiệm tác dụng CPE chitinase Asp Awamori sâu Bảng 3.13 Sự biến thiên hoạt độ dịch chiết enzyme chitinase thu nhận từ chủng Asp awamori theo thời gian phản ứng Loại sâu SÂU SÂU Nồng độ Thời gian tác động Tỉ lệ trung bình sâu chết CPE (%) (phút) (%) 0% 90 13,3 1% 90 78,3 2% 90 85,0 0% 90 5,4 1% 90 70,0 2% 90 93,3  Nhận xét Qua bảng số liệu trích dẫn 3.13, chúng tơi nhận thấy CPE chitinase thu nhận từ Aspergillus awamori thể khả tác động mạnh lên lớp vỏ chitin sâu hại, trùng Sau Luận văn thạc só Cao học K18 khoảng thời gian 90 phút, trung bình có khoảng 70% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm nồng độ 1% 85% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm 2%, cao nhiều so với tỉ lệ chết thí nghiệm đối chứng (khoảng 5-13%) từ mở hướng ứng dụng sâu CPE chitinase thu nhận từ nấm Aspergillus awamori sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 3.6.2 Ứng dụng bước đầu sản xuất glucosamine Chúng sử dụng hai loại nguyên liệu khác chitin dạng bột chitin huyền phù để thử nghiệm ứng dụng bước đầu chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori sản xuất glucosamine Điều kiện hoạt động chế phẩm điều kiện tối ưu thu từ kết nghiên cứu mục 3.5 (pH = 4, nhiệt độ ủ 500C, thời gian thủy phân 70 phút), nồng độ CPE 0,2%, bột chitin 1,6g/10ml (16%) nước cất, chitin huyền phù 1% Tỉ lệ dung dịch CPE nguyên liệu : Kết thu nhận thể bảng 3.13 Bảng 3.14 Hàm lượng glucosamine thu từ phản ứng thủy phân chitin CPE chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori Nguyên liệu Chitin dạng bột Chitin phù huyền ∆OD Lượng glucosamine Hiệu suất (µg/ml) 0,041 11,79 Thấp 0,123 35,55 Trung bình  Nhận xét Số liệu bảng 3.13 rằng, hiệu suất thủy phân chitin chitinase nồng độ CPE 2%, nhiệt độ phản ứng 500C thời gian phản ứng 70 phút cho hàm lượng glucosamin đạt 10,81µg/ml từ nguyên liệu chitin dạng bột 35,55 µg/ml sử dụng nguyên liệu chitin dạng huyền phù Hiệu suất thủy phân CPE thấp nguồn enzyme chitinase từ nấm sợi dễ thu nhận, chi phí thấp, đáng để nghiên cứu sử dụng Luận văn thạc só Cao hoïc K18 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong q trình làm thí nghiệm chúng tơi rút số kết luận sau: - Đã nghiên cứu điều kiện môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp chitinase ba chủng nấm sợi là: Aspergillus awamori: nhiệt độ thích hợp 350C; thời gian thu enzyme tốt 36-40 Aspergillus sp.: nhiệt độ thích hợp 400C; thời gian thu enzyme tốt 72 Trichoderma harzianum: nhiệt độ thích hợp nhất: 300C; thời gian thu enzyme tốt 60 - Chitin chất cảm ứng tốt để nuôi cấy nấm sợi nhằm thu nhận chitinase - Đã tiến hành qui hoạch thực nghiệm, phương trình hồi qui thu tương thích với thực nghiệm: ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Từ suy điều kiện tối ưu cho trình sinh tổng hợp chitinase chủng Aspergillus awamori thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ nuôi 320C, lượng chitin bổ sung thích hợp 16% - Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Aspergillus awamori nhiệt độ 500C, pH = 4,0 - Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ Aspergillus awamori diệt trừ sâu hại sản xuất glucosamine 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase số chủng nấm mốc khác - Tiếp tục nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi enzyme lĩnh vực sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Luận văn thạc só Cao hoïc K18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Cảnh, Quy hoạch thực nghiệm NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [3] Tạ Kim Chỉnh (1996), Tuyển chọn số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại Việt Nam khả ứng dụng Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học [4] Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm vi nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học NXB Giáo dục [6] Nguyễn Lân Dũng tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 2, tập 3) NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [7] Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [8] Bùi Xuân Đồng (1982), Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam (tập1) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [9] Bùi Xuân Đồng (1997), Vi nấm dùng công nghệ sinh học NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [10] Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius) Báo cáo tổng kết nghiệm thu, Sở khoa học công nghệ TP HCM, tr153-160 [11].Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trị kiểm sốt sinh học Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh [12] Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ loại đất khác thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh Luận văn thạc só Cao học K18 [13] Tơ Duy Khương (2004), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [14] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh (tập 2) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [15] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [16] Nguyễn Đức Lượng tác giả (2004), Công nghệ enzym NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [17] Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma reesei Aspergillus niger môi trường lên men bán rắn Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [18] Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục [19] Đặng Trung Thành (2008), Bước đầu nghiên cứu thu nhận enzym chitinase khoai lang (Ipomoea batatas) Khánh Hịa Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản – số 03/2008 [20] Đồng Thị Thanh Thu (2008), Sinh hóa ứng dụng NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [21] Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995) Kết nghiên cứu bước đầu nấm Trichoderma, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202- 210 [22] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục [23] Lê Ngọc Tú tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2) NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [24] Nguyễn Văn Tuân (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp Endo-β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo-β-1,4-Glucanase Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên [25] Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh [26] A Kapat, T Panda, S.K Rakshit (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions Bioprocess Engineering 14, p.275-279 [27] A A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40 No 5, p.445-447 Luaän văn thạc só Cao học K18 [28] Azaliza Safarida Wasli, madihah Md Salleh, Suraini Abd-Aziz, Osman Hassan and Nor Muhammad Mahadi (2009), Medium Optimization for Chitinase Production from Trichoderma virens using Central Composite Design Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol 14, No 6, p 781-787 [29] Brinda Mahadevan and Don L Crawford (1997), Properties of the chitinase of the antifugal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108 Enzyme and Microbial Technology 20, p.489-493 [30] Crispinus A Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride The Journal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61 [31] Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture Journal of Metals, Materials anh Minerals Vol 15 No 1, p.33-36 [32] Jennifer L Guthrie, Sagal Khalif, Alan J Castle (2005), An improved method for detection anh quantification of chitinase activities Canadian Journal of Microbiology Vol 51 Iss 6, p.491-495 [33] Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski (2007), Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons International Journal of Oceanography and Hydrobiology Vol XXXVI, No.3, p.101-111 [34] Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782 [35] N.N Nawani, B.P Kapadnis (2005), Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs Process Biochemistry 40, p.651-660 [36] Nopakarn Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and TakashiTachiki (2002), Ultilization of Shrimp Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State Cultivation of Aspergillus sp S1-13: Evaluation of a Culture Based on Chitinase Formation Which is Necessary for Chitin-Assimilation Journal of Bioscience and Bioengineering Vol 93, No 6, p 550-556 [37] P Arthur Felse, T Panda (1999), Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode Process Biochemistry 34, p.563-566 [38] Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V Deshpande (1999), chitinolitic enzymes an exploration [39] Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi and plants their in morphogenesis and host parasite interattion FEMS microbiol rev 11, p 317-338 Luaän văn thạc só Cao học K18 [40] S.M Akhir, S Abd-Aziz, M.M Salleh, R.A Rahman, R.M Ilias and M.A Hassan (2009), Medium Optimisation of Chitinase Enzyme Production from Shrimp Waste Using Bacillus licheniformis TH-1 by Responnse Surface Methods Biotechnology (1), p 120-1205 [41] Takuya Koseki, Shinji Furuse, Kimio Iwano, Hiroshi Sakai and Hiroshi Matsuzawa (1997), An Aspergillus awamori acetylesterase: purification of the enzym, and cloning and sequencing of the gene.Bio chem J 326, p.485-490 [42] Zofia Olempska-Beer (2008), Asparaginase from Aspergillus niger expressed in A Niger Chemical and Technical Assessment Internet [43] www.coe.drexel.edu/ /researchfocus.html [44] http://www.yduocngaynay.com/8-8TK_TrVHung_cua.htm [45] http://www.moit.gov.vn/vsi_portlets/UserFiles/File/Danhsachtuyenchon.doc [46] http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2001/clarke/introduction.html [47] http://www.vnn.vn/khoahoc/suckhoe/2005/01/370883/ [48] .http://www.fistenet.gov.vn [49] http://www.nutrifood.com.vn [50] http://www.vnexpress.net [51] http://www.webtretho.com/forum/register.php [52] http://Psre.usm.edu [53] http://www.meronbiopolymers.com [54] http://www.oligophar.ru [55] http://www.ozemail.com.au/zadco/trichoderma.htm [56] http://www.moi.gov.vn [57] http://www.Roorthing-biochem.com/default.htlm [58] http://hoahocvietnam.com.vn [59] http://vietnam.net [60] http://wdcm.nig.ac.jp/catalogue/ncim/document/Ncim_s_fungi.pdf [61] http://www.ecfg10.info/images/Asperfest7Program.pdf [62] http://www.igb.fraunhofer.de/www/gf/molbiotech/weissebiotech/en/Chitin.en.html [63] http://www.palaeos.com/Eukarya/Units/StemMetazoa/Microsporidia.html [64] http://www.moldbacteria.com/Aspergillus_niger.gif [65] http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/a/Aspergillus_niger_colony.htm Luaän văn thạc só Cao học K18 [66] http://www.mold.ph/trichoderma.htm [67] http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html#buffer [68] http://www.spices.res.in/spicebioinfo/project/chitinase/result.php [69] http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learningcenter/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html Luận văn thạc só Cao học K18 1.1 PHỤ LỤC 1.2 PHỤ LỤC - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE Bảng P.1 Đường chuẩn Glucosamine có nồng độ từ 0-70µg/ml Ống số 10 20 30 40 50 60 70 OD535nm 0,115 0,148 0,165 0,216 0,561 0,297 0,325 0,340 ∆OD 0,000 0,033 0,054 0,101 0,146 0,182 0,210 0,225 Nồng độ Glucosamine (µg/ml) 1.3 0.30 DeltaOD y = 0.0344x - 0.0359 R = 0.9873 0.20 0.10 0.00 1.4 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ Glucosamine (micromol/ml) Đồ THị P.1-ĐƯờNG CHUẩN GLUCOSAMINE BIểU DIễN MốI TƯƠNG QUAN GIữA ∆OD VÀ HÀM LƯợNG GLUCOSAMINE Luận văn thạc só Cao học K18 1.5 PHỤ LỤC - THU NHẬN CHITIN TỪ VỎ TƠM Khối lượng vỏ tơm ban đầu 100 gam, xay nhỏ tiến hành thu nhận chitin theo bước 2.4.5 Cân khối lượng chitin, xác định tỉ lệ chitin có vỏ tơm Bảng P.2- Khối lượng chitin thu từ vỏ tôm Số lần thí nghiệm Khối lượng chitin thu (g/100g nguyên liệu) 18,65 19,25 18,95 Trung bình 18,95 Hình P.2 Chitin từ vỏ tơm  Nhận xét kết Khối lượng chitin thu 18,95/100 g vỏ tơm, tỷ lệ thấp thực tế (khoảng 30%) kỹ thuật tách chiết hạn chế, có mát q trình lọc, rửa…; ngun liệu cịn lẫn tạp chất… Chitin vỏ tơm 18,95 %, khoảng 81 % thành phần lại chủ yếu khống protein Luận văn thạc só Cao học K18 PHỤ LỤC Hình P.3 - Huyền phù chitin ống thử thật ống thử khơng Hình P.3 - Hiện màu thuốc thử DNS ống nghiệm thử thật ống thử không enzyme chitinase từ chủng Aspergillus awamori Luận văn thạc só Cao học K18 PHỤ LỤC – PHA DUNG DỊCH ĐỆM [67] 4a Dung dịch đệm acetate( pH= 3,6-5,6) a Dung dịch acid acetic 0,2 M: 11,55 ml CH3COOH đặc, dẫn nước đến 1000ml b Dung dịch Natriacetate 0,2 M: 16,4g CH3COONa 27,2g CH3COONa.3H2O hòa tan dẫn nước đến 1000ml nước cất Giá trị pH dung dịch đệm phụ thuộc vào số ml dung dịch a số ml dung dịch (b) dẫn đến 100ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46,3 3,7 3,6 25,5 24,5 4,6 44 3,8 20 30 4,8 4b Dung dịch đệm Cacbonat (pH = 9,2- 10,7) a Dung dịch Natricacbonate 0,2M: 21,2 g Na2CO3 hòa tan dẫn nước cất đến 1000ml b Dung dịch Natrihydrocacbonat 0,2M: 16,8 g NaHCO3 hòa tan dẫn nước đến 1000 ml Dung dịch đệm cacbonat có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) dẫn nước đến 200ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46 9,2 27,5 22,5 10 7,5 42,5 9,3 30 20 10,1 9,5 40,5 9,4 33 17 10,2 13 37 9,5 35,5 14,5 10,3 16 34 9,6 38,5 11,5 10,4 19,5 30,5 9,7 40,5 9,5 10,5 22 28 9,8 42,5 7,5 10,6 25 25 9,9 45 10,7 Luận văn thạc só Cao học K18 PHỤ LỤC Bảng P.5 - KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE TRÊN SÂU SỐ LOẠI LƯỢNG SÂU SÂU TN (CON) SÂU SÂU Luaän văn thạc só 20 10 CON/TN NỒNG ĐỘ CPE (%) 0 0 1 1 2 2 0 0 1 1 2 2 THỜI GIAN (PHÚ T) 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 TN1 SL 3 12 16 17 18 10 14 18 20 20 0 7 9 10 10 % 10 15 15 25 40,0 60,0 80,0 85,0 90,0 50,0 70,0 90,0 100 100 0 10 20 40 30,0 60,0 70,0 70,0 90,0 60,0 70,0 90,0 100 100 TỈ LỆ SÂU CHẾT TN2 TN3 SL 2 4 12 15 16 16 12 14 17 20 20 0 4 6 10 10 10 10 % 10 10 20 20 35,0 60,0 75,0 80,0 80,0 60,0 70,0 85,0 100 100 0 30 40 40,0 60,0 60,0 80,0 100 70,0 80,0 100 100 100 SL 4 11 16 16 17 11 14 16 19 20 0 1 8 9 10 10 % 15 20 20 35 55 80 80 85 55 70 80 95 100 0 10 10 30 40 70 80 80 90 70 90 90 100 100 TB SL 0,0 1,7 2,7 3,7 4,3 7,3 11,7 15,7 16,3 17,0 11,0 14,0 17,0 19,7 20,0 0,0 0,0 0,7 2,0 3,7 3,7 6,3 7,0 7,7 9,3 6,7 8,0 9,3 10,0 10,0 % 8,3 13,3 18,3 21,7 36,7 58,3 78,3 81,7 85,0 55,0 70,0 85,0 98,3 100 0 6,7 20 36,7 36,7 63,3 70,0 76,7 93,3 66,7 80,0 93,3 100 100 Cao hoïc K18 ... chitinase từ số chủng nấm sợi bước đầu khảo sát số ứng dụng enzyme Chúng thực đề tài: Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng Luận... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI Chúng tiến hành khảo sát sơ (phương pháp định tính) khả tổng hợp chitinase số chủng nấm sợi gồm Trichoderma. .. chọn chủng nấm sợi có khả tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường bước đầu nghiên cứu số ứng dụng chitinase Nhiệm vụ đề tài - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase vài chủng